張文倩 華媛媛 范 靈 凌 麗 熊正愛(ài) 曾倩茹

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 重慶 400010)

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，由于卵巢位于盆腔深處，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，5年生存率僅30-40%，患者預(yù)后差。結(jié)合靶向治療的綜合治療卵巢癌是目前研究熱點(diǎn)之一，血管生成在腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要作用及抗血管生成治療得到極大關(guān)注。卵巢腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)都依賴于新生血管生成提供養(yǎng)料和氧氣。缺氧、血管損傷、促血管生成因子等多種因素誘發(fā)血管生成，其中缺氧是血管生成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[2]。缺氧環(huán)境下缺氧誘導(dǎo)因子1-α（hypoxia inducible factor 1α， HIF-1α）轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞生成多種促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）家族尤其是VEGF-A、VEGFR2、血管生成素2（angiopoietin 2， ANGPT2）[2]等，VEGF-A除在腫瘤血管生成發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]外，還促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值[3]。

核因子90（nuclear factor 90，NF90，也稱為DRBP76和NFAR1）和NF110（也稱為IL3、NFAR2和TCP110）是白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子3（interleukin enhancer binding factor 3，ILF3）差異性剪接生成的主要產(chǎn)物[4][5][6]，分子量分別為90kDa和110kDa。NF90在肝細(xì)胞癌[7]、鼻咽癌[5]、宮頸癌[8]、卵巢癌[9]、胃癌[10]等惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，其作用被廣泛研究，但與卵巢癌血管生成的關(guān)系少有報(bào)道。本研究探尋NF90在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲減NF90對(duì)卵巢癌細(xì)胞VEGF-A表達(dá)的影響，為后期深入研究提供實(shí)驗(yàn)思路。

一、材料與方法

（一）Oncomine檢索ILF3 mRNA在卵巢癌組織表達(dá)情況

Oncomine(www.oncomine.org)是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，擁有最全的癌癥突變譜、基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及相關(guān)的臨床信息，可利于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物或新的治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)檢索“ILF3”分析ILF3 mRNA在包含卵巢癌在內(nèi)的常見(jiàn)惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況，從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選基因，在本研究中設(shè)置檢索條件為：1.Gene： ILF3，2.Analysis Type： Ovarian Cancer vs. Normal Analysis，3.Data Type： mRNA， 4.Over-expression.

（二）Human Protein Atlas檢索ILF3蛋白在卵巢癌組織表達(dá)情況

Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)是利用基于抗體的成像、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)整合各種人類蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)。Human Protein Atlas包括組織圖譜、細(xì)胞圖集和病理學(xué)圖譜，其中，組織圖譜顯示蛋白質(zhì)跨越人體所有主要組織和器官的分布，細(xì)胞圖集顯示蛋白質(zhì)在單細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，病理學(xué)圖譜顯示蛋白質(zhì)水平對(duì)患者癌癥的患者存活的影響。本研究利用Human Protein Atlas中的組織圖譜檢索ILF3轉(zhuǎn)錄蛋白（NF90和NF110）在卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌、漿液性腺癌和正常卵巢組織中的表達(dá)情況。

（三）慢病毒構(gòu)建

攜帶NF90干擾序列基因的重組慢病毒購(gòu)于漢恒生物有限公司（上海，中國(guó)）。其中陰性對(duì)照插入的片段scramble為一段亂序不針對(duì)任何人或鼠的shRNA，干擾載體為pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro。

（四）細(xì)胞培養(yǎng)、構(gòu)建缺氧模型及慢病毒轉(zhuǎn)染

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞采用含10%胎牛血清（Ausbian，澳大利亞）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)定為5%CO2、37℃。

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入無(wú)血清培養(yǎng)基孵育過(guò)夜。次日，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入CoCl2工作液避光孵育構(gòu)建化學(xué)缺氧模型。

對(duì)數(shù)期SKOV-3經(jīng)細(xì)胞胰酶常規(guī)消化后按1×105個(gè)/孔接種于6孔板，常規(guī)孵育過(guò)夜。次日采用4小時(shí)小體積感染法進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，即棄原培養(yǎng)基，加入1/2（即500μl）體積無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的慢病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，37℃孵育4h后補(bǔ)齊無(wú)血清培養(yǎng)基至正常體積（即1ml）。轉(zhuǎn)染24h后，棄病毒培養(yǎng)基，改為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72小時(shí)候，熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率。用puromycin篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，避光孵育，連續(xù)篩選2周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。同時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

