陳 銘，吳 昊，張文立，沐萬孟

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

D-甘露糖是甘露聚糖、半纖維素和纖維素的重 要組成結(jié)構(gòu)單元，其甜度約為蔗糖的60%，熱值為3.75 kcal/g，是一種具有吸引力的功能性糖。D-甘露糖具有許多獨特的生理功效，如不易被人體吸收轉(zhuǎn)化為糖原、作為膳食補充劑和藥物合成的原料[1]、益生元作用、抑制腫瘤細胞生長[2]、協(xié)同促進化療作用[3]以及對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用[4]，此外，通過脫氫反應(yīng)D-甘露糖還可以轉(zhuǎn)化為甜味劑甘露糖醇[5]等。

目前，D-甘露糖的制備方法主要包括物理提取法、化學(xué)合成法以及生物制備法[6]。例如，Zhang 等[7]成功地從棕櫚仁中提取到D-甘露糖，通過水解、過濾、吸附、結(jié)晶等操作后得到產(chǎn)量約為48.4 g/L的D-甘露糖。張偉等[8]通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，從原料葡萄糖合成甘露糖的轉(zhuǎn)化率達到32.6%。然而，化學(xué)合成法及物理提取法由于反應(yīng)體系成分復(fù)雜導(dǎo)致了生產(chǎn)分離成本的提高，且由于引入了各種試劑，對人體、環(huán)境具有一定的危害性，因此不適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，而生物酶法制備D-甘露糖由于其催化效率高、生產(chǎn)條件溫和、低成本以及環(huán)境生物友好性，是有潛力應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的替代方法。

D-來蘇糖異構(gòu)酶（D-Lyxose isomerase; D-LI）能催化多種醛糖與酮糖之間的異構(gòu)化反應(yīng)，具有底物廣譜性[9]。目前，約14 種不同來源的微生物源D-LI 已被挖掘和鑒定，這些D-LI 的最適溫度范圍為40～85 ℃，pH 范圍集中為6.5 或7.5，如D-LI 來源于Serratia proteamaculans（40 ℃，7.5）[9]、Providencia stuartii（45 ℃，7.5）[10]、Bacillus velezensis（55 ℃， 6.5）[11]、Thermosediminibacteroceani（65 ℃，6.5）[12]、Cohnellalaevoribosii（70 ℃，6.5）[13]、Dictyoglomusturgidum（75 ℃，7.5）[14]。眾所周知，弱酸性環(huán)境可抑制美拉德反應(yīng)，從而減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，有利于減少后續(xù)的分離成本[6]。科研人員通過酸堿氨基酸殘基置換策略，將來源Bacillus halodurans的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶268 位的谷氨酸突變成賴氨酸（E268K），相較于野生酶，最適pH 從8.0 降到7.0[15]。來源于Lactobacillus fermentum的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶三點突變體D268K/D269K/D299K 最適pH 從6.5 降到5.0[16]。Oh 等[17]將來源于Geobacillus stearothermophilus的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性中心408 位的纈氨酸突變成天冬氨酰或精氨酸，較于野生酶，最適pH 從8.5 降到7.5。

實驗室前期挖掘鑒定了來源T. archaeon的DLI（Thar-DLI），其生化性質(zhì)表明該酶最適溫度和最適pH 分別為80～85 ℃和6.5[18]。然而，該酶在以D-果糖為底物實際轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-甘露糖過程中，反應(yīng)12 h 后，溶液顏色呈黑褐色，表明存在嚴(yán)重的美拉德反應(yīng)，此pH 不適合作為D-甘露糖生產(chǎn)的條件，利用蛋白質(zhì)工程手段對Thar-DLI 實施弱酸性分子改造十分必要。然而，目前尚未見關(guān)于D-LI 弱酸性分子改造的研究報道。本文借助于上述提及的相關(guān)其他異構(gòu)酶的弱酸性分子改造經(jīng)驗和成果，基于蛋白質(zhì)序列比對及酸堿氨基酸置換策略理性設(shè)計了8 個單點突變體，而后從中選擇了3 個優(yōu)良單點突變體E82K、P105K、E165K 并進行兩兩組合雙點突變，進一步測定了雙點突變體的最適pH、動力學(xué)參數(shù)及在pH5.5條件下催化D-果糖生產(chǎn)D-甘露糖的效率及美拉德反應(yīng)程度，為工業(yè)上利用D-LI 生產(chǎn)D-甘露糖提供了可行的酶制劑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

