王倩倩，杜 鵑，陳 鳴，馮鳳琴,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310012；2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州 310012）

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和社會壓力的增大，大部分人都處于亞健康的狀態(tài)，因此越來越多人開始通過各種運(yùn)動方式來提升自己的身體機(jī)能。在正常情況下，合理的體育鍛煉有助于身體更好的發(fā)揮功能。但由于自身?xiàng)l件的不同以及運(yùn)動量的不合理，人們經(jīng)常會因?yàn)檫^度的運(yùn)動導(dǎo)致身體的不適，引起身體的疲勞，從而影響工作效率，甚至造成各種運(yùn)動性損傷，危及損害身體健康[1]。關(guān)于運(yùn)動性疲勞的機(jī)制有幾種學(xué)說，包括耗竭學(xué)說、阻塞學(xué)說、自由基學(xué)說、內(nèi)環(huán)境失調(diào)學(xué)說、保護(hù)性抑制學(xué)說和突變學(xué)說[2]。其中自由基學(xué)說認(rèn)為機(jī)體在高強(qiáng)度或長時間運(yùn)動時會產(chǎn)生過量的自由基，如羥基自由基和超氧陰離子自由基，過多的自由基會破壞體內(nèi)氧化和抗氧化平衡，引起肝臟和骨骼肌線粒體的脂質(zhì)過氧化損傷，最終導(dǎo)致疲勞[3]。因此保護(hù)機(jī)體不受氧化傷害是預(yù)防疲勞的有效方法[4?5]。外源性抗氧化物質(zhì)能與內(nèi)源性自由基相互作用，減少機(jī)體氧化損傷、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御能力、減少疲勞產(chǎn)生。近年來，營養(yǎng)干預(yù)特別是多肽類營養(yǎng)保健品受到越來越多研究者的關(guān)注，大量研究表明多肽在緩解疲勞方面是安全有效的[6?8]。與蛋白質(zhì)相比，多肽類補(bǔ)充劑能夠被機(jī)體更快更好地吸收，且能夠加快氨基酸、蛋白質(zhì)和葡萄糖的利用速率[9]。

小麥肽是小麥蛋白經(jīng)過酶解得到的結(jié)構(gòu)片段，其氨基酸含量均衡，具有多種功能活性，如抗氧化[10?11]、解酒[12]、免疫調(diào)節(jié)[13?14]、降血糖[15]、保護(hù)腸粘膜[16]、促進(jìn)胃粘膜修復(fù)[17]等。研究表明酶解產(chǎn)物的氨基酸組成可能與其生物活性有關(guān)[18]。小麥肽氨基酸組成中谷氨酸的含量最高，而谷氨酸中谷氨酰胺含量豐富[19]。谷氨酸對神經(jīng)系統(tǒng)具有積極的作用并且在運(yùn)動過程中是有用的[20]，谷氨酰胺是谷胱甘肽合成的重要底物，在機(jī)體的抗氧化體系中具有重要作用。運(yùn)動性疲勞的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激之間存在著很大的關(guān)系，已經(jīng)成為抗疲勞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但目前關(guān)于小麥肽的功能活性研究主要集中在小麥肽的體外抗氧化方面，而對體內(nèi)抗疲勞的研究較少。另外小麥肽作為一種新的食品原料來源尚未得到廣泛應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)以小麥肽為研究對象，利用H2O2誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞L929 氧化損傷，從細(xì)胞水平評價小麥肽的體外抗氧化活性，然后通過給予小鼠灌胃小麥肽30 d，測定小鼠力竭游泳時間和與疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)，探討小麥肽的抗疲勞作用，并探求體內(nèi)抗氧化活性和抗疲勞作用之間的相關(guān)性，從氧化應(yīng)激的角度來解釋小麥肽的抗疲勞機(jī)制，以期為小麥肽作為功能性食品基料提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠成纖維細(xì)胞L929 購買于中科院上海細(xì)胞庫，L929 細(xì)胞用RPMI1640 培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和1%雙抗，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%以上后，進(jìn)行傳代；SPF 級ICR雄性小鼠 64 只，體重約（20±2）g，實(shí)驗(yàn)動物許可證編號為SYXK（浙）2018-0012，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供和飼養(yǎng)，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水，保持環(huán)境溫度（25±2）℃，光照周期12 h:12 h 條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后使用；乳清蛋白粉 購于市場；胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰酶上海源培生物科技股份有限公司；乳酸（LA）、尿素氮（BUN）、肌糖原（MG）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；PB-10 pH 計(jì)、BSA224S 電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；752 型紫外-可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；Ultimate 3000 高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機(jī) 安徽中佳科學(xué)儀器有限公司；Infinite M200 Pro 酶標(biāo)儀 瑞士帝肯集團(tuán)公司；MCO-170AICUVDL-PC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；DM500 光學(xué)顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥肽的制備 參考趙源等的制備方法[21]，并做略微的改變。稱取一定量的谷朊粉，調(diào)節(jié)料液的pH 至8.0，添加0.4%蛋白酶，于50 ℃下酶解1.5 h后置于沸水浴中滅酶30 min，經(jīng)濃縮、噴霧干燥制得小麥肽，置于?20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小麥肽特性的測定