（五）Western blot

RIPA裂解液、PMSF和磷酸酶抑制劑按體積比100：1：1充分混勻后裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法200V恒壓轉(zhuǎn)膜2小時(shí)；將含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫封閉2小時(shí)；用相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次后二抗室溫孵育1小時(shí)；再次用TBST洗膜3次后進(jìn)行ECL成像。使用Image lab軟件進(jìn)行各條帶灰度值的半定量分析，以β-tubulin為參照，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

（六）細(xì)胞上清液中VEGF-A濃度測(cè)定

利用ELISA測(cè)定卵巢癌細(xì)胞上清液中VEGF-A的濃度。步驟為：1.經(jīng)NF90/shRNA-control（Control）或NF90-shRNA(shNF90)轉(zhuǎn)染后的SKOV-3細(xì)胞用CoCl2缺氧誘導(dǎo)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基后3000rpm離心20min后收集上清液。根據(jù)說(shuō)明書按上樣—孵育—洗板—加檢測(cè)抗體—洗板—加酶標(biāo)試劑—洗板—顯色—終止—測(cè)定OD值。根據(jù)OD值計(jì)算各組細(xì)胞上清液中VEGF-A的濃度，設(shè)置濃度調(diào)平基準(zhǔn)為pg/ml/2×106cell。

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

服從正態(tài)分布的連續(xù)性變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±standa rd）表示。兩組間均數(shù)比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Unpaired Student’s t-tests），多組間均數(shù)行單因素方差分析（One-way ANOVA），以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，符合方差齊性檢驗(yàn)組，使用Bonferonni方法分析，不符合方差齊性檢驗(yàn)者，使用Dunnett’s T3分析，SNK法行事后兩兩比較。p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism軟件作圖。

二、結(jié)果

（一）NF90在卵巢癌組織中表達(dá)升高

NF90在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中分析NF90在卵巢癌中的表達(dá)情況，共納入7個(gè)數(shù)據(jù)集，包含1043個(gè)臨床樣本，包括卵巢漿液性腺癌、卵巢透明細(xì)胞腺癌、卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌、卵巢粘液性腺癌和正常卵巢組織的比較。分析發(fā)現(xiàn)，NF90在多種卵巢組織中高表達(dá)（median rank=2541， P=0.005），分析發(fā)現(xiàn)卵巢漿液性腺癌中NF90表達(dá)最高（圖1）。在TCGA數(shù)據(jù)中分析發(fā)現(xiàn)在卵巢漿液性現(xiàn)在中ILF3基因表達(dá)較正常卵巢組織顯著升高（P=4.39E-9，fold change=1.870，圖2A）?；诖?，進(jìn)一步檢索Human protein atlas(www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)ILF3蛋白在卵巢漿液性腺癌和內(nèi)膜樣腺癌中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在正常卵巢組織中陰性表達(dá)（圖2B），與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果一致。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中NF90在卵巢癌組織中的表達(dá)的meta分析Fig.1 The meta-analysis of the expression of NF90 in ovarian cancer in the Oncomine database

圖2 NF90和NF110在卵巢癌組織中過(guò)表達(dá)Fig.2 NF90 and NF110 are upregulated in human ovarian cancer specimens

（二）缺氧環(huán)境下NF90與VEGF-A蛋白表達(dá)具有相關(guān)性

VEGF-A是血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)之一，本研究采取VEGF-A蛋白表達(dá)作為血管生成的指標(biāo)。SKOV-3細(xì)胞經(jīng)饑餓處理后用CoCl2化學(xué)缺氧，發(fā)現(xiàn)SKOV-3細(xì)胞經(jīng)CoCl2處理后HIF-1α、VEGF-A和NF90表達(dá)均升高，而NF110無(wú)明顯變化（圖3）。

圖3 缺氧條件下NF90、HIF-1α和VEGF-A表達(dá)情況Fig.3 The protein expression of NF90， HIF-1α， and VEGF-A after cultured with CoCl2.