E. coliBL21（DE3）以及pET-22b（+）質(zhì)粒 均為本實驗室保存；異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和氨芐青霉素鈉（Amp） 上海生工生物工程有限公司；D-果糖和D-甘露糖的標(biāo)準(zhǔn)樣品 Sigma 公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等 國藥集團化學(xué)有限公司，其中相應(yīng)的LB 培養(yǎng)基以及緩沖溶液的配制方法均同文獻[18]中一致；蛋白凝膠電泳試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 上海雅酶生物科技有限公司；以上所用到的所有試劑 均為分析純。

恒溫培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；電子天平、pH 計 梅特勒-托利多公司；實時熒光定量PCR儀 美國伯樂生命醫(yī)產(chǎn)品有限公司；高效液相色譜儀、示差折光檢測器以及柱溫箱 美國沃特世（waters）公司；Carbomix Ca-NP10：8%液相色譜柱蘇州賽分科技有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Thar-DLI 的同源建模 將Thar-DLI 蛋白序列（Genbank 號：RLE72808.1）上載到在線網(wǎng)站

SWISS-MODEL[19]（ https://swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，結(jié)果表明Thar-DLI 與來自Bacillus subtilisstrain 168 的D-LI（PDB：2Y0O）序列一致性達到了60.98%，以此晶體結(jié)構(gòu)為模板進行同源建模，并使用在線網(wǎng)站PROCHECK[20]（http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/）對建模結(jié)果進行可靠性分析。使用軟件PyMOL 對建模結(jié)構(gòu)進行理性分析與突變位點設(shè)計。

1.2.2 定點突變 根據(jù)不同原理與依據(jù)進行理性設(shè)計突變位點后，以實驗室已構(gòu)建好的pET-22b（+）-Thar-DLI 質(zhì)粒作為克隆模板，利用PCR 儀對其進行擴增，不同突變位點所使用引物在表1 中列出。PCR 擴增體系由Prime STAR Max（10 μL）、正向引物（0.5 μL）、反向引物（0.5 μL）、模板（0.5 μL）組成，用水補齊至20 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃（3 min）、95 ℃（30 s）、56 ℃（30 s）、72 ℃（3 min 10s）、72 ℃（5 min）、4 ℃（∞）。將PCR 擴增所得到的目的基因片段經(jīng)核酸電泳驗證后，再加入2 μL Q.cut Buffer 以及1 μL Q.cutDpnI，于37 ℃條件下反應(yīng)1.5 h 以去除反應(yīng)混合液中的模板，從而得到只含有已發(fā)生突變的目的基因的混合液[21]。

表1 突變位點引物設(shè)計Table 1 Primer design for mutation sites

1.2.3 核酸電泳 取1.0 g 瓊脂糖溶于100 mL 1×TEA緩沖液中，微波加熱溶解后取15～20 mL 于燒杯中并加入1.0 μL 核酸染料后倒于模具中，插上梳子，待冷卻后使用。取3.0 μL 擴增后反應(yīng)液加入0.5 μL 上樣緩沖液后，將3.0 μL DNA Marker 以及準(zhǔn)備好的樣品點入事先制備好的瓊脂糖凝膠中，在瓊脂糖水平電泳儀中120 V 運行20 min，于凝膠成像分析系統(tǒng)中的紫外燈下觀察目的基因條帶位置并拍照記錄[21]。

