任世達，方曉敏，羅雁非，賈 睿，劉倩男，蔡 丹,*

（1.吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春 130118；3.長春海關技術中心，吉林長春 130062）

玉米花絲（Zea maysL.）又稱玉蜀黍花、玉米須，是玉米雌穗花柱和柱頭的統(tǒng)稱。玉米花絲中富含多糖、多酚、有機酸和生物堿等成分[1]，具有促進腸胃蠕動[2]、抗氧化[3]、增強免疫力[4]、抗疲勞[5]、降血糖[6]、抗癌抑瘤[7?8]和抑菌[9]等生理活性。玉米花絲多酚是玉米花絲重要活性成分之一，研究人員從中分離出了兒茶素、表兒茶素、原花青素等多種物質[10?11]，具有抗氧化、降血壓[12?13]、保護神經(jīng)[14]等功能活性。

近年來，國內外學者對玉米花絲多酚主要開展了分離提取及抗氧化活性評價等研究。多酚常見的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法[15]、超臨界CO2萃取法[16]、酶解提取法[17]和亞臨界水萃取法[18]等，其中超聲波以其高效簡便、綠色安全等優(yōu)點而被廣泛應用[19?20]。李靜等[21]、侯敏娜等[22]開展了超聲波輔助提取玉米須多酚的工藝研究，但玉米花絲品種不明確，對于玉米花絲多酚的抑菌活性研究鮮有報道。

本文首次以甜糯玉米品種墾糯1 號玉米花絲為主要原料，考察超聲波頻率、超聲波功率、超聲波溫度和超聲波時間各因素對玉米花絲多酚提取量的影響，采用響應面法優(yōu)化提取工藝，并初步探討玉米花絲多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，為進一步深入研究品種對玉米花絲成分構成的影響奠定研究基礎，同時為糯性玉米品種花絲資源的高附加值利用提供必要的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米花絲 墾糯1 號 實驗室提供；大腸桿菌（E.coliATCC8739），金黃色葡萄球菌（S.aureusATCC12600） 實驗室提供；沒食子酸（分析純（98.5%）、福林酚（分析純98%）、無水碳酸鈉（分析純99.8%）、無水乙醇（分析純99%） 上海源葉生物科技有限公司。

101A-1ET 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海試驗儀器廠有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Allegra X-30R 高速離心機 美國Beckman 公司；KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；JK-3200B 型超聲波清洗器 合肥金尼克機械制造有限公司；FLUO star Omega 型全自動酶標儀 德國 BMG 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚提取工藝 將玉米花絲清洗干凈，烘干至恒重，粉碎過100 目篩。稱取1.0 g 玉米花絲粉，在一定液料比、乙醇濃度、超聲波頻率、超聲波功率、超聲波溫度和超聲波時間的條件下，提取3 次，離心過濾后取上清液旋轉蒸發(fā)濃縮樣品，蒸餾水定容至50 mL，待測。

1.2.2 多酚含量的測定

1.2.2.1 沒食子酸標準曲線的制作 制備1 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 定容至10 mL，得到質量濃度為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL 的標準溶液，吸取上述標準溶液各 50 μL，依次加入 200 μL 雙蒸水和250 μL 福林酚工作液，室溫下避光靜置 5 min 后加入 250 μL 10% 無水碳酸鈉溶液，再置于室溫下避光反應 1 h，隨后測定其在波長 765 nm 處的吸光度值。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。得到線性回歸方程y=0.0056x+0.0756，其中R2= 0.9995。

1.2.2.2 玉米花絲多酚含量的測定 按照1.2.1 中的方法提取玉米花絲多酚，含量測定方法同標準曲線。計算公式如下：

式中，C—玉米花絲多酚的質量濃度，mg/mL；V—提取液體積，mL；N—稀釋倍數(shù)；M—玉米花絲粉質量，g。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 液料比對玉米花絲多酚提取量的影響 在乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃，超聲波時間40 min 條件下，考察液料比為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 時對玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度對玉米花絲多酚提取量的影響在液料比30:1，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃，超聲波時間40 min 條件下，考察乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%時對玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.3 超聲波頻率對玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃，超聲波時間40 min 條件下，考察超聲波頻率為30、35、40、45、50 kHz 時對玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.4 超聲波功率對玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波溫度60 ℃，超聲波時間40 min 條件下，考察超聲波功率為100、200、300、400、500 W 時對玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.5 超聲波溫度對玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波時間40 min 條件下，考察超聲波溫度為40、50、60、70、80 ℃時對玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.3.6 超聲波時間對玉米花絲多酚提取量的影響