1.2.2.1 氨基酸組成 采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法[22]測定小麥肽的氨基酸組成。樣品溶解于6 mol/L HCl，然后于110 ℃水解24 h 后冷卻，取6 μL 水解液置于離心管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?0 μL 再干燥液，吹干后加入20 μL 衍生溶液混勻，室溫靜置20 min 后再次氮?dú)獯蹈桑尤?0 μL 流動相B，混勻后加入450 μL 流動相A，過膜上機(jī)。色譜條件：色譜柱為Welch AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 為0.1 mol/L 乙酸鈉溶液（含3%乙腈和0.1%三乙胺），流動相B 為80%乙腈；流速1.0 mL/min；柱溫38 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長254 nm。

1.2.2.2 相對分子質(zhì)量分布 采用凝膠過濾色譜測定小麥肽的相對分子質(zhì)量分布[23]。色譜條件：色譜柱為TSKgel G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸（體積比45:55:0.1）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長220 nm。

1.2.3 體外抗氧化活性的測定

1.2.3.1 細(xì)胞損傷模型的建立 選擇對數(shù)生長期的L929 細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個數(shù)為5×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔接種100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基；對照組加入不含H2O2的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的H2O2（40、80、120、160、200、250、300、350 μmol/L）。24 h后，用CCK-8 法檢測細(xì)胞存活情況，通過公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3.2 小麥肽對L929 細(xì)胞生長的影響 選擇對數(shù)生長期的L929 細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個數(shù)為5×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔接種100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基；對照組加入不含樣品的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的小麥肽（0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL）。24 h 后，用CCK-8 法檢測細(xì)胞存活情況，通過公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3.3 小麥肽對H2O2誘導(dǎo)L929 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 選擇對數(shù)生長期的L929 細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個數(shù)為5×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔接種100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的小麥肽（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）；正常對照組和H2O2損傷組加入不含樣品的培養(yǎng)基。培養(yǎng) 24 h 后棄去舊培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品組加入300 μmol/L的H2O2，正常組加入不含H2O2的完全培養(yǎng)基，作用24 h 后，用CCK-8 法檢測細(xì)胞存活情況，通過公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率[24]。

1.2.3.4 抗氧化指標(biāo)測定 選擇對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個數(shù)為5×104個/mL，接種于6 孔板中，每孔接種2 mL。培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行分組：正常對照組、H2O2模型組、不同濃度小麥肽組（0.4、0.6、0.8 mg/mL）。細(xì)胞經(jīng)過不同樣品和H2O2處理后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行各指標(biāo)的測定。分別用試劑盒提供的方法測定上清液中LDH 活力，細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH-Px 活力和MDA 含量。