1.2.4 突變體酶的克隆表達與分離純化 將上述已驗證正確的成功突變體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌株E. coliBL21（DE3）中并涂LB 平板過夜培養(yǎng)得到單菌落。挑取成功轉(zhuǎn)化的單菌落在4 mL 含100 μg/mL Amp 的LB 培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min 的搖床中過夜預(yù)培養(yǎng)12 h。再將該種子液接種至200 mL 的含Amp 的LB 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)約2～2.5 h，待OD600值達到0.6～0.8 時加入1 mmol/L 的IPTG 溶液并在28 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng)6～8 h 誘導(dǎo)蛋白表達[21]。

為了進一步將菌體內(nèi)的目標(biāo)蛋白分離純化出來，首先將誘導(dǎo)完畢的菌體8000 r/min、4 ℃條件下離心10 min 并收集菌體，用15～20 mL 細胞破碎液（50 mmol/L 磷酸緩沖液PBS，100 mmol/L NaCl，pH7.0）重懸菌體，冰浴條件下用超聲破碎儀超聲破碎15 min（超聲1.0 s，暫停2.0 s），結(jié)束后再于相同條件離心10 min 去除細胞碎片，用0.22 μm 的濾膜過膜去除多余雜質(zhì)后得到粗酶液并置于冰上備用。

首先將瓊脂糖凝膠Ni2+吸附柱固定好后用去離子水沖洗，再用配制好的Loading Buffer（50 mmol/L PBS，500 mmol/L NaCl，pH7.0）沖洗約2～3 個柱體積以平衡柱子，再將粗酶液低流速通過鎳柱，使蛋白能充分與鎳柱結(jié)合，再次用Binding Buffer 平衡柱子并去除未吸附雜質(zhì)，隨后用Washing Buffer（Binding Buffer，90 mmol/L 咪唑）沖洗鎳柱以去除弱吸附的雜蛋白，最后用Elution Buffer（Binding Buffer，500 mmol/L 咪唑）洗脫目標(biāo)蛋白并收集。將收集到的純酶液置于透析液A（50 mmol/L PBS，10 mmol/L EDTA·2Na，pH7.0）中透析三次以去除酶分子中結(jié)合的金屬離子，再于透析液B（50 mmol/L PBS，pH7.0）中透析兩次以去除純酶液中的EDTA·2Na 以及咪唑，每6 h 更換一次透析液，最終得到高純度的目標(biāo)蛋白溶液。

1.2.5 突變體酶單亞基分子量的測定 利用SDSPAGE 來檢測重組來蘇糖異構(gòu)酶單亞基的分子量。按照蛋白凝膠試劑盒方法制備好電泳膠備用，電泳儀運行完畢后用考馬斯亮藍染色液對蛋白進行染色2 h，再用脫色液對其進行多次脫色直至見到清晰條帶[21]。

1.2.6 突變體酶的酶活測定 本實驗中重組Thar-DLI 的酶活是通過以D-果糖作為底物生成D-甘露糖來測定的。酶反應(yīng)體系共0.5 mL，由50 mmol/L PBS（pH6.5）、0.5 mmol/L Ni2+、100 mmol/LD-果糖、20 μg/mL 重組Thar-DLI 組成，在80 ℃條件下反應(yīng)10 min，煮沸20 min 滅活。一個單位的酶活（1 U）定義為以D-果糖為底物每分鐘生產(chǎn)1 μmolD-甘露糖的量。D-果糖和D-甘露糖通過高效液相色譜儀（HPLC）進行檢測，檢測條件為：85 ℃、0.6 mL/min，流動相為含50 mmol/L EDTA-Ca 的超純水，檢測器為示差折光檢測器，色譜柱為Carbomix Ca-NP10:8%的糖柱。

1.2.7 突變體酶最適pH 測定 選擇磷酸鹽緩沖體系PBS（6.0、6.5）以及醋酸鹽緩沖液體系HAC（5.0、5.5、6.0）測定重組Thar-DLI 的最適pH。酶反應(yīng)體系共0.5 mL，由50 mmol/L 不同pH 緩沖液、0.5 mmol/L Ni2+、100 mmol/L D-果糖、20 μg/mL 重組Thar-DLI組成，條件為在80 ℃條件下反應(yīng)10 min，煮沸20 min滅活。各突變體最適pH 圖中相對酶活含義為在兩種緩沖液體系pH 中將最高酶活設(shè)定為100%。各突變體與野生酶在pH5.5 和pH6.5 的比較圖中，將原始酶Thar-DLI 酶活設(shè)定為100%。