在液料比30:1，乙醇濃度60%，超聲波頻率40 kHz，超聲波功率300 W，超聲波溫度60 ℃條件下，考察超聲波時間20、30、40、50、60 min 時對玉米花絲多酚提取量的影響。

1.2.4 響應面實驗 利用Design Expert 10，在單因素實驗基礎上，選定A 超聲波頻率、B 超聲波功率、C 超聲波溫度、D 超聲波時間，進行4 因素3 水平響應面試驗。因素及水平見表1。

表1 響應面分析試驗因素和水平Table 1 Levels and factors of response surface methodology

1.2.5 玉米花絲多酚抑菌活性測定

1.2.5.1 最小抑菌濃度的測定 采用二倍梯度稀釋法[23]，并稍加修改。取分別稀釋至106CFU/mL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液，加入到無菌的96 孔板中，梯度稀釋使得大腸桿菌每孔的多酚抑菌液終濃度為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL，金黃色葡萄球菌每孔的多酚抑菌液終濃度為8、4、2、1、0.5 mg/mL，將96 孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察到無明顯沉淀為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.2.5.2 抑菌生長曲線的測定 參考盧彩會[24]的方法，并稍加修改。分別取稀釋至106CFU/mL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液，將不同質量濃度的玉米花絲多酚溶液（終濃度分別為0、1、2、4 MIC）加入試管中，在最適溫度下振蕩培養(yǎng)24 h，每隔1 h 測定菌液在600 nm 處的吸光度值，繪制生長曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Origin2017 和Design Expert.10 進行數(shù)據(jù)的處理和繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 液料比對玉米花絲多酚提取量的影響 圖1為液料比對玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出隨著液料比的增大，使得玉米花絲與提取劑的接觸面積增大，多酚類物質能更加充分的從物料中溶出，因此玉米花絲多酚的提取量也逐漸增大，且當液料比為30:1 時，多酚提取量達到最大；但當提取劑與玉米花絲的比例繼續(xù)增加，多酚提取量反而稍有降低，這是由于當液料比為30:1 時，玉米花絲中的多酚成分已基本溶出，因此即使繼續(xù)增加液料比，也不會提高多酚的提取量，而因為溶劑的增多，致使玉米花絲中其它醇溶性成分的溶出，阻礙了多酚成分的溶出[25]。

圖1 液料比對玉米花絲多酚提取量的影響Fig.1 The effect of liquid-solid ratio on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.2 乙醇濃度對玉米花絲多酚提取量的影響 圖2為乙醇濃度對玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出在乙醇濃度達到60%之前，隨著乙醇濃度的增加，玉米花絲多酚的提取量持續(xù)增大，且當乙醇濃度為60%時，多酚提取量最高，此時為13.13 mg/g，但隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，玉米花絲多酚提取量不再繼續(xù)增加，這是因為當乙醇濃度過高時，會導致極性降低，因此會抑制多酚類物質從玉米花絲中提出，且乙醇濃度越高，成本越高[26]。因此最終確定乙醇提取劑的濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對玉米花絲多酚提取量的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.3 超聲波頻率對玉米花絲多酚提取量的影響圖3 為超聲波頻率對玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出隨著超聲波頻率的增大，玉米花絲多酚提取量也隨之增大，且當超聲波頻率為40 kHz時，多酚提取量達到最大，但當超聲波頻率大于40 kHz時，玉米花絲多酚的提取量卻逐漸降低。這是因為超聲波頻率產生的空化作用，擊碎效應等隨著超聲波頻率的增加而強度增大，使得細胞壁破碎速度加快，玉米花絲細胞分子內部間隙增大，增加了多酚的溶出速率，但隨著超聲波頻率的繼續(xù)增大，多酚物質的結構遭到破壞，反而降低了提取量[27]。

圖3 超聲波頻率對玉米花絲多酚提取量的影響Fig.3 The effect of ultrasonic frequency on extraction amount of corn silk polyphenols.