（三）Western blot驗(yàn)證敲減NF90后HIF-1α和VEGF-A蛋白表達(dá)降低

將SKOV-3細(xì)胞經(jīng)NF90/shRNA-control(Control)、NF90/shRNA(shNF90)轉(zhuǎn)染后，經(jīng)CoCl2缺氧刺激模擬細(xì)胞缺氧環(huán)境，提取蛋白，WB驗(yàn)證HIF-1α、VEGF-A、NF110、NF90蛋白表達(dá)情況，以β-tubulin蛋白作為內(nèi)參。

CoCl2刺激后，SKOV-3細(xì)胞中HIF-1α、VEGF-A和NF90蛋白表達(dá)升高；Control組中HIF-1α、VEGF-A和NF90蛋白與未轉(zhuǎn)染經(jīng)CoCl2刺激組無(wú)明顯差異；與Control組相比，shNF90組HIF-1α、VEGF-A和NF90蛋白表達(dá)明顯降低。各組中NF110蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（圖4）。

圖4 干擾/過(guò)表達(dá)NF90后HIF-1α和VEGF-A表達(dá)情況Fig.4 The protein expression of HIF-1α and VEGF-A after knockdown/overexpression of NF90.

（四）ELISA檢測(cè)缺氧環(huán)境下SKOV-3細(xì)胞上清液中VEGF-A濃度

VEGF-A為分泌性蛋白，收集慢病毒轉(zhuǎn)染、缺氧誘導(dǎo)下SKOV-3細(xì)胞的上清液，使用VEGF-A ELISA試劑盒測(cè)定各組上清液中VEGF-A的濃度，進(jìn)一步驗(yàn)證NF90與VEGF-A表達(dá)的相關(guān)性。

CoCl2誘導(dǎo)缺氧環(huán)境下，SKOV-3細(xì)胞上清液中VEGF-A濃度是無(wú)缺氧下SKOV-3細(xì)胞上清液的2.334倍（1104.193±18.537pg/ml vs 471.331±37.697pg/ml，p＜0.05）。與Control組細(xì)胞上清液相比，shNF90組細(xì)胞上清液中VEGF-A濃度降低了約57.6%（510.978±25.191pg/ml vs 1204.095±89.267pg/ml，p＜0.05）。

圖5 干擾NF90引起SKOV-3細(xì)胞上清液中VEGF-A濃度下降Fig.5 Knockdown of NF90 decreases of the secretion of VEGF-A in CoCl2， *p ＜0.05， compared with SKOV-3 without CoCl2， #p＜0.05， compared with Control group.

三、討論

NF90和NF110具有不同的C-端和細(xì)胞內(nèi)定位，NF110全部位于細(xì)胞核內(nèi)，作用受到極大限制[11]；而NF90一部分可與RNA相互作用定位于細(xì)胞核，另一部分通過(guò)與核糖核胞質(zhì)接觸位于細(xì)胞質(zhì)，參與調(diào)控DNA代謝[12]、轉(zhuǎn)錄[13][14]、翻譯[15][16]、mRNA穩(wěn)定[7][17]以及多種病毒復(fù)制和基因表達(dá)[18][19][20]。NF90在多種惡性腫瘤的作用被廣泛研究：在宮頸癌中通過(guò)p53/p21信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤增殖[21]，通過(guò)PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF-A信號(hào)通路促進(jìn)血管生成[8]；在肝細(xì)胞癌中通過(guò)與cyclin E1 mRNA結(jié)合加速細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]；在乳腺癌中通過(guò)維持尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）表達(dá)促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移[22]，通過(guò)增強(qiáng)VEGF mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)血管生成[23]。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)在NF90過(guò)表達(dá)抑制裸鼠卵巢癌模型細(xì)胞增殖，NF90/NF110通過(guò)控制嵌入在DICER前體mRNA中的miR-3173的加工促進(jìn)DICER表達(dá)，而miR-3173的過(guò)表達(dá)以NF90和DICER依賴性方式顯著增加轉(zhuǎn)移，提出通過(guò)促進(jìn)DICER表達(dá)，NF90可以作為卵巢癌的抑制因子[24]。

本研究應(yīng)用Oncomine和Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)NF90在卵巢癌，尤其是卵巢漿液性癌和內(nèi)膜樣腺癌中表達(dá)顯著升高。體檢實(shí)驗(yàn)構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞SKOV-3缺氧模型，進(jìn)一步探討NF90對(duì)卵巢癌血管生成的影響，結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)NF90、HIF-1α和VEGF-A表達(dá)顯著升高；干擾NF90后，SKOV-3細(xì)胞HIF-1α和VEGF-A蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞上清液中VEGF-A濃度下降。

綜上，NF90在卵巢癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)誘導(dǎo)VEGF-A表達(dá)促進(jìn)卵巢癌血管生成，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，為以后多靶點(diǎn)抗血管生成治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)思路。