1.2.4 抗疲勞實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 動物分組及給藥 雄性ICR 小鼠64 只，體重約（20±2）g，按照體重隨機(jī)分為4 組，分別為對照組（蒸餾水，同等劑量）、陽性組（乳清蛋白，2 mg/g/d）、小麥肽低劑量組（2 mg/g/d）、小麥肽高劑量組（8 mg/g/d），每組16 只，根據(jù)小鼠重量給予不同劑量的受試物，灌胃量按0.1 mL/10 g，每日1 次，連續(xù)30 d，灌胃期間自由取食和飲水。灌胃30 d 后，將每組的16 只小鼠隨機(jī)分為2 個亞組（每個亞組8 只小鼠），即A 組和B 組，A 組小鼠用于力竭游泳實(shí)驗(yàn)，B 組小鼠用于自由泳實(shí)驗(yàn)測定抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)。具體的動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of animals

1.2.4.2 力竭游泳實(shí)驗(yàn) 末次灌胃30 min 后，將每組中的A 組小鼠用肥皂水洗去其體表油脂，然后在小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛絲，放入水溫25 ℃、水深約30 cm 的游泳箱中游泳。游泳期間若有躬腰停止、懸浮休息者，用玻璃棒攪動附近水流迫使其不停運(yùn)動。用秒表記錄自游泳開始至小鼠頭部全部沉入水中7 s 不能浮出水面的時間，該時間作為小鼠的力竭游泳時間。

1.2.4.3 疲勞相關(guān)生化指標(biāo)測定 末次灌胃30 min后，將每個實(shí)驗(yàn)組中的B 組小鼠眼球取血，靜置15 min后，離心取上清液，?80 ℃保存?zhèn)溆?。然后將采血后的小鼠立即處死，取出肝臟和后腿肌肉，按照1:9 的比例加入相應(yīng)體積的生理鹽水，磨勻漿后得到10%的組織勻漿液，?80 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e用試劑盒提供的方法測定小鼠血清中LA 和BUN 含量、肌肉中MG 含量、肝臟中MDA 含量、SOD 和GSHPx 活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析比較組間差異，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)圖表用GraphPad Prism 8.0 軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥肽的氨基酸組成和相對分子質(zhì)量分布

肽的生物活性與其氨基酸組成相關(guān)。由表2 可知，小麥肽含有18 種氨基酸，總量為76.66%，表明小麥肽含有豐富的氨基酸組成。其中谷氨酰胺和脯氨酸是最主要的氨基酸，含量分別為22.91%和9.92%。谷氨酰胺是一種重要的具有特殊營養(yǎng)作用的條件性必需氨基酸及腸道必需氨基酸，它在保護(hù)細(xì)胞膜的完整性、維持細(xì)胞活力及降低細(xì)胞氧化損傷方面具有積極的作用[25]。半胱氨酸含有可電離的硫醇基團(tuán)，能夠清除自由基并結(jié)合金屬離子[26]；組氨酸結(jié)構(gòu)上含有咪唑環(huán)，可以與金屬離子和活性氧結(jié)合[27]；甲硫氨酸含有硫醚基團(tuán)，對特定氧化劑有反應(yīng)[28]；酪氨酸含有酚羥基，通過提供氫原子來清除活性氧[29]。因此，以上4 種氨基酸被普遍認(rèn)為具有抗氧化活性[30]。另外，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這類支鏈氨基酸不僅可以明顯改善運(yùn)動能力，延緩運(yùn)動過程中肌肉蛋白質(zhì)的分解代謝，而且還能減少運(yùn)動后乳酸的積累，從而延緩血乳酸引起的疲勞。由表2 可知，小麥肽中具有抗氧化活性的半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸這4 種氨基酸含量為6.31%。同時，小麥肽中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸這3 種支鏈氨基酸的含量較高為13.22%。因此，小麥肽富含抗氧化與抗疲勞活性的氨基酸，推測其可能具有一定的抗氧化與抗疲勞的潛能。除了氨基酸組成，肽的生物活性也取決于其相對分子質(zhì)量的分布，分子量小于3000 Da 的肽被認(rèn)為比分子量大于3000 Da 的肽具有更好的抗氧化活性，這種較好的活性可能是由于分子量小的肽段具有高活性、易吸收和低毒性[31]。由圖1 和表3 可知，小麥肽相對分子質(zhì)量小于3000 Da 的部分占70.56%，推測其具有一定的抗氧化效果。