2.1.4 超聲波功率對玉米花絲多酚提取量的影響圖4 為超聲波功率對玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出在超聲波功率達到300 W 之前，隨著超聲波功率的增大，玉米花絲多酚提取量也隨之增加，并且當功率為300 W 時，玉米花絲多酚的提取量最大，此時為13.15 mg/g。這是因為隨著超聲波功率的增強，超聲所產生的空化效應增強，有效促進了溶劑向花絲細胞內部的擴散，使得細胞內的多酚成分可以充分溶出[28]，并在超聲波功率為300 W 時，玉米花絲多酚具有最高的提取量，但隨著超聲波功率的繼續(xù)升高時，過強的空化效應反而會破壞多酚物質的結構，導致提取量的稍有降低。

圖4 超聲波功率對玉米花絲多酚提取量的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.5 超聲波溫度對玉米花絲多酚提取量的影響圖5 為超聲波溫度對玉米花絲多酚提取量的影響。從圖中可以看出在溫度達到60 ℃之前，超聲波溫度的升高可以有效促進多酚的溶出，當超聲波溫度為60 ℃時，多酚提取量最高，為13.10 mg/g，但隨著超聲波溫度繼續(xù)升高時，玉米花絲多酚的提取量卻有所降低。這是由于超聲場強工作時會產生一定的熱效應，加之過高的提取溫度，會造成局部高溫，導致多酚的分解[29]，致使玉米花絲多酚提取量有所降低。

圖5 超聲波溫度對玉米花絲多酚提取量的影響Fig.5 The effect of ultrasonic temperature on extraction amount of corn silk polyphenols

2.1.6 超聲波時間對玉米花絲多酚提取量的影響圖6 為超聲波時間對玉米花多酚提取量的影響。從圖中可以看出隨著超聲波處理時間的延長，且當處理時間少于40 min，多酚提取量與超聲波處理時間呈正相關，當超聲波時間為40 min 時，多酚具有最高的提取量。這是因為使用超聲波處理花絲的時間越長，使得花絲可以與提取劑更加充分的接觸，并伴隨超聲波產生的機械效應，使得玉米花絲多酚可以有效地從花絲中釋放出來，因此在提取時間為40 min 時，多酚提取量最大為13.20 mg/g，但同樣由于過長的處理時間，會伴隨著其它因素的影響，對多酚結構具有一定的破壞作用[30]，因此提取量有所降低。

圖6 超聲波時間對玉米花絲多酚提取量的影響Fig.6 The effect of ultrasonic time on extraction amount of corn silk polyphenols

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果分析

以玉米花絲多酚提取率為響應值，選定A 超聲波頻率、B 超聲波功率、C 超聲波溫度、D 超聲波時間，進行4 因素3 水平響應面試驗，響應面設計及結果見表2。

表2 試驗設計及結果Table 2 Design and experimental results

2.2.1 模型建立與顯著性分析 由Design Expert.10軟件分析得到響應面回歸擬合方程如下：多酚提取量（mg/g）=13.36+1.26A+0.28B+0.19C+0.46D?0.088AB?0.19AC?0.18AD+0.075BC?0.18BD?0.12CD?1.20A2?0.54B2?0.52C2?0.75D2

方差分析如表3 所示。從表中可以看出，模型F值為130.85，P值小于0.0001，模型擬合度較高，說明模型可以很好地反應各因素對響應值的影響；失擬項P值為0.8299，大于0.05，表明非試驗因素對試驗結果影響較?。荒Ｐ偷南嚓P系數(shù)R2=0.9924，R2adj=0.9848 和R2pre=0.9705 的差值小于0.2，再次說明模型的合理性，變異系數(shù)CV=1.14%，精密度38.642，表明模型可靠。各因素對玉米花絲多酚提取量的影響極顯著，其中交互項其中交互項AC、AD、BD 對提取量影響顯著（0.01D>B>C，即超聲波頻率影響最大，依次為超聲波時間、超聲波功率和超聲波溫度。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis.

