韓永先，林 華，廖搏浪，胡如久，蘇 源，楊明明(西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊陵 712100)

益生菌是一類能夠促進腸道健康的活微生物[1]。許多研究表明，益生菌不僅可以預防腸道病原體定植，增強免疫系統(tǒng)[2-3]，而且能夠通過改善動物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和腸道微生態(tài)平衡來促進動物健康[4-5]。因此，全面發(fā)掘益生菌的功能對動物腸道健康有重要意義。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性細菌，因其遺傳背景清晰，在飼料加工中穩(wěn)定性好，活性高，已成為目前應用最廣泛的飼用益生菌制劑之一[6]。芽孢桿菌能夠提高小鼠分泌IgG的含量，增強體液免疫功能[7]，還能提高腸系膜淋巴組織分泌促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子[8-9]，從而平衡炎癥反應，促進動物腸道健康。然而，關(guān)于B.subtilis如何引發(fā)免疫調(diào)節(jié)作用的詳細機制尚未得到廣泛研究。近年來，一些研究報道了細菌、真菌和寄生蟲產(chǎn)生的細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)，具有介導細菌-宿主間的相互交流、呈遞細菌抗原和調(diào)節(jié)宿主免疫功能等作用，因而受到廣泛關(guān)注[10-11]。對細菌胞外囊泡的相關(guān)研究主要集中在革蘭氏陰性菌分泌的外膜囊泡(OMVs)。在過去10年中，OMVs被認為是向靶細胞提供毒力和免疫調(diào)節(jié)因子的信號載體[12-13]。然而革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性細菌不同，其細胞壁主要由肽聚糖組成，沒有外膜。但Dorward等[14]為革蘭氏陽性菌釋放胞外囊泡提供了首個證據(jù)。隨后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)潰瘍桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌和雙歧桿菌等革蘭氏陽性菌均可釋放胞外囊泡[15-18]。近年研究發(fā)現(xiàn)，B.subtilis也能夠釋放EVs，經(jīng)過蛋白組學分析，此菌株囊泡富含30種蛋白質(zhì)，這些蛋白多數(shù)與囊泡的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[19]。巨噬細胞是源自骨髓前體的單核吞噬細胞，是先天性和適應性免疫反應的關(guān)鍵參與者[20]，也是體外研究最常用的細胞模型之一。本研究通過檢測不同濃度B.subtilis來源的胞外囊泡(BS_EVs)刺激巨噬細胞后產(chǎn)生的免疫細胞因子水平和免疫相關(guān)酶活水平，探究其對巨噬細胞免疫應答的影響，為B.subtilis的免疫調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株與細胞株

枯草芽孢桿菌B.subtilis168為本實驗室保存，RAW 264.7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要儀器設備

恒溫搖床；高速冷凍離心機(美國Thermo)；超速離心機(美國 貝克曼)；Nanosight NS 300納米顆粒跟蹤分析儀(英國 馬爾文)；高速轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦(英國安道爾公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立S-4800)。

1.3 細菌培養(yǎng)

B.subtilis168接種于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h，然后挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基中在搖床進行37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.4 細胞培養(yǎng)

RAW 264.7細胞系用60 mm培養(yǎng)皿在完全PRMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃和5%CO2，培養(yǎng)基每24 h更換1次，細胞每48 h傳代1次。連續(xù)傳代培養(yǎng)2次后，將1×105個細胞/mL的濃度接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔加2 mL培養(yǎng)基(細胞懸液和新鮮完全培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng) ，為后續(xù)試驗做準備。

1.5 BS_EVs的分離與鑒定

將過夜培養(yǎng)好的B.subtilis168離心(12 000 g，20 min，4 ℃)除去菌泥，使用真空過濾裝置將上清液通過0.45 μm孔徑的過濾器過濾，可去除大顆粒，比如殘留細菌和細胞碎片。然后通過裝有100 kDa膜的Amicon超濾系統(tǒng)濃縮上清液。將濃縮好的上清液再次通過0.22 μm過濾器過濾以除去殘留的細菌，最終利用超速離心(180 000 g，2 h，4 ℃)來制備EVs。為了使得到的EVs更加純凈、均一，采用OptiPrep(60% Density Gradient Medium，Sigma)密度梯度離心。密度梯度離心液濃度范圍為10%～55%，即分為10層，每層溶液濃度相差5%。首先將EVs-PBS混合液與60%密度梯度液混合成55%的溶液，然后加入離心管底部，其余密度梯度液自下而上依次鋪入離心管中，此時離心管中呈現(xiàn)10層界限較分明的溶液。操作完成后進行超速離心(200 000 g，16 h，4 ℃)，離心完成后，將每一層溶液取出測其粒徑大小及含量分布，取出試驗目標物再離心1次，此時得到的沉淀就是純化后的EVs。將EVs重懸于PBS中并儲存在-80℃下用于隨后的試驗。通過納米顆粒跟蹤分析儀測定EVs的粒徑分布，并且用掃描電子顯微鏡觀察EVs的形態(tài)特征。利用BCA試劑盒(目錄號T9300A，TaKaRa)測定EVs的蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)。

