許洋 王智 孫羽婕 田偉 馮德建 周黎黎

摘要：建立離子色譜法測(cè)定綠茶中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量的方法，茶樣前處理方式模擬日常飲茶方式制備茶葉浸提液，依次經(jīng)過(guò) C18柱、Ag 柱和 Na柱凈化，直接進(jìn)樣，采用 KOH 梯度洗脫。亞硝酸鹽和硝酸鹽工作曲線(xiàn)呈良好的線(xiàn)性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9992;添加三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率在96.3%～106.0%之間，精密度測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值均小于5%。采用該方法對(duì)市售46個(gè)茶葉進(jìn)行亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測(cè)，結(jié)果顯示各地所采集的綠茶中亞硝酸鹽均存在未檢出的情況，檢出率和檢出含量低。但幾乎所有的樣品中硝酸鹽均檢出，且有27.8%茶葉樣品硝酸鹽含量逼近甚至超過(guò)250 mg/kg。

關(guān)鍵詞：茶葉;亞硝酸鹽;硝酸鹽;風(fēng)險(xiǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)： TS272.7;S571.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1674–5124（2021）12–0058–06

Determination of nitrite and nitrate in green tea and exploration of health risk

XU Yang，WANG Zhi，SUN Yujie，TIAN Wei，F(xiàn)ENG Dejian，ZHOU Lili

（Standard and Testing Technology of Tea Key Laboratory of Sichuan Province， National Institute ofMearsurement and Testing Technology， Chengdu 610021， China）

Abstract： An ion chromatography method was established to determine the content of nitrite and nitrate in green tea. In the pretreatment of tea samples， tea extracts were prepared by simulating the way of daily tea drinking. After purification on C18 column， Ag column and Na column， samples were directly injected and then eluted by KOH gradient. There was a good linear correlation between nitrite and nitrate working curves， andthecorrelationcoefficientwas 0.9999 and 0.9992，respectively. Therecoveryratesofthethree concentrations ranged from 96.3% to 106.0%， and the relative standard deviations （RSD） of the precision tests were all lower than 5%. The method was used to detect the nitrite and nitrate in 46 tea leaves sold in the market. The results showed that the nitrite in green tea collected from different places had not been detected， and the detection rate and detection content were low. However， almost all nitrates were detected， and the nitrate content in 27.8% of the samples approached or even exceeded 250 mg/kg.

Keywords： tea; nitrite; nitrate; risk

0引言

全世界有30億人飲茶，茶葉的質(zhì)量安全問(wèn)題至關(guān)重要。醫(yī)學(xué)研究證明攝入過(guò)多的硝酸鹽，會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[1]，硝酸鹽在體內(nèi)還會(huì)轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，會(huì)增加患消化系統(tǒng)癌癥的幾率[2-3]。全球各國(guó)采取了一系列相關(guān)措施控制食品中亞硝酸鹽的含量以及水質(zhì)中硝酸鹽的含量，但卻遲遲未給出茶葉和茶飲料相應(yīng)的限量。有研究表明，茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量不足以達(dá)到人體的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）值[4]。但并不意味著我們可以對(duì)此安枕無(wú)憂(yōu)，隨著茶葉生產(chǎn)中氮肥施用量越來(lái)越大[5]，越來(lái)越多的茶葉制品（如抹茶、茶粉等）添加在食品中，勢(shì)必需要制定更高更嚴(yán)苛的質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)一步嚴(yán)格把控茶葉質(zhì)量安全。

目前，有關(guān)茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測(cè)方法主要有分光光度法[6-9]和離子色譜法[10-23]。離子色譜法能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)硝酸鹽和亞硝酸鹽。

本文擬建立茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的離子色譜快速檢測(cè)方法，并利用此方法分析綠茶中硝酸鹽和亞硝酸鹽污染現(xiàn)狀，避免茶葉質(zhì)量安全問(wèn)題的盲區(qū)，對(duì)茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行初步評(píng)估，希望能為監(jiān)管部門(mén)制定茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽限量標(biāo)準(zhǔn)以及采取相關(guān)預(yù)防控制措施提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料：ProElut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

標(biāo)準(zhǔn)品：亞硝酸根離子溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW（E）082643;硝酸根離子溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW（E）082049;試驗(yàn)采用具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的亞硝酸鹽和硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液或采用基準(zhǔn)試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取亞硝酸鈉0.1500 g，于110～120℃干燥至恒重，用超純水溶解并定容至1000 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下保存，有效期為兩個(gè)月。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取硝酸鈉1.3710 g，于110～120℃干燥至恒重，用超純水溶解并定容至1000 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下保存，有效期為兩個(gè)月。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2儀器

ICS-2100型離子色譜儀，超聲波清洗器， Sartorius BP 211D 型電子天平，Millipore Milli-Q 型超純水器，0.22?m水性濾膜針頭濾器，C18柱、Ag 柱和 Na 柱。

1.3測(cè)定方法

1.3.1樣品前處理

茶葉樣品烘干粉碎待測(cè)，準(zhǔn)確稱(chēng)取約2.0000 g ????? （精確到0.0001 g ）茶葉樣品于250 mL 具塞三角瓶中，加入100 mL 新煮沸的超純水沖泡茶樣，搖勻，超聲提取30 min，放置5 min 后抽濾，冷卻至室溫，取15 mL 浸提液過(guò)活化過(guò)的 C18固相萃取柱，棄去前面3 mL，收集后面流出液待測(cè)（若氯離子濃度高于50 mg/L，建議在通過(guò) C18柱后，再通過(guò) Ag 柱和 Na 柱，棄去前面7 mL），最后通過(guò)0.22?m水性濾膜針頭濾器，供離子色譜儀測(cè)定。固相萃取柱使用前按廠家要求進(jìn)行活化。