圖1 小麥肽的相對分子質(zhì)量分布Fig.1 Relative molecular weight distribution of wheat peptides

表3 小麥肽的相對分子質(zhì)量分布Table 3 Relative molecular weight distribution of wheat peptides

2.2 小麥肽的體外抗氧化性

2.2.1 小麥肽對H2O2誘導(dǎo)L929 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 通過H2O2處理小鼠成纖維細(xì)胞L929 制備氧化應(yīng)激損傷模型，來探討小麥肽的體外抗氧化活性。如圖2A 所示，與對照組相比，當(dāng)H2O2濃度為300 μmol/L 作用24 h 時，細(xì)胞存活率為52.39%，因此選擇該濃度的H2O2進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。如圖2B所示，與對照組相比，濃度在0.2～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)的小麥肽對L929 細(xì)胞均具有增殖作用，濃度為0.4 mg/mL 時對細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)，且差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)濃度大于0.8 mg/mL 時，小麥肽對L929 細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。因此選擇濃度為0.2～0.8 mg/mL 的小麥肽進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。小麥肽對L929 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用結(jié)果如圖2C 所示。與模型組相比，在H2O2損傷前24 h 加入0.2～0.8 mg/mL 的小麥肽均能提高L929 細(xì)胞的存活率，且隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率隨之增加。當(dāng)小麥肽濃度為0.6 mg/mL 時，對L929 細(xì)胞的保護(hù)作用最顯著（P<0.01），此時細(xì)胞存活率比模型組提高了45.62%。綜合兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，小麥肽濃度為0.4～0.8 mg/mL 時對H2O2誘導(dǎo)L929 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用較顯著（P<0.01）。

圖2 小麥肽對L929 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effect of wheat peptides against H2O2 induced oxidative damage in L929 cells

2.2.2 小麥肽對H2O2誘導(dǎo)L929 細(xì)胞損傷的抗氧化水平的影響 正常細(xì)胞經(jīng)由H2O2處理后，細(xì)胞膜被破壞從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的LDH 釋放。因此，上清液LDH 活力的高低可反映出細(xì)胞的損傷程度。由圖3A可知，L929 細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活力極顯著升高了53.10%（P<0.01），說明模型建立成功。與模型組相比，小麥肽濃度為0.4、0.6和0.8 mg/mL 時LDH 的活力分別減少了7.20%、20.79%和19.67%，且濃度在0.6 和0.8 mg/mL 時差異達(dá)到顯著（P<0.05）。SOD 和GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶，SOD 催化活性氧分解生成H2O2和O2，GSH-Px 催化H2O2分解生成H2O 和O2，它們能直接反應(yīng)機(jī)體的抗氧化水平。而MDA 是自由基引起脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，可間接顯示機(jī)體清除氧化產(chǎn)物能力和抗氧化活性[32]。由圖3B 和圖3C可知，與模型組相比，小麥肽濃度為0.4、0.6 和0.8 mg/mL 時SOD 活力提高了23.55%、83.21%和95.91%，且在濃度為0.6 和0.8 mg/mL 時差異達(dá)到顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）；同時GSH-Px 活力提高了11.38%、28.69%和32.14%，但差異均不顯著（P>0.05）。由圖3D 可知，3 個濃度的小麥肽使得細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量降低了10.52%、25.91%和26.99%，且在濃度為0.6 和0.8 mg/mL 時差異達(dá)到顯著（P<0.05）。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，小麥肽可以通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD 和GSH-Px 活力，降低LDH 活力和MDA 含量，在機(jī)體中發(fā)揮抗氧化作用。這與張羽等發(fā)現(xiàn)的麥胚清蛋白肽可抑制由H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的氧化應(yīng)激狀態(tài)來發(fā)揮抗氧化作用的研究結(jié)果相一致[33]。

