虞菊萍，楊鳴華，何小榮

（中國藥科大學(xué)工學(xué)院，南京211198）

植物內(nèi)生真菌是活性天然化合物的重要來源之一［1］。它們的部分或整個生活史定植在植物中，與宿主共同進(jìn)化。在這個共同進(jìn)化的過程中，內(nèi)生真菌和宿主植物表現(xiàn)出互惠互利的關(guān)系。一方面內(nèi)生真菌利用宿主植物的物質(zhì)完成自身的生長和繁殖，另一方面內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生一些活性代謝產(chǎn)物有助于宿主植物抗病抗蟲害，提高宿主的生存能力［2］。目前，從植物內(nèi)生真菌中已經(jīng)分離鑒定出豐富的天然產(chǎn)物，如：生物堿、聚酮類化合物、萜類化合物和肽類化合物等，這些化合物具有抗菌、細(xì)胞毒、抗結(jié)核、抗阿爾茨海默病等廣泛的生物活性［3-6］。因此，對植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與挖掘有利于尋找更多的生物活性化合物，為研究創(chuàng)新藥物提供一條有效的途徑。

本研究從半夏新鮮的塊莖表皮分離得到一株漆斑菌屬真菌，對其發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物進(jìn)行了抗菌活性初篩，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗白色念珠菌活性。通過進(jìn)一步分離得到12個化合物，分別鑒定為3′-羥基疣孢菌素A（1）、疣孢菌素A（2）、乙?；噫呔豅（3）、疣孢菌素J（4）、疣孢菌素K（5）、漆斑菌素A（6）、漆斑菌素D（7）、漆斑菌素H（8）、漆 斑 菌 素J（9）、verrol 4-acetate（10）、（3S，3a S，6α，6a R）-dihydrosporothrioride（11）和4，6-二羥基-1（3 H）-異苯并呋喃（12），對分離出的化合物進(jìn)行抗白色念珠菌活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物2、3、4、7和8對白色念珠菌有較強(qiáng)的抑菌作用，MIC50分別為0.318、0.218、0.047、0.569和0.558μg/mL。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1100系列LC/MSD Trap質(zhì)譜儀測定（美國Agilient公司）；ACF-500 MHz型核磁共振儀（TMS內(nèi)標(biāo)）；ACF-600 MHz型核磁共振儀（TMS內(nèi)標(biāo)）（德國Bruker公司）；1260型高效液相色譜儀（美國Agilient公司）；LC-8A型制備型高效液相色譜儀（日本島津公司）；100~200、200~300目硅膠，GF254硅膠（青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（瑞典Amershan Pharmacia公司）；RPMI 1640粉末，氟康唑（美國Gibco公司）；分析級、色譜級甲醇（江蘇漢邦科技有限公司）；乙腈（色譜級，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

本實(shí)驗(yàn)菌株于2016年從產(chǎn)自甘肅的半夏Pinellia ternate塊莖中分離獲得，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增其18S DNA，測序結(jié)果與已知真菌漆斑菌屬M(fèi)yrot h eci um sp.（MG 562611.1）有100%的同源性。

1.2方法

1.2.1 菌株發(fā)酵 將生長在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDB）斜面培養(yǎng)基上的內(nèi)生真菌M yr oth ecium sp.接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）液體培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min在搖床中培養(yǎng)4 d作為種子液備用。準(zhǔn)備10個2 L的錐形瓶，每瓶裝入大米320 g和水450 mL，浸泡過夜后，在121℃條件下滅菌20 min。大米培養(yǎng)基涼至室溫后，將準(zhǔn)備好的種子液接種于培養(yǎng)基中，室溫下培養(yǎng)40 d。發(fā)酵完成后，內(nèi)生真菌漆斑菌屬固體產(chǎn)物用乙酸乙酯超聲提取3次，提取液減壓濃縮后得到褐色粗浸膏16 g。