1.6 BS_EVs刺激RAW 264.7細胞試驗

將6孔板中培養(yǎng)至單層的RAW 264.7細胞用PBS溶液洗滌3次并加入2 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，試驗組分別加入1、2、4、8和16 μg/mL的BS_EVs(即EVs1、EVs2、EVs4、EVs8、EVs16組)，對照組加入等體積的PBS(PBS組)。置于37 ℃ 5%的細胞培養(yǎng)箱12 h。結(jié)束后用臺盼藍排除檢測法測定細胞存活率，收集上清液并測定IL-10、TGF-β、TNF-α、IL-6和乳酸脫氫酶(LDH)活性，用10%的TritonX-100裂解細胞，測定酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。細胞因子用ELISA試劑盒(武漢云克隆公司)檢測，相關(guān)酶活均采用測試盒(購于南京建成生物工程研究所)檢測。本試驗設置6個處理，每個處理3個重復，共3次獨立重復試驗。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，one-way ANOVA進行方差分析，用Duncan法進行多重比較。數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BS_EVs的分離、純化與鑒定

將超速離心后獲得的BS_EVs進行密度梯度離心，采用納米顆粒跟蹤分析儀測定各密度層BS_EVs的濃度，計算各層BS_EVs相對豐度，結(jié)果(圖1 A)顯示BS_EVs主要集中在F3～F5，所以選擇濃度梯度在20%～30%的密度層進行超速離心富集得到純化的BS_EVs。純化后的BS_EVs大小主要為85 nm，且其粒徑范圍在50～200 nm(圖1 B)。在掃描電鏡下(圖1 C)可以看到，BS_EVs的形態(tài)大小不一，呈圓形或橢圓形，直徑平均為50～100 nm，符合細菌囊泡的理論大小值。

圖1 BS_EVs的分離、純化與鑒定A.密度梯度離心測定各層顆粒的相對豐度；B.納米顆粒跟蹤分析儀檢測純化的BS_EVs粒徑分布； C.掃描電鏡檢測BS_EV形態(tài)。標尺為100 nmFig. 1 Isolation, purification and identification of BS_EVsA. The relative number of particles in each fraction determined by density gradient centrifugation; B. Size distribution of BS_EVs as determined by nanoparticle tracking analysis; C. BS_EVs were visualized using scanning electron microscope. Bar=100 nm

采用BCA法對純化的BS_EVs進行蛋白定量，結(jié)果顯示1×1010particles/mL的BS_EVs的蛋白含量為5.1 μg/mL。

2.2 BS_EVs對RAW 264.7細胞活性的影響

LDH是一種胞內(nèi)酶，當細胞膜受損后就會被大量釋放到胞外。通過采用臺盼藍染色試驗和胞外LDH活性測定來檢測BS_EVs對RAW 264.7細胞存活率的影響。由表1可知，與對照組相比，EVs1、2和4組細胞存活率無顯著性差異(P>0.05)，EVs8和16組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。EVs1、2和4組LDH活性無顯著差異(P>0.05)，而EVs8和16兩組胞外LDH活性顯著升高(P<0.05)。這表明較低劑量(本試驗中的1、2和4 μg/mL)BS_EVs對RAW264.7沒有毒性，而較高劑量(本試驗中的8和16 μg/mL)可造成RAW 264.7細胞膜嚴重損傷，顯著降低細胞活力。

表1 BS_EVs對RAW 264.7細胞存活率和胞外 LDH活性的影響Table 1 Effects of BS_EVs on cell viability and extracellular LDH activity of RAW 264.7 cells

2.3 BS_EVs對RAW 264.7細胞免疫相關(guān)酶活性的影響

為了探究BS_EVs是否能夠激活RAW 264.7細胞，檢測了BS_EVs刺激后RAW 264.7細胞胞內(nèi)酶活性的變化。由表2可知，與對照組PBS相比，5個BS_EVs組巨噬細胞內(nèi)ACP活性顯著增加(P<0.05)，且EVs2和4組ACP活性最高；EVs1、2和4組胞內(nèi)LDH活性顯著高于對照組(P<0.05)，EVs8組的胞內(nèi)LDH活性無顯著變化(P>0.05)，而EVs16組的胞內(nèi)LDH活性顯著降低(P<0.05)；各BS_EVs刺激組胞內(nèi)iNOS活性顯著高于對照組(P<0.05)，且EVs2、4和8組iNOS活性顯著高于其他兩個組(P<0.05)；與對照組相比，EVs1、2、4和8組胞內(nèi)SOD活性無顯著差異(P>0.05)，而EVs 16組SOD活性顯著降低(P<0.05)。