1.2.8 突變體酶動力學(xué)參數(shù)的測定 分別以5～200 mmol/L 濃度的D-果糖、D-甘露糖作為底物，其中野生酶反應(yīng)pH 為PBS6.5，突變體酶的反應(yīng)pH 為HAC5.5，其余條件同1.2.6 中的酶活測定條件一致，對突變體酶和野生酶在不同底物下的動力學(xué)參數(shù)進行測定。米氏常數(shù)Km（mmol/L）、催化常數(shù)kcat（s?1）、最大反應(yīng)速率Vmax（μmol/L?1s?1mg?1）以及催化效率kcat/Km等動力學(xué)參數(shù)由Lineweaver-Burk圖對數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合后計算得出。

1.2.9 突變體酶的生物轉(zhuǎn)化測定 為探究在pH5.5以及pH6.5 反應(yīng)體系下，突變體酶與原始酶的生物轉(zhuǎn)化進程，以80 g/L 的D-果糖作為底物，加酶量63 μg/mL，其他條件參照1.2.6 中的酶活測定方法，對原始酶和突變體酶的D-甘露糖的生產(chǎn)能力進行測定，在該反應(yīng)條件下進行持續(xù)的酶反應(yīng)，分別間隔不同時間段（15、30 min、1、2、4、6、8、10 h）進行取樣滅酶后適當(dāng)稀釋檢測其中的D-甘露糖生成量。1.2.10 美拉德反應(yīng)對比 為研究經(jīng)改造后的突變體酶在pH5.5 條件下與原始pH6.5 和pH5.5 條件下美拉德反應(yīng)程度的區(qū)別，以80 g/L D-果糖為底物，加酶量為63 μg/mL，反應(yīng)總體系為1.0 mL，其余條件參照1.2.6 中的酶反應(yīng)條件，對體系進行持續(xù)約10 h 的觀察，并參照Ajandouz 等[22]的方法測定A294和A420處的吸光度來判斷美拉德中間產(chǎn)物生產(chǎn)量以及褐變程度，并拍照記錄美拉德顏色的變化過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 Thar-DLI 結(jié)構(gòu)及突變位點設(shè)計

利用在線網(wǎng)站Clustal Omega 對不同來源DLI 氨基酸序列進行比對，結(jié)果如圖1 所示，選取序列同源性最高且晶體結(jié)構(gòu)已被解析出的Bacillus subtilisstrain 168 來源的D-LI 作為模板（PDB：2Y0O），通過在線建模軟件SWISS-MODEL 對其進行同源建模，模擬結(jié)果如圖2 所示，通過PyMOL 軟件對模擬出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析，在遠離活性中心的蛋白結(jié)構(gòu)表面以及Loop 環(huán)柔性區(qū)域選取突變位點，嘗試通過改變蛋白與周圍環(huán)境的相互作用以及降低蛋白柔性來提高蛋白在酸性條件下的穩(wěn)定性來提高突變體的耐酸性，并依據(jù)酸堿置換理論以及Xu[16]等人將賴氨酸（D）突變成天冬氨酸（K）后得到了優(yōu)良突變體酶的經(jīng)驗指導(dǎo)下，最終理性設(shè)計了8 個單點突變體，分別為：E8K、E9K、D37K、D42K、E82K、P105K、E165K、E182K。

圖1 來源于不同微生物的D-LIase 氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of D-LIase from different microorganisms

圖2 Thar-D-LI 同源建模結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Homologous modeling structure diagram of Thar-D-LI