1.2.2 提取與分離 浸膏用100~200目硅膠1∶1進(jìn)行拌樣，再經(jīng)過200~300目硅膠柱用石油醚-乙酸乙酯（40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）梯度洗脫，采用TLC和HPLC檢測分析合并得到7個餾份（Fr.A~G）。Fr.B經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇，1∶1）得到4個餾分（Fr.B1~B4），F(xiàn)r.B2經(jīng)過制備高效液相得到化合物1（3 mg）、3（7.6 mg）和12（6 mg），F(xiàn)r.B3經(jīng)過制備高效液相得到化合物2（20 mg）和4（6 mg）。Fr.C依次經(jīng)過硅膠（石油醚-乙酸乙酯20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）、Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1），再經(jīng)制備高效液相得到化合物5（4.5 mg）、6（5.8 mg）和7（2.7 mg），F(xiàn)r.D經(jīng)過Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）得到化合物8（10 mg）和9（3 mg），F(xiàn)r.E經(jīng)過制備高效液相得到化合物10（3.5 mg）和11（3.2 mg）。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末，ESI-MS m/z：541［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.25（1H，dd，J=15.6 Hz，12.1 Hz，H-3″），6.73（1H，t，J=12.1 Hz，H-4″），6.14（1H，d，J=11.6 Hz，H-5″），6.01（1H，d，J=15.6 Hz，H-2″），5.75（1H，dd，J=8.2 Hz，4.4 Hz，H-4），5.44（1H，d，J=5.3 Hz，H-10），4.56（1H，d，J=12.3 Hz，H-15b），4.50（1H，m，H-5′b），4.36（1H，d，J=12.3 Hz，H-15a），4.21（1H，m，H-5′a），4.10（1H，d，J=5.9 Hz，H-2′），3.87（1H，d，J=4.9 Hz，H-2），3.62（1H，d，J=5.3 Hz，H-11），3.14（1H，d，J=3.9 Hz，H-13b），2.88（1H，d，J=3.9 Hz，H-13a），2.49（1H，dd，J=15.3 Hz，8.2 Hz，H-3b），2.22（1H，m，H-3a），2.02（1H，m，H-8b），2.00（1H，m，H-4′b），1.97（1H，m，H-7b），1.85（1H，m，H-7a），1.78（1H，m，H-4′a），1.77（1H，m，H-8′a），1.74（3H，s，H-16），1.24（3H，s，H-6′），0.81（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CD‐Cl3）δ：173.2（C-1′），166.4（C-1″），165.2（C-6″），141.4（C-9），139.5（C-4″），139.3（C-3″），126.9（C-5″），125.4（C-2″），117.9（C-10），78.9（C-2），78.1（C-2′），75.7（C-4），73.2（C-3′），67.3（C-11），65.5（C-15），65.0（C-12），60.3（C-5′），49.3（C-5），48.0（C-13），44.1（C-6），35.2（C-3），34.9（C-4′），27.9（C-8），23.3（C-16），23.1（C-6′），20.4（C-7），7.6（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［7］，故鑒定化合物1為3′-羥基疣孢菌素A，其結(jié)構(gòu)見圖1。