表2 BS_EVs對RAW 264.7細胞免疫相關(guān)酶活的影響Table 2 Effects of BS_EVs on ACP, LDH, iNOS and SOD activities in RAW 264.7 cells

2.4 BS_EVs對RAW 264.7細胞分泌細胞因子的影響

通過檢測BS_EVs刺激后促炎性細胞因子(IL-6、TNF-α)和抗炎性細胞因子(IL-10、TGF-β)來評定巨噬細胞對BS_EVs的應答反應。由表3可知，BS_EVs刺激顯著提高了促炎性細胞因子IL-6和TNF-α的分泌量(P<0.05)，且隨著BS_EVs劑量的增加而顯著提高。BS_EVs刺激同時也顯著提高了抗炎性細胞因子IL-10和TGF-β含量(P<0.05)，其中EVs4、8組IL-10分泌量和EVs4組的TGF-β分泌量要顯著高于其它BS_EVs刺激組(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，BS_EVs刺激同時激活了RAW 264.7細胞的促炎和抗炎應答反應。

表3 BS_EVs對RAW 264.7細胞分泌細胞因子的影響Table 3 Effects of BS_EVs on the secretion of cytokines in RAW 264.7 cells pg/mL

3 討 論

3.1 BS_EVs的分離、純化和鑒定

大多數(shù)細胞，包括真核生物、革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌以及古生菌，都能分泌納米大小的囊泡[21-22]。本試驗研究的是革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌168來源的胞外囊泡，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)這類囊泡的粒徑大小在50～100 nm，此結(jié)果與前人的報道結(jié)果類似[19]。而囊泡分離方式的差異可能造成其大小和形態(tài)的不同。胞外囊泡的分離方式多樣，包括超速離心法、超濾法(基于粒徑大小)、膜親和試劑盒法、沉淀法和微流術(shù)法[23]，且都是針對真核細胞，對于原核細胞囊泡的分離沒有系統(tǒng)的報道。本研究經(jīng)過長時間的方法摸索，用超速離心法分離胞外囊泡，主要操作步驟參考Prados-Rosales等[24]的研究以及結(jié)合B.subtilis168本身生長特點總結(jié)出一套較完整的分離方法。其中，BS_EVs的純化采用密度梯度離心法，此方法可以將不同粒徑大小的胞外囊泡歸類，將不同密度層的EVs相對豐度計算出來。本試驗結(jié)果顯示BS_EVs主要集中在20%～30%密度層，這與真核細胞分泌外泌體情況相似[25]。密度層相近的EVs的粒徑大小和形態(tài)也較相似，因此從掃描電鏡的結(jié)果可以看到，枯草芽孢桿菌菌株168分泌的囊泡濃度較大，且粒徑大小比較均一。然而，由于細菌囊泡生物特性復雜導致其純化方法耗時費力，如何快速高效的得到純凈的胞外囊泡還需后期繼續(xù)研究。

3.2 BS_EVs對RAW 264.7細胞活性的影響

由于安全是益生菌的基本要求，所以安全應該是評估益生菌時的第一個項目。該研究使用臺盼藍排斥試驗和乳酸脫氫酶毒性試驗來研究BS_EVs對巨噬細胞活力的影響。臺盼藍試驗結(jié)果表明低濃度EVs對巨噬細胞沒有明顯毒性作用，對細胞的生長來說是安全的。而高濃度EVs有降低細胞存活率的現(xiàn)象，此結(jié)果與EVs對巨噬細胞胞外LDH活性的影響一致。細胞膜通透性的增加總是伴隨著細胞死亡[26]，這將導致LDH的滲漏[27]。LDH是一種穩(wěn)定的胞質(zhì)酶，存在于所有細胞中[28]，如果細胞膜受損，LDH將釋放到胞外空間。因此，胞外LDH含量的增加是測量細胞膜損傷的指標之一[29]。本試驗結(jié)果表明EVs8和16嚴重破壞巨噬細胞的細胞膜完整性，導致LDH大量流向胞外，而低濃度BS_EVs較好的維持了巨噬細胞的正常代謝狀況。

