韋碧薇，龔雅慧，蘇 州，楊慧瑩，覃蒙斌，梁志海*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021； 2.荊州市中心醫(yī)院 兒科， 湖北 荊州 434020；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 廣西 南寧 530007)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥，其發(fā)病機(jī)制有多種，胰腺導(dǎo)管上皮屏障的完整性被破壞是AP發(fā)生的主要啟動(dòng)因素之一[1]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白家族的成員，上調(diào)TRAF6可使核因子κB(NF-κB)亞基從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)促炎因子成熟產(chǎn)生炎性反應(yīng)，誘發(fā)重癥急性胰腺炎(sever acute pancreatitis，SAP)[2]。有研究表明，NF-κB信號(hào)通路激活可以導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管上皮屏障損傷[3]。因此，TRAF6可能是NF-κB信號(hào)通路上損害胰腺導(dǎo)管上皮屏障的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)TRAF6進(jìn)行調(diào)控也許可以影響胰腺導(dǎo)管上皮屏障損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以通過(guò)多種途徑調(diào)控炎性反應(yīng)，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。使用Targetscan檢索發(fā)現(xiàn)miR-125b與TRAF6的3′ UTR端位于1 276～1 283的堿基位點(diǎn)上有互補(bǔ)堿基序列。但目前有關(guān)miR-125b在TRAF6參與胰腺導(dǎo)管上皮屏障損傷的作用尚不清楚。故本研究擬探討TRAF6調(diào)控胰腺導(dǎo)管上皮屏障的機(jī)制、miR-125b與TRAF6靶向結(jié)合關(guān)系，以期為AP的發(fā)病機(jī)制研究提供新觀(guān)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6C7(廣州吉妮歐生物公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒:RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)；Polybrenne及enhanced infection solution(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)；慢病毒載體和陰性病毒液(南寧維爾凱生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa公司)；兔抗TRAF6抗體和山羊抗兔二抗(Abcam公司)；兔抗-occludin、-claudin-1、-NF-κB p65、-TAK1及TAB1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；Western blot實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑(北京索萊寶科技有限公司)；FITC-D(Sigma-Aldrich公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因載體和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理： 復(fù)蘇后的HPDE6C7細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h更換次培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合至80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。將HPDE6C7細(xì)胞分為：對(duì)照(control)組、TRAF6高表達(dá)感染(TRAF6)組和空載慢病毒感染(blank)組。感染6 h后進(jìn)行換液，TRAF6組換用DEME培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中TRAF6的mRNA表達(dá)： 收集處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，并測(cè)定其濃度和純度。RNA反轉(zhuǎn)錄按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，獲得cDNA，再行PCR(SYBRGree染料法)擴(kuò)增。TRAF6的上游引物序列為5′-CGCGCATAGAACGACAAG-3′，下游引物序列為5′-TTTCCAGGGGTGGGTCAAAC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，下游引物序列為5′-GACTCCACGACGTACTCAGC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值，采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)： 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成置于5%脫脂牛奶中封閉45 min，放入一抗中4 ℃孵育過(guò)夜，次日室溫孵育二抗1 h。使用Odyssey系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描和分析。

1.2.4 檢測(cè)各組細(xì)胞的單層細(xì)胞通透率： 取各組處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，消化后將細(xì)胞調(diào)整至3×105個(gè)/mL，分別取100 μL加入Transwell小室上室中進(jìn)行培養(yǎng)。4 d后，用PBS潤(rùn)洗小室3次，加入適量PBS浸泡小室，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，充分清洗細(xì)胞表面雜質(zhì)。吸凈PBS，于上室加入異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluoresceine isothiocyanate-dextran, FITC-D)，下室加入PBS，室溫孵育1 h。將Transwell小室下室中的PBS溶液轉(zhuǎn)移至96孔板，熒光分光光度計(jì)測(cè)定各孔熒光強(qiáng)度。相對(duì)通透率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔熒光值-空白孔熒光值)/(對(duì)照孔熒光值-空白孔熒光值)×100%。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-125b與TRAF6的靶向結(jié)合關(guān)系： 利用Targetscan預(yù)測(cè)TRAF6基因3′UTR區(qū)第1276-1283號(hào)堿基與has-miR-125b-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。合成包含TRAF6基因3′UTR與has-miR-125b-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(wild-type，WT)序列和突變(mutant，mut)序列，長(zhǎng)度均為209 bp。構(gòu)建TRAF6-WT質(zhì)粒和TRAF6-mut質(zhì)粒，利用Lipofectamin 3000將雙熒光素酶質(zhì)粒和miR-125b模擬物mimics共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并分別設(shè)立對(duì)照，4個(gè)組分別為T(mén)RAF6-WT+mimic control組、TRAF6-WT+miR-125b mimic組、TRAF6-mut+mimic control組和TRAF6-mut+miR-125b mimic組；轉(zhuǎn)染48 h后，計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TRAF6轉(zhuǎn)染HPDE6C7細(xì)胞的效果

感染HPDE6C7細(xì)胞TRAF6基因后，TRAF6組中TRAF6基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和blank組(P<0.05)(圖1)。