Figure 1 Structures of compounds 1-12

化合物2 白色粉末，ESI-MSm/z：525［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.03（1H，dd，J=15.6 Hz，11.6 Hz，H-3″），6.69（1H，t，J=11.6 Hz，H-4″），6.16（1H，d，J=11.6 Hz，H-5″），6.06（1H，d，J=15.6 Hz，H-2″），5.82（1H，dd，J=8.2 Hz，4.0 Hz，H-4），5.45（1H，d，J=4.7 Hz，H-10），4.81（1H，d，J=12.1 Hz，H-15b），4.52（1H，m，H-5′b），4.23（1H，d，J=12.1 Hz，H-15a），4.16（1H，s，H-2′），4.00（1H，m，H-5′a），3.88（1H，d，J=5.1 Hz，H-2），3.58（1H，d，J=4.7 Hz，H-11），3.14（1H，d，J=4.0 Hz，H-13b），2.88（1H，d，J=4.0 Hz，H-13a），2.50（1H，m，H-3b），2.37（1H，m，H-3′），2.25（1H，m，H-3a），1.97（1H，m，H-7b），1.96（1H，m，H-4′b），1.80（1H，m，H-4′a），1.77（3H，s，H-16），1.72（1H，m，H-7a），0.89（3H，d，J=6.8 Hz，H-6′），0.86（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：174.7（C-1′），166.1（C-1″），165.5（C-6″），141.2（C-9），139.0（C-3″），138.8（C-4″），127.5（C-2″），125.8（C-5″）117.9（C-10），78.9（C-2），75.5（C-4），74.2（C-2′），66.9（C-11），65.2（C-12），63.5（C-15），61.1（C-5′），49.5（C-5），47.8（C-13），44.2（C-6），34.9（C-3），33.2（C-3′），32.2（C-4′），27.5（C-8），23.3（C-16），20.0（C-7），10.0（C-6′），7.3（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［8］，故鑒定化合物2為疣孢菌素A，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物3 白色粉末，ESI-MSm/z：565［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.01（1H，dd，J=15.7 Hz，11.6 Hz，H-8′），6.62（1H，t，J=11.3 Hz，H-9′），6.08（1H，d，J=11.3 Hz，H-7′），6.01（1H，d，J=15.7 Hz，H-10′），5.93（1H，dd，J=8.2 Hz，4.3 Hz，H-4），5.77（1H，s，H-2′），5.70（1H，J=5.4 Hz，H-10），5.19（1H，m，H-8），4.54（1H，d，J=12.5 Hz，H-15b），4.49（1H，m，H-5′b），4.21（1H，d，J=12.5 Hz，H-15a），4.13（1H，m，H-5′a），3.84（1H，d，J=5.1 Hz，H-11），3.80（1H，d，J=5.5 Hz，H-2），3.11（1H，d，J=3.9 Hz，H-13b），2.84（1H，d，J=3.9 Hz，H-13a），2.46~2.57（3H，m，H-3a，4′），2.28（3H，s，H-12′），2.17~2.22（3H，m，H-3b，7），1.95（3H，s，H-18），1.76（3H，s，H-16），0.81（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：170.9（C-13′），165.8（C-11′），165.7（C-6′），165.5（C-1′），157.0（C-3′），139.9（C-8′），138.8（C-9′），136.5（C-9），127.8（C-7′），125.1（C-10′），123.8（C-10），117.7（C-2′），78.9（C-2），74.8（C-4），68.7（C-8），67.0（C-11），65.3（C-12），64.4（C-15），60.4（C-5′），49.0（C-5），47.9（C-13），42.2（C-6），40.2（C-4′），34.9（C-3），26.5（C-7），21.1（C-16），20.5（C-14′），17.1（C-12′），7.0（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［9］，故鑒定化合物3為乙?；噫呔豅，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物4 白色粉末，ESI-MSm/z：507［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.08（1H，dd，J=15.7 Hz，11.6 Hz，H-3″），6.64（1H，t，J=11.6 Hz，H-4″），6.12（1H，d，J=11.6 Hz，H-5″），6.02（1H，d，J=15.7 Hz，H-2″），6.01（1H，m，H-4），5.85（1H，s，H-2′），5.48（1H，d，J=5.2 Hz，H-10），4.48（1H，m，H-5′b），4.44（1H，d，J=12.6 Hz，H-15b），4.17（1H，m，H-5′a），3.99（1H，J=12.6 Hz，H-15a），3.87（1H，d，J=5.1 Hz，H-2），3.77（1H，d，J=5.2 Hz，H-11），3.16（1H，d，J=4.0 Hz，H-13b），2.85（1H，d，J=4.0 