3.3 BS_EVs對RAW 264.7細胞免疫相關(guān)酶活的影響

巨噬細胞(MΦ)是初始免疫系統(tǒng)中的主要參與者，從胃腸道和呼吸道黏膜進入機體的病原微生物首先遇到的免疫細胞是粘膜下組織的MΦ。MΦ組成性表達多種PRR，病原微生物通過與PRR作用而粘附在MΦ表面形成吞噬體，然后與溶酶體融合形成溶酶體酶，隨即在多種溶酶體酶的作用下，病原體微生物被殺死[30]。所以，溶酶體酶是MΦ吞噬和消化異物的重要組成系統(tǒng)。ACP是一種水解酶，存在于溶酶體中，是其標志酶，所以ACP的升高反映了MΦ被激活的程度[31]。LDH是一種糖酵解酶，存在于MΦ胞質(zhì)中，其功能是催化乳酸脫氧成為丙酮酸或丙酮酸還原為乳酸，在MΦ吞噬過程中其能量來源主要通過糖酵解途徑，糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸使細胞胞內(nèi)pH下降有利于溶酶體酸發(fā)揮作用[32]，故其活性通常也被認為是被激活的標志之一[33-34]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組EVs顯著升高巨噬細胞胞內(nèi)ACP活性，低濃度組EVs組顯著提高胞內(nèi)LDH活性，表明低濃度組EVs均能激活MΦ的吞噬功能；而EVs 16組顯著降低胞內(nèi)LDH活性，表明高濃度EVs可能破壞了細胞膜完整性，導致LDH外泄。免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞可被活化而引起表達，進而產(chǎn)生高量的NO，是巨噬細胞阻殺微生物及癌細胞的主要武器。Han等[35]研究發(fā)現(xiàn)，敲除iNOS基因的小鼠對多種胞內(nèi)病原菌高度敏感。本試驗結(jié)果表明各EVs組均能提高巨噬細胞iNOS活性，且EVs1、2和4組效果最佳，說明BS_EVs能活化巨噬細胞誘導表達iNOS，從而提高巨噬細胞抗菌能力。另外，EVs16組SOD活性顯著降低，其他各組無顯著差異，說明BS_EVs對巨噬細胞的抗氧化酶的產(chǎn)生無影響，且高濃度EVs組可能會減弱巨噬細胞的抗氧化應激。

3.4 BS_EVs對RAW 264.7細胞分泌細胞因子的影響

大多數(shù)炎癥反應是先天免疫的結(jié)果，是通過巨噬細胞，多形核白細胞和肥大細胞激活促炎信號級聯(lián)引發(fā)的[36]。細胞因子是由細胞產(chǎn)生的小分子可溶性蛋白質(zhì)，它們主要調(diào)節(jié)宿主的免疫反應，造血功能和炎癥反應，其中參與炎癥反應的細胞因子分為2種主要類型：促炎因子(TNF-α、IFN-γ 、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12)和抗炎因子(IL-4、IL-10、IL-13)[37]。在本試驗中，未加BS_EVs刺激時，巨噬細胞分泌的細胞因子含量很低，試驗處理組用EVs刺激后，巨噬細胞分泌促炎性細胞因子IL-6和TNF-α的水平隨著EVs濃度的升高而升高。同時，各濃度EVs也顯著促進了抗炎因子IL-10和TGF-β的產(chǎn)生，IL-10是II型細胞因子，被認為是介導免疫抑制的細胞因子[38]。TGF-β是Treg相關(guān)細胞因子(負調(diào)控)介導免疫抑制或免疫無能[39]。此現(xiàn)象表明，BS_EVs同時增加了促炎因子和抗炎因子的產(chǎn)生，平衡了炎癥反應，維持了免疫穩(wěn)態(tài)。這與有些研究報道結(jié)果一致[11]。另外，EVs16組刺激細胞產(chǎn)生促炎因子的含量高于EVs4和8組，但是抗炎因子含量卻低于EVs4和8組，說明高濃度BS_EVs極大增強了巨噬細胞的促炎反應。

4 結(jié) 論

低劑量(1、2和4 μg/mL)BS_EVs對RAW 264.7細胞活力沒有顯著影響，而較高劑量(8和16 μg/mL)顯著降低細胞活力。適量BS_EVs(2和4 μg/mL)可提高RAW 264.7細胞ACP、LDH活性和NO信號通路，即提高了免疫反應相關(guān)酶活。

BS_EVs可同時增強RAW 264.7細胞的促炎反應和抗炎反應，本試驗中低劑量組BS_EVs對抗炎反應的增強程度大于促炎反應，更有利于增強巨噬細胞的抗炎功能，高劑量組則相反。因此，適量BS_EVs可通過提高巨噬細胞免疫相關(guān)酶活、調(diào)節(jié)細胞因子分泌量來增強其免疫功能。