2.2 Thar-DLI 弱酸性分子改造

2.2.1 單點突變酶不同pH 酶活的測定 不同突變體酶在不同pH 條件下的相對酶活如圖3 所示。同時各個突變體酶與原始酶在HAC5.5 以及PBS6.5條件下的相對酶活比較如圖4、圖5 所示，由于在pH5.5 條件下可以抑制美拉德反應(yīng)，為了評價所得到的突變體是否滿足所需，故對原始酶和突變體酶在這兩種pH 條件下的相對酶活情況進行了對比。從圖3 中可以看出，D37K 基本完全失去酶活，其中突變體E8K、D42K、E82K、P105K 的最適pH 未發(fā)生變化仍為6.5，而突變體E9K、E165K、E182K 的最適pH 為6.0（PBS），且E165K 在HAC5.5 時的相對酶活高達96.5%，同時P105K 在HAC5.5 時的相對酶活（80.2%）與PBS6.0 的相對酶活（82.1%）十分接近，表明這些點在HAC5.5 條件下的酶活明顯大大提升。從圖4、圖5 中可以明顯看出，在HAC5.5 條件下，E82K、P105K、E165K 三個突變體的相對酶活較原始酶Thar 分別提高了2.25、2.08 和2.42 倍，同時在PBS6.5 條件下也提高了2.13、1.95 和1.82 倍，其他突變體如E8K、E9K 在HAC5.5 條件下的相對酶活也達到了177%和139%，而D42K 與E182K 相對酶活基本未發(fā)生變化，均為102%。因此最終選擇E82K、P105K、E165K 三個突變體進行下一步雙點疊加。

圖3 單點突變體在HAC（5.0、5.5、6.0）及PBS（6.0、6.5）條件下的酶活Fig.3 Enzyme activity of single-point mutants under HAC (5.0,5.5,6.0) and PBS (6.0,6.5)condition

圖4 HAC 5.5 條件下單點突變體酶活對比Fig.4 Comparison of enzyme activities of single-point mutants under HAC 5.5 condition

圖5 PBS 6.5 條件下單點突變體酶活對比Fig.5 Comparison of enzyme activities of single-point mutants under PBS 6.5 condition

2.2.2 雙點突變酶不同pH 酶活的測定 對上述篩選出來的3 個優(yōu)良突變體進行兩兩間的組合突變，最終得到三個雙點突變體：E82K/P105K、E82K/E165K、P105K/E165K，結(jié)果如圖6～圖8 所示。由圖6～圖8 可以看出，三個雙點突變酶在PBS 6.0 條件下的酶活都明顯高于PBS6.5 條件下的酶活，說明突變酶的最適pH 均在向弱酸性的方向遷移；在HAC 體系中，E82K/E165K 的最適pH 遷移了1 個單位，由PBS6.5變成了HAC5.5，E82K/P105K 的最適 pH 遷 移 了 0.5 個 單 位， 由 PBS6.5 變 成 了HAC6.0，且兩個突變體在HAC5.5 以及HAC6.0 條件下的相對酶活均明顯高于PBS6.0 及PBS6.5。同單點突變一樣，對雙點突變體酶與野生酶在PBS6.5 以及HAC5.5 條件下的酶活也進行了比較，結(jié)果如圖7、圖8 所示，其中在HAC5.5 條件下，E82K/P105K 突變體酶的酶活提高了3.4 倍，表明單點突變E82K 和P105K 起協(xié)同作用共同提高了酶活，而E82K/E165K 與P105K/E165K 突變體酶僅提高了1.1 和1.15 倍，但三個雙點突變酶在PBS6.5 條件下的酶活均發(fā)生了降低，其中E82K/E165K 與P105K/E165K 突變體酶的相對酶活僅為31%和20%，而E82K/P105K 還保留了92%的酶活，僅略微降低。汪芳等[23]通過對天冬氨酸β-脫羧酶的酸性改造后，得到的單點突變體在其最適pH5.5 條件下比酶活也僅較原始酶提高了7.98%，而朱姚等[24]對中性內(nèi)切纖維素酶蛋白進行pH 改造后的突變體在pH6.0 條件下酶活提高了15.9%。因此，對比本文章中的改造結(jié)果，更能凸顯該雙點突變體在PBS6.5 以及HAC5.5 條件下酶活的提高程度，且較原始酶有很大的優(yōu)勢，更加具有工業(yè)價值。