Hz，H-13a），2.55（1H，m，H-3b），2.53（2H，m，H-4′），2.30（3H，m，H-6′），2.18（1H，m，H-3a），2.04（2H，m，H-8），1.98（1H，m，H-7b），1.84（1H，m，H-7a），1.73（3H，s，H-16），0.85（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：166.1（C-1′），165.8（C-6″），165.6（C-1″），156.6（C-3′），140.5（C-9），139.5（C-3″），139.1（C-4″），127.4（C-2″），125.5（C-5″），118.6（C-10），79.0（C-2），75.3（C-4），67.3（C-11），65.5（C-12），63.3（C-15），48.8（C-5），48.1（C-13），43.0（C-6），40.2（C-4′），35.1（C-3），27.7（C-8），23.3（C-16），20.8（C-7），17.2（C-6′），7.0（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［10］，故鑒定化合物4為疣孢菌素J，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物5 白色粉末，ESI-MSm/z：509［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.04（1H，dd，J=15.7 Hz，11.6 Hz，H-3″），6.67（1H，t，J=11.6 Hz，H-4″），6.09（1H，d，J=11.6 Hz，H-5″），6.06（1H，d，J=15.7 Hz，H-2″），5.81（1H，dd，J=8.1 Hz，3.8 Hz，H-4），5.40（1H，d，J=5.1 Hz，H-10），5.18（1H，s，H-13b），4.77（1H，d，J=12.0 Hz，H-15b），4.77（1H，s，H-13a），4.52（1H，m，H-5′b），4.47（1H，d，J=5.1 Hz，H-2），4.22（1H，d，J=12.0 Hz，H-15a），4.16（1H，d，J=5.5 Hz，H-2′），4.00（1H，m，H-5′a），3.58（1H，d，J=5.1 Hz，H-11），2.50（1H，m，H-3），2.38（1H，m，H-3′），2.25（1H，m，H-3），1.97（1H，m，H-7b），1.96（1H，m，H-4′b），1.80（1H，m，H-4′a），1.72（3H，s，H-16），1.68（1H，m，H-7a），1.09（3H，s，H-14），0.89（3H，d，J=6.8 Hz，H-6′）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：174.7（C-1′），166.0（C-1″），165.5（C-6″），151.6（C-12），140.8（C-9），138.9（C-3″），138.8（C-4″），127.5（C-2″），125.7（C-5″），118.2（C-10），106.5（13），78.7（C-2），75.6（C-4），74.1（C-2′），66.6（C-11），63.7（C-15），61.2（C-5′），52.1（C-5），44.3（C-6），36.0（C-3），33.2（C-3′），32.2（C-4′），27.5（C-8），23.3（C-16），18.8（C-7），12.2（C-14），10.0（C-6′）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［11］，故鑒定化合物5為疣孢菌素K，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物6 白色粉末，ESI-MSm/z：555［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.65（1H，dd，J=15.6 Hz，11.6 Hz，H-8′），6.66（1H，t，J=11.6 Hz，H-9′），6.01（1H，d，J=15.6 Hz，H-7′），5.79（1H，dd，J=11.5 Hz，H-10′），5.78（1H，m，H-4），5.43（1H，d，J=4.2 Hz，H-10），4.42（2H，d，J=12.3 Hz，H-15），4.09（1H，s，H-2′），3.85（1H，d，J=5.0 Hz，H-2），3.68（1H，m，H-6′），3.62（1H，m，H-13），3.60（1H，m，H-11），3.53（2H，m，H-5′），3.11（1H，d，J=3.9 Hz，H-13b），2.80（1H，d，J=3.9 Hz，H-13a），2.45（1H，d，J=15.4，8.3 Hz，H-3b），2.20（1H，m，H-3a），2.03（2H，m，H-8），2.01（1H，m，H-3′），1.90（2H，m，H-7），1.78（2H，m，H-4′），1.73（3H，s，H-16），1.18（1H，d，J=6.3 Hz，H-14′），1.08（1H，d，J=6.9 Hz，H-12′），0.80（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：174.8（C-1′），166.5（C-11′），143.9（C-9′），140.9（C-9），139.3（C-7′），125.9（C-8′），118.2（C-10），117.4（C-10′），83.9（C-6′），79.0（C-2），75.6（C-2′），74.3（C-4），70.6（C-13′），69.7（C-5′），67.1（C-11），65.2（C-12），64.4（C-15），49.3（C-5），47.7（C-13），43.7（C-6），37.0（C-3′），34.8（C-3），33.0（C-4′），27.6（C-8），23.3（C-16），20.2（C-7），18.2（C-14′），14.7（C-12′），7.5（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［12］，故鑒定化合物6為漆斑菌素A，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物7 