2.2 上調(diào)TRAF6對(duì)HPDE6C7細(xì)胞相關(guān)因子的影響

與對(duì)照組相比，TRAF6組的NF-κB p65、TAK1和TAB1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。相反，occludin和claudin-1蛋白顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 單層HPDE6C7細(xì)胞FITC-D通透率的測(cè)定

上調(diào)TRAF6基因后，TRAF6組單層細(xì)胞通透率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

2.4 miR-125b與TRAF6的靶向結(jié)合關(guān)系的驗(yàn)證

TRAF6-WT+miR-125b mimic組與TRAF6-WT+mimic control組比，熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)(圖4)。

3 討論

AP是常見(jiàn)的胰腺炎性疾病，以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和胰腺壞死為特征。當(dāng)進(jìn)展為SAP，可出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征、多器官功能衰竭等多種嚴(yán)重并發(fā)癥[5]。胰腺導(dǎo)管上皮屏障是由胰管上皮細(xì)胞及其分泌黏液組成，其在生理狀態(tài)下防止膽汁、胰蛋白酶等反流進(jìn)入胰腺實(shí)質(zhì)，同時(shí)防止胰液中HCO3-反流入血液[1]。胰腺相鄰細(xì)胞間連接有緊密連接(tight junction，TJ)、橋粒、黏附連接和縫隙連接等， 胰管上皮細(xì)胞間的TJ是維持胰腺導(dǎo)管上皮屏障完整性的主要連接方式，能防止炎性介質(zhì)侵入胰腺組織[6]。TRAF6是一種泛素連接酶，可介導(dǎo)急慢性炎性疾病的發(fā)生。被上游信號(hào)激活后，TRAF6與泛素偶聯(lián)酶復(fù)合物一起作用，激活包括TAB1在內(nèi)的TAK1復(fù)合物，進(jìn)而磷酸化和激活I(lǐng)κB激酶，啟動(dòng)NF-κB入核，最后產(chǎn)生炎性反應(yīng)[7-8]。細(xì)胞間通透性是上皮屏障功能的重要組成部分，利用Transwell小室可檢測(cè)細(xì)胞間通透性[9]。有研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，激活NF-κB信號(hào)通路可以增加細(xì)胞間通透性并損傷上皮屏障功能[10-11]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)激活NF-κB信號(hào)通路可促使胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞間TJ減弱，胰管上皮屏障損傷以及通透性增加[12]。因此，本研究旨在探討TRAF6能否作為關(guān)鍵蛋白通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路引起AP發(fā)病的胰腺導(dǎo)管上皮屏障受損。

A.mRNA expression of TRAF6; B,C.protein expression of TRAF6; *P<0.05 compared with control and blank group圖1 各組HPDE6C7細(xì)胞TRAF6的表達(dá)量Fig 1 Expressions levels of TRAF6 in HPDE6C7 n=3)

*P<0.05 compared with control group圖2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB p65、TAK1、TAB1、occludin和claudin-1蛋白表達(dá)

*P<0.05 compared with control group圖3 各組單層HPDE6C7細(xì)胞的相對(duì)通透率Fig 3 Relative permeability in monolayer HPDE6C7

*P<0.05 compared with TRAF6-WT+mimic control group圖4 miR-125b與TRAF6基因的靶向關(guān)系Fig 4 Targeted binding of miR-125b and TRAF6

miRNAs是一類(lèi)內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其發(fā)揮作用的方式主要是通過(guò)與目標(biāo)mRNA分子的 3′端非編碼區(qū)域(3′-untranslated region，3′-UTR)序列互補(bǔ)結(jié)合，引起靶基因 mRNA 的降解或抑制翻譯，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。另外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn) miRNA 還可以與受體直接互作，產(chǎn)生對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響[13]。有研究表明，miR-125b可降低TRAF6表達(dá)，抑制NF-κB活化，減輕炎性反應(yīng)[14-15]。所以miR-125b可能與TRAF6特異性結(jié)合影響上述機(jī)制。

本研究選取人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6C7作為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)TRAF6基因過(guò)表達(dá)能顯著上調(diào)HPDE6C7細(xì)胞NF-κB p65、TAK1和TAB1蛋白水平，并且使緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1表達(dá)下降，上調(diào)TRAF6同時(shí)可增加HPDE6C7細(xì)胞的單層細(xì)胞通透率。另外，雙熒光素酶報(bào)告基因表明miR-125b可與TRAF6的3′ UTR mRNA靶向結(jié)合，抑制熒光素酶表達(dá)。

綜上所述，HPDE6C7細(xì)胞中高表達(dá)TRAF6可能激活NF-κB信號(hào)通路，改變胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)、影響胰腺導(dǎo)管上皮屏障的通透性。同時(shí)，miR-125b可能通過(guò)與TRAF6靶向結(jié)合抑制該機(jī)制。進(jìn)一步研究miR-125b調(diào)控TRAF6在HPDE6C7細(xì)胞的作用機(jī)制，有利于闡明AP發(fā)病機(jī)制，也可為AP的治療提供新的靶點(diǎn)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。