圖6 雙點突變體在HAC（5.0、5.5、6.0）及PBS（6.0、6.5）條件下的酶活Fig.6 Enzyme activity of double-point mutantsunder HAC(5.0,5.5,6.0) and PBS (6.0,6.5)condition

圖7 HAC 5.5 條件下雙點突變體酶活對比Fig.7 Comparison of enzyme activities of double-point mutants under HAC 5.5 condition

圖8 PBS 6.5 條件下雙點突變體酶活對比Fig.8 Comparison of enzyme activities of double-point mutants under PBS6.5 condition

2.2.3 雙點突變體酶的單亞基分子量測定 通過SDSPAGE 對篩選出的E82K/P105K 雙點突變體的單亞基分子量進行測定，結(jié)果如圖9 所示，該雙點突變體的條帶單一且與原始酶條帶在同一位置，說明該酶純度較高，表達效果很好。變體酶反應(yīng)6 h 后達到穩(wěn)定，反應(yīng)10 h 后轉(zhuǎn)化率約為18%，而原始酶在HAC5.5 條件下反應(yīng)8 h后才達到穩(wěn)定，反應(yīng)10 h 后轉(zhuǎn)化率約為17%，表明突變體酶在HAC5.5 條件下的催化速率較原始酶更高。范晨等[26]在其對阿拉伯糖異構(gòu)酶的研究中得到的兩個單點突變體酶，對其大規(guī)模生物合成連續(xù)跟蹤30 h 后發(fā)現(xiàn)突變體的轉(zhuǎn)化率相對于原始酶的15.3%提高了約4%，雖提高幅度對比本文章的改造酶較大，但其達到穩(wěn)定的時間卻遠高于改造前，因此本文得到的突變體酶性質(zhì)提升更加全面，也更具有優(yōu)勢。

圖9 野生酶及其雙點突變體E82K/P105K SDS-PAGE 電泳Fig.9 SDS-PAGE analysis of wild type and double-point mutant E82K/P105K enzyme

2.2.4 雙點突變體酶的動力學(xué)參數(shù)測定 為對比突變體酶與原始酶在HAC5.5 和PBS6.5 條件下的動力學(xué)參數(shù)，分別以不同濃度D-果糖和D-甘露糖作為底物，利用Lineweaver–Burk 圖計算其相應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表2 所示，E82K/P105K 對D-果糖的Km值為78.77 min?1，較野生酶的10.06 min?1有所提高，表明突變體酶的底物親和力有所降低，但kcat/Km值相比野生酶有所略微提升，說明突變體酶在HAC5.5條件下的催化效率與原始酶在PBS6.5 條件下的催化效率相當(dāng)。同樣，對于底物D-甘露糖，突變體酶的底物親和力較原始酶降低了約3 倍，但其催化效率提高了約2 倍。趙菡等[25]在其pH 穩(wěn)定性研究中篩選出了一株三點突變體，且該酶的Km值同樣略微提升，由0.35 μmol/L 提高至0.43 μmol/L，同時該酶的催化活力kcat/Km也較原始酶有所降低，由2.98×104mol?1·s?1降低至1.70×104mol?1·s?1，而本研究中的突變體酶的相應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km也有所降低，但其kcat/Km卻能夠略微提高甚至翻倍。

表2 野生酶與突變體酶的動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of wild type and mutant enzyme

2.2.5 雙點突變酶生產(chǎn)中的生物轉(zhuǎn)化 對野生酶在PBS6.5 以及HAC5.5 條件下和E82K/P105K 突變體酶在HAC5.5 條件下的大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化進行了對比研究，結(jié)果如圖10 所示。在轉(zhuǎn)化的前4 h 內(nèi)，甘露糖的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，4 h 后均趨于平緩，其中突變體酶在HAC5.5 條件下的曲線整體在野生酶Thar-DLI 曲線的上方，說明突變體酶在HAC5.5 條件下的長時間轉(zhuǎn)化過程中的酶活和轉(zhuǎn)化率均較原始酶高；突