白色粉末，ESI-MSm/z：553［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.53（1H，dd，J=15.6 Hz，11.4 Hz，H-8′），6.62（1H，t，J=11.4 Hz，H-9′），5.98（1H，dd，J=15.6 Hz，3.3 Hz，H-7′），5.85（1H，m，H-4），5.83（1H，m，H-10′），5.45（1H，d，J=4.8 Hz，H-10），4.39（1H，d，J=12.4 Hz，H-15b），4.28（1H，d，J=12.4 Hz，H-15a），3.87（1H，d，J=5.1 Hz，H-2），3.83（1H，m，H-6′）3.65-3.70（2H，m，H-5′），3.65（1H，d，J=4.8 Hz，H-11），3.36（1H，m，H-13′），3.32（1H，s，H-2′），3.14（1H，d，J=4.0 Hz，H-13b），2.83（1H，d，J=4.0 Hz，H-13a）；2.51（1H，m，H-3b），2.48（1H，m，H-4′b），2.18（1H，m，H-4′a），2.04（1H，m，H-3a），1.95（2H，m，H-8），1.83（1H，m，H-7a），1.74（3H，s，H-16），1.63（3H，s，H-12′），1.48（1H，m，H-7b），1.22（3H，d，J=6.2 Hz，H-12′），0.85（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：168.1（C-1′），166.4（C-11′），143.1（C-9′），140.7（C-9），138.3（C-7′），126.3（C-8′），118.4（C-10），118.1（C-10′），85.6（C-6′），79.0（C-2），74.4（C-4），70.9（C-13′），67.4（C-5′），67.0（C-11），65.4（C-12），64.6（C-15），63.3（C-3′），58.2（C-2′），49.2（C-5），47.8（C-13），43.2（C-6），39.6（C-4′），35.1（C-3），27.6（C-8），23.3（C-16），20.6（C-7），18.2（C-14′），17.4（C-12′），7.0（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［13］，故鑒定化合物7為漆斑菌素D，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物8 白色粉末，ESI-MSm/z：535［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.71（1H，m，H-8′），6.58（1H，t，J=11.4 Hz，H-9′），5.98（1H，dd，J=13.3 Hz，0.8 Hz，H-7′），5.96（1H，m，H-4），5.82（1H，d，J=11.1 Hz，H-10′），5.70（1H，s，H-2′），5.55（1H，dd，J=8.5 Hz，3.3 Hz，H-5′），5.46（1H，d，J=4.2 Hz，H-10），4.34（1H，d，J=12.5 Hz，H-15b），4.08（1H，m，H-6′），4.06（1H，d，J=12.5 Hz，H-15a），3.86（1H，d，J=5.1 Hz，H-2），3.69（2H，m，H-11，13′），3.15（1H，d，J=4.1 Hz，H-13b），2.84（1H，d，J=4.1 Hz，H-13a），2.66（1H，dd，J=12.4 Hz，2.9 Hz，H-4′b），2.50（1H，dd，J=15.3，8，4 Hz，H-3b），2.30（3H，s，H-12′），2.28（1H，m，H-3a），2.19（1H，m，H-4′a），2.03（2H，m，H-8），1.89（2H，m，H-7），1.72（3H，s，H-16），1.36（3H，d，J=6.0 Hz，H-14′），0.88（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：166.3（C-11′），166.2（C-1′），154.9（C-3′），142.9（C-9′），140.5（C-9），134.8（C-7′），126.1（C-8′），119.0（C-2′），118.8（C-10′），100.9（C-2′），82.0（C-6′），79.2（C-2），76.7（C-13′），73.9（C-4），67.7（C-11），65.6（C-12），63.2（C-15），49.0（C-5），48.0（C-4′），47.6（C-13），43.2（C-6），34.9（C-3），27.6（C-8），23.3（C-16），20.5（C-7），18.4（C-12′），16.5（C-14′），7.3（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［14］，故鑒定化合物8為漆斑菌素H，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物9 白色粉末，ESI-MSm/z：551［M+Na］+。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：7.65（1H，dd，J=15.0 Hz，11.3 Hz，H-8′），6.55（1H，t，J=11.3 Hz，H-9′），5.92（1H，m，H-7′），5.89（1H，m，H-4），5.79（1H，d，J=11.1 Hz，H-10′），5.76（1H，s，H-2′），5.44（1H，dd，J=3.9 Hz，H-10），5.25（1H，d，J=6.9 Hz，H-5′），4.39（1H，d，J=12.5 Hz，H-15b），4.09（1H，d，J=8.7 Hz，H-6′），4.02（1H，d，J=12.5 Hz，H-15a），3.78-3.79（2H，m，H-2，4′），3.65（2H，m，H-11，13′），3.12（1H，d，J=3.9 Hz，H-13b），2.82（1H，d，J=3.9 Hz，H-13a），2.47（1H，dd，J=15.3 Hz，8.4 