圖3 小麥肽對L929 細(xì)胞氧化損傷LDH、SOD、GSH-Px 和MDA 水平的影響Fig.3 Effects of wheat peptides against H2O2 induced oxidative damage in L929 cells on the SOD, GSH-Px, MDA and LDH

2.3 抗疲勞

2.3.1 體重變化 由表4 可知，在實(shí)驗(yàn)期間，各樣品組與對照組小鼠的體重均有所增加，但體重變化無顯著性差異。灌胃期間，小鼠無不良反應(yīng)，體質(zhì)量增加正常，精神狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)異?；蛘咚劳霈F(xiàn)象，表明灌胃小麥肽并不會影響小鼠的正常生長，對小鼠無毒副作用。

表4 小麥肽對小鼠體重的影響Table 4 Effect of wheat peptides on body weight in mice

2.3.2 小麥肽對小鼠力竭游泳時間和抗疲勞指標(biāo)的影響 力竭游泳時間是評價抗疲勞能力的一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，它能夠很好地評價小鼠的疲勞耐受能力，再現(xiàn)性較高[34]。由圖4A 可知，小麥肽低劑量組、高劑量組和乳清蛋白組小鼠的力竭游泳時間較對照組均有極顯著差異（P<0.01），分別延長了72.93%、91.73%和64.66%。Zheng 等[14]人的研究結(jié)果同樣也證明了補(bǔ)充小麥肽可以有效提高小鼠運(yùn)動耐力。另外，隨著小麥肽劑量的增加，其力竭游泳時間也隨著延長，表明在一定范圍內(nèi)，小鼠力竭游泳時間呈劑量依賴性。

長時間的劇烈運(yùn)動會增加肌肉的氧氣消耗，導(dǎo)致機(jī)體相對缺氧，此時肌肉中的糖原會被分解產(chǎn)生乳酸，為機(jī)體提供能量。但大量的乳酸的產(chǎn)生則會影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡，引起肌肉酸痛，導(dǎo)致肌肉運(yùn)動能力的下降。同時為了滿足能量需求，蛋白質(zhì)的代謝顯著增加，使肝臟中的尿素水平明顯增加，過量的尿素會在體內(nèi)積累并對機(jī)體造成危害。BUN 的含量在一定程度上可以反映機(jī)體的疲勞程度[35?36]。糖原是體內(nèi)儲存能量的主要形式之一，能夠與糖在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用，肌糖原通過無氧酵解的途徑直接將能量供給肌肉組織[37]。由圖4B 和4C 可知，與對照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的LA 含量極顯著降低了24.65%（P<0.01）、25.16%（P<0.01），同時BUN 含量較對照組也極顯著和顯著降低了19.74%（P<0.01）、17.78%（P<0.05）。由圖4D可知，小麥肽低劑量和高劑量組MG 含量比對照組極顯著提高了48.63%（P<0.01）、56.85%（P<0.01）。相似地，Liu 等的研究通過證明核桃小分子肽降低LA 和BUN 含量，并提高M(jìn)G 含量，從而緩解機(jī)體的疲勞狀態(tài)[8]。綜合以上結(jié)果表明，小麥肽能夠通過增強(qiáng)小鼠的耐力，減少代謝產(chǎn)物的堆積和體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝，減少運(yùn)動引起的肌糖原消耗來發(fā)揮抗疲勞作用。

圖4 小麥肽對小鼠力竭游泳時間、乳酸、尿素氮和肌糖原水平的影響Fig.4 Effect of wheat peptides on the exhaustive swimming time, LA, BUN and MG