圖10 D-LI 及其突變體酶催化D-果糖生物轉(zhuǎn)化跟蹤圖Fig.10 Time course of D-fructose bioconversion catalyzed by D-LI and its mutant enzyme

2.2.6 雙點突變酶美拉德反應(yīng)程度測定 本實驗通過弱酸性改造來使突變體酶的最適pH 向酸性發(fā)生遷移，而酸性環(huán)境能明顯抑制美拉德反應(yīng)[27]以及減少非酶褐變和副產(chǎn)物的產(chǎn)生[28?29]，從而使其在工業(yè)生產(chǎn)中更具有優(yōu)勢。如圖11、圖12 所示，在波長294 nm下測得反應(yīng)過程中美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的合成量，可以看出在PBS6.5 條件下，反應(yīng)過程中生成中間產(chǎn)物量遠高于HAC5.5 條件下的，且PBS6.5 條件下中間產(chǎn)物積累量高出HAC5.5 條件下約3～4 倍；而在波長420 nm 下測定褐變程度時發(fā)現(xiàn)PBS6.5 條件下不足以抑制美拉德反應(yīng)，仍有部分中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成了類黑精，而在HAC5.5 時基本沒有類黑精的產(chǎn)生，表明基本抑制了美拉德反應(yīng)過程中中間產(chǎn)物向類黑精的轉(zhuǎn)化。同時，反應(yīng)過程中顏色的變化趨勢如圖12 所示，從表觀上可以看出HAC5.5 條件下的美拉德顏色較PBS6.5 條件下淺很多，而突變體酶與原始酶雖在HAC 5.5 條件下顏色相差不大，但其在各個時間點的轉(zhuǎn)化率均較原始酶高。

圖11 D-LI 及其突變體酶美拉德中間產(chǎn)物及褐變程度的測定Fig.11 Determination of Maillard intermediate and browning degree of D-LI and its mutant enzyme

圖12 D-LI 及其突變體酶催化D-果糖反應(yīng)過程中美拉德顏色變化情況Fig.12 Color change of Maillard during D-fructose reaction catalyzed by D-LI and its mutant enzyme

3 結(jié)論

對實驗室已鑒定出的一株來源于嗜熱細菌T.archaeon的D-LI 進行弱酸性分子改造，旨在減少美拉德反應(yīng)，減少分離成本，從而更有利于工業(yè)上D-甘露糖的生產(chǎn)。通過對不同來源D-LI 氨基酸序列比對以及對該酶的結(jié)構(gòu)進行理性設(shè)計，設(shè)計8 個單點突變體，經(jīng)過初篩后對得到的最佳的3 個單點疊加組合突變，最終得到了一個雙點突變體E82K/P105K，其最適pH 由6.5 遷移到了6.0，同時其在pH5.5 條件下時的酶活較原始酶提高了近3.4 倍，底物特異性研究也發(fā)現(xiàn)該突變體酶在pH5.5 條件下比原始酶在pH6.5 條件下以D-果糖為底物時有著略高的催化效率，以D-甘露糖為底物時有著高出近2 倍的催化效率，表明其能更快的催化D-果糖與D-甘露糖之間的互相轉(zhuǎn)化。大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化也發(fā)現(xiàn)在10 h的連續(xù)跟蹤過程中，在pH5.5 條件下，該突變體酶的轉(zhuǎn)化率均高于原始酶，且比原始酶早2 h 達到穩(wěn)定。最后，通過比較突變體E82K/P105K 在pH6.5 和pH5.5條件下D-果糖轉(zhuǎn)化時美拉德反應(yīng)程度，發(fā)現(xiàn)pH5.5條件下美拉德顏色明顯變淺，同時美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物以及最終產(chǎn)物也都明顯降低，表明了Thar-DLI 弱酸性分子改造的意義及其在實際工業(yè)生產(chǎn)中的價值。