Hz，H-3′a），2.27（3H，s，H-12′），2.18（1H，m，H-3′b），1.88-2.04（4H，m，H-7，8），1.71（3H，s，H-16），1.37（3H，d，J=6.0 Hz，H-14′），0.85（3H，s，H-14）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：166.2（C-11′），165.9（C-1′），155.3（C-3′），143.1（C-9′），140.4（C-9），134.5（C-7′），126.1（C-8′），119.9（C-2′），118.8（C-10′），118.6（C-10），103.3（C-5′），82.2（C-6′），79.7（C-4′），79.2（C-2），76.4（C-13′），73.8（C-4），67.8（C-11），65.5（C-12），63.4（C-15），49.2（C-5），48.0（C-13），43.2（C-6），34.7（C-3），27.6（C-8），23.3（C-16），20.4（C-7），15.9（C-12′），13.1（C-14′），7.4（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［15］，故鑒定化合物9為漆斑菌素J，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物10 白色粉末，ESI-MSm/z：443［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.95（1H，dd，J=7.8 Hz，3.4 Hz，H-4），5.83（1H，d，J=1.0 Hz，H-2′），5.48（1H，d，J=4.8 Hz，H-10），4.16（1H，dd，J=12.5 Hz，H-15），4.13（1H，d，J=12.5 Hz，H-15），3.88（1H，m，H-2），3.86（1H，d，J=4.8 Hz，H-11），3.84（1H，m，H-5′），3.82（1H，m，H-5′），3.16（1H，d，J=4.0 Hz，H-13），2.85（1H，d，J=4.0 Hz，H-13），2.31（1H，m，H-3），2.30（1H，m，H-8），2.23（3H，d，J=1.0 Hz，H-6′），2.08（3H，s，H-2″），1.97（2H，m，H-4′），1.95（1H，m，H-3），1.88（1H，m，H-8），1.73（3H，s，H-16），1.31（2H，m，H-7），0.88（3H，s，H-14）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：171.1（C-1″），165.9（C-1′），157.1（C-3′），140.8（C-9），118.4（C-10），117.2（C-2′），79.1（C-2），75.4（C-4），66.7（C-11），65.4（C-12），63.0（C-15），59.8（C-5′），48.6（C-5），48.0（C-13），43.8（C-4′），43.0（C-6），36.7（C-3），27.9（C-15），23.2（C-16），21.5（C-7），21.1（C-2″），18.9（C-6′），6.7（C-14）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［16］，故鑒定化合物10為verrol 4-acetate，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物11 無色固體，ESI-MSm/z：263［M+Na］+。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.16（1H，dd，J=6.0，4.0 Hz，H-6a），4.60（1H，ddd，J=7.9 Hz，6.5 Hz，3.9 Hz，H-6），3.19（1H，dd，J=6.1 Hz，1.0 Hz，H-3a），3.12（1H，dd，J=7.6 Hz，1.0 Hz，H-3），1.96（1H，m，H-8a），1.87（1H，m，H-8b），1.55（2H，m，H-9），1.50（3H，d，J=7.6 Hz，H-7），1.42（2H，m，H-10），1.36（2H，m，H-11），1.35（2H，m，H-12），0.94（3H，t，J=6.8 Hz，H-13）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：176.8（C-4），174.7（C-2），82.4（C-6），78.3（C-6a），49.0（C-3a），38.4（C-3），31.6（C-11），28.9（C-10），28.8（C-8），25.3（C-9），22.5（C-12），17.1（C-7），14.0（C-13）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［17］，故鑒定化合物11為（3S，3aS，6α，6aR）-dihydrosporothrioride，其結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物12 白色固體，ESI-MSm/z：189［M+Na］+。1H NMR（600 MHz，DMSO）δ：9.90（1H，s，4-OH），8.49（1H，s，6-OH），6.66（2H，s，H-5，7），5.82（1H，dd，J=8.2 Hz，4.0 Hz，H-4），5.45（1H，d，J=4.7 Hz，H-10），4.81（1H，d，J=12.1 Hz，H-15），5.81（2H，s，H-3）；13C NMR（150 MHz，DMSO）δ：170.8（C-1），159.6（C-6），153.0（C-4），127.0（C-4a），124.4（C-7a），108.0（C-7），100.6（C-7），67.9（C-3）。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致［18］，故鑒定化合物12為4，6-二羥基-1（3H）-異苯并呋喃，其結(jié)構(gòu)見圖1。