如圖7 所示為利用回歸模型得到的對玉米花絲多酚提取量影響顯著的AC、AD、BD 的響應面圖和等高線圖，從圖中可以看出各因素交互作用均為開口向下的平滑曲面，其中超聲頻率和超聲溫度，超聲頻率和超聲時間，超聲功率和超聲時間三組交互響應面彎曲程度較大，說明這三組交互因素對玉米花絲多酚提取量的影響顯著，這也與方差分析結果一致。

圖7 各因素交互作用對玉米花絲多酚提取量影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the interaction of various factors on the extraction amount of corn silk polyphenols

2.2.2 試驗驗證 由模型分析結果，預測玉米花絲多酚最佳提取工藝為超聲波頻率42.465 kHz，超聲波功率350.1 W，超聲波溫度56.17 ℃，超聲波時間45.37 min，此時玉米花絲多酚提取量為13.502 mg/g。根據(jù)實際情況，調整提取條件為：超聲波頻率40 kHz，超聲波功率350 W，超聲波溫度56 ℃，超聲波時間45 min，得到玉米花絲多酚提取量為（13.31±0.12） mg/g，與預測結果相近，說明模型擬合效果良好。

2.3 玉米花絲多酚抑菌活性結果分析

2.3.1 最小抑菌濃度的測定 表4 為玉米花絲多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。從中可以看出，玉米花絲多酚對大腸桿菌的MIC 為2.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC 為2 mg/mL，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的代表菌種，表明玉米花絲多酚對革蘭氏陽性菌具有更強的抑制活性。

表4 玉米花絲多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Table 4 minimum inhibitory concentration of corn silk polyphenols against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.3.2 玉米花絲多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長曲線的影響 圖8 為不同濃度玉米花絲多酚對兩種供試菌生長曲線的影響。圖（A）為不同濃度玉米花絲多酚對大腸桿菌生長曲線的影響，從圖中可以看出，與對照組相比，1 MIC 玉米花絲多酚處理的大腸桿菌出現(xiàn)生長遲滯現(xiàn)象，將大腸桿菌進入對數(shù)生長期的時間從5 h 延長至7 h；2 MIC 的玉米花絲多酚處理的大腸桿菌則未出現(xiàn)典型的生長周期現(xiàn)象。圖（B）為不同濃度玉米花絲多酚對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響，與大腸桿菌相似，玉米花絲多酚對金黃色葡萄球菌的抑制情況也呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。其中，1 MIC 玉米花絲多酚可將金黃色葡萄球菌進入對數(shù)生長期的時間從5 h 延長至7 h；2 MIC 玉米花絲多酚可將其進入對數(shù)生長期的時間延長至9 h。當玉米花絲多酚濃度達到4 MIC 時，兩種供試菌的生長均完全受到抑制。

圖8 玉米花絲多酚對兩種供試菌生長曲線的影響Fig.8 The effects of corn silk polyphenols on growth curves of two tested bacteria

3 結論

本實驗以墾糯1 號玉米花絲為主要原料，在單因素實驗的基礎上優(yōu)化超聲波輔助提取玉米花絲多酚工藝，得到最佳超聲波輔助提取玉米花絲多酚的工藝條件為：超聲波頻率40 kHz，超聲波功率350 W，超聲波溫度56 ℃，超聲波時間45 min，此時得到玉米花絲多酚提取率為（13.31±0.12） mg/g，與預測值接近，模型擬合效果良好。抑菌試驗證明：玉米花絲多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為2.5 mg/mL 和2 mg/mL，不同濃度玉米花絲多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制效果，且當玉米花絲多酚濃度為4 MIC 時，可以達到完全抑制其生長的效果，證明玉米花絲多酚可作為天然的抑菌劑，也為糯性玉米品種花絲資源的應用奠定理論基礎。