2.3.3 小麥肽對小鼠肝臟抗氧化水平的影響 以往的研究表明，劇烈運(yùn)動過程中消耗大量的能量，會使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去平衡，產(chǎn)生過多的活性氧，如羥基自由基和超氧陰離子自由基，這些自由基極易引起骨骼肌與肝臟線粒體的脂質(zhì)過氧化損傷，從而削弱抗氧化能力。在劇烈運(yùn)動中，人體對氧氣的需求會增加，骨骼肌的血流量也會改變。這些變化導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生和肌肉穩(wěn)態(tài)的紊亂，導(dǎo)致骨骼肌的氧化損傷，隨后的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致肌肉疲勞[38]。因此，清除活性氧可能是緩解肌肉疲勞的主要機(jī)制之一。由圖5A 和5B 可知，與對照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的SOD 活力極顯著提高了20.54%（P<0.01）、25.19%（P<0.01），同時GSH-Px 活力較對照組也極顯著提高了29.79%（P<0.01）、35.77%（P<0.01）；由圖5C 可知，與對照組相比，小麥肽低劑量和高劑量組均使得小鼠肝臟中的MDA 含量極顯著降低了23.08%（P<0.01）、21.46%（P<0.01）。與本文的研究結(jié)果相似，Li 等[39]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給與小鼠灌胃人參小分子肽后，疲勞小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)得到抑制，從而緩解了機(jī)體的疲勞狀態(tài)。結(jié)果表明，小麥肽能夠提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活力，清除因運(yùn)動而產(chǎn)生的自由基，緩解疲勞，具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化能力。

圖5 小麥肽對小鼠SOD、GSH-Px 和MDA 水平的影響Fig.5 Effect of wheat peptides on the SOD, GSH-Px and MDA

2.3.4 體內(nèi)抗氧化和抗疲勞的相關(guān)性分析 本文將體內(nèi)抗氧化指標(biāo)和抗疲勞指標(biāo)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析[40]，得到結(jié)果如表5 所示。從表中可以看到，各個處理組的SOD 活力與小鼠力竭游泳時間、MG 含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；GSH-Px 活力與小鼠力竭游泳時間、MG 含量分別呈極顯著（P<0.01）和顯著正相關(guān)（P<0.05）；SOD、GSH-Px 活力與LA 含量、BUN 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；MDA含量與小鼠力竭游泳時間呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與LA 含量、BUN 含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。結(jié)果表明，小麥肽的抗疲勞活性與其抗氧化活性高度相關(guān)。

表5 體內(nèi)抗氧化活性與緩解疲勞作用的Pearson 相關(guān)系數(shù)Table 5 Pearson correlation analysis between antioxidant activity and anti-fatigue activities in vivo

3 結(jié)論

本研究通過H2O2處理小鼠成纖維細(xì)胞L929制備氧化應(yīng)激損傷模型，從細(xì)胞水平評價小麥肽的體外抗氧化活性，然后通過給予小鼠灌胃小麥肽30 d，測定小鼠力竭游泳時間和與疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)，探討小麥肽的抗疲勞作用，并探求體內(nèi)抗氧化活性和抗疲勞作用之間的相關(guān)性。體外抗氧化結(jié)果表明，H2O2損傷導(dǎo)致L929 細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞上清液中LDH 漏出量增多，且能夠造成細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性降低及細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 增加。但當(dāng)提前加入小麥肽對樣品進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，可通過提高細(xì)胞內(nèi)SOD 和GSH-Px 活性、減少M(fèi)DA 含量，發(fā)揮其抗氧化作用。體內(nèi)抗疲勞結(jié)果表明小麥肽通過延長小鼠力竭游泳時間，降低運(yùn)動后LA 及BUN 的水平，增加MG 的含量，提高內(nèi)源性抗氧化酶體系的活力，減緩疲勞的發(fā)生。通過體內(nèi)抗氧化和抗疲勞相關(guān)性分析可知，抗氧化活性與抗疲勞能力高度正相關(guān)，因此后續(xù)可進(jìn)行與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號通路進(jìn)行驗(yàn)證。