1.4 抗白色念珠菌活性研究

對分離鑒定的化合物進(jìn)行了抗白色念珠菌（Candida albicans，ATCC 24433）活性篩選，結(jié)果見表1。采用微量肉湯稀釋法［19］，將白色念珠菌菌懸液濃度用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至每毫升5×103CFU備用，用DMSO溶解化合物1~12后，再用RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行二倍量稀釋，使化合物的質(zhì)量 濃 度 分 別 為25，12.5，6.25，3.125，1.562 5，0.781 25，0.390 625μg/mL（DMSO＜1%）。氟康唑?yàn)殛栃詫φ?，設(shè)置其質(zhì)量濃度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5μg/mL。取配制好的白色念珠菌混懸液和系列質(zhì)量濃度的化合物1~12各100μL于96孔板中作為藥物組，取菌液100μL和RPMI 1640液體培養(yǎng)基100μL于96孔板中，用作生長對照組，取RPMI 1640液體培養(yǎng)基200μL于96孔板中作為空白對照組。將96孔板放置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀（540 nm）測試吸收度，計(jì)算其MIC50（抑制50%菌生長時所對應(yīng)的化合物濃度，與生長對照組相比）。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果（表1）顯示，化合物2、3、4、7和8對白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用，MIC50分別是0.318、0.218、0.047、0.569和0.558μg/mL。

2 結(jié)論

本研究從漆斑菌屬真菌固體發(fā)酵物的乙酸乙酯提取物中分離得到了12個化合物，其中化合物1、5、9~12為首次從漆斑菌屬真菌中分離得到，化合物2、3、4、7和8對白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用。

Table 1 MIC50 values of the twelve compounds