1.3.2離子色譜條件

色譜柱：IonPac AS15（4 mm×250 mm ）;流動(dòng)相： KOH 溶液（免化學(xué)試劑）外加水模式;流量：

1.5 mL/min;色譜柱溫度：30℃;進(jìn)樣量：50?L。

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)前處理方式模擬日常飲茶習(xí)慣來(lái)制備茶葉浸提液，以便了解在日常飲茶方式下攝取到的亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，對(duì)健康飲茶起到指導(dǎo)作用。由于亞硝酸鹽和硝酸鹽極易溶于水，選擇用沸水進(jìn)行沖泡提取，隨后再用超聲提取30 min，讓固相充分提取混勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞硝酸鹽和硝酸鹽的提取很充分，但由于茶葉的成分十分復(fù)雜，同時(shí)提取出了較多色素、茶多酚、咖啡堿、有機(jī)酸等有機(jī)成分，需要再引入凈化步驟以減少基質(zhì)干擾。

實(shí)驗(yàn)考察了 C18固相萃取柱和活性炭柱對(duì)亞硝酸鹽和硝酸鹽的吸附效果，結(jié)果表明，兩種固相萃取柱對(duì)亞硝酸鹽和硝酸鹽均沒(méi)有保留，回收率均良好，但由于亞硝酸鹽的出峰時(shí)間與氯離子接近，會(huì)對(duì)亞硝酸鹽檢測(cè)造成影響，而茶葉中亞硝鹽酸即便有，含量也很微量，因此為了降低亞硝酸鹽的檢出限，當(dāng)樣品中氯離子含量過(guò)高時(shí)，建議再通過(guò) Ag 柱和 Na 柱去除氯離子的影響。以便更微量的亞硝酸鹽能被檢出。

2.2色譜條件的優(yōu)化

亞硝酸鹽和硝酸鹽在常規(guī)的陰離子色譜柱上都有很好的保留，但由于茶葉浸提液中小分子的有機(jī)酸十分多，且出峰時(shí)間很集中，某些小分子有機(jī)酸如奎尼酸、乙酸、甲酸等與無(wú)機(jī)酸會(huì)造成與亞硝酸鹽的共洗脫[9]，對(duì)亞硝酸鹽的檢測(cè)結(jié)果造成很大的干擾。

實(shí)驗(yàn)考察了IonPac AS11-HC （4 mm×250 mm ）和IonPac AS15（4 mm×250 mm ）兩種色譜柱對(duì)亞硝酸鹽和硝酸鹽分離效果的影響，結(jié)果表明，IonPac AS15（4 mm×250 mm ）色譜柱由于其疏水性好，因此小分子有機(jī)酸與無(wú)機(jī)離子的分離度比IonPac AS11-HC 效果更好一些，且回收率也較好，因而選擇IonPac AS15（4 mm×250 mm ）作為分析色譜柱。

實(shí)驗(yàn)還考察了流動(dòng)相 KOH 溶液濃度對(duì)亞硝酸鹽和硝酸鹽分離效果的影響，結(jié)果表明，當(dāng) KOH 溶液濃度為20 mmol 時(shí)，亞硝酸鹽色譜峰附近的干擾很多，呈現(xiàn)堆積出峰的現(xiàn)象，無(wú)法達(dá)到完全分離，見(jiàn)圖1、圖2。隨著 KOH 濃度的降低，亞硝酸鹽與相鄰色譜峰之間的分離度逐漸變好，當(dāng)梯度洗脫起始濃度降為1.0 mmol 時(shí)，干擾的小分子有機(jī)酸才能夠逐一出峰，分離效果最佳，且色譜峰尖銳對(duì)稱(chēng)，見(jiàn)圖3，圖4。綜合考慮保留時(shí)間、流速、分析時(shí)間的因素，最終確定了最優(yōu)的色譜條件見(jiàn)表1。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行了方法的線(xiàn)性范圍、靈敏度、回收率和精密度考察。

2.3.1方法的線(xiàn)性范圍、靈敏度考察

表2結(jié)果表明，本測(cè)試方法的工作曲線(xiàn)在線(xiàn)性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性相關(guān)，并且亞硝酸鹽和硝酸鹽的色譜峰與相鄰色譜峰能夠達(dá)到基線(xiàn)分離;將系列濃度的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液按照質(zhì)量濃度由低至高依次注入離子色譜儀分析，采用信噪比法測(cè)定亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測(cè)限與定量限。信噪比（ signal- noise ratio，S/N）在3左右時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限濃度，信噪比（S/N）在10左右時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限濃度，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3、表4，亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢出限分別為0.2 mg/kg 和0.4 mg/kg，定量限分別為0.75 mg/kg 和2.0 mg/kg ，能夠很好地滿(mǎn)足茶葉樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測(cè)和監(jiān)管需要，該方法的靈敏度較好。

2.3.2方法的回收率和精密度考察

選取1種綠茶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，稱(chēng)取樣品12份，分成4組，每組3份，其中1組作為空白樣品，另外3組分別添加1.6 mg/kg、2.0 mg/kg、2.4 mg/kg 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)添加200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)樣品按照本方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算方法的回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，本方法測(cè)定亞硝酸鹽的回收率為100.8%～104.2%之間，硝酸鹽的回收率為96.3%～106.0%之間，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ rlativesandard deviation，RSD）值均小于7%，說(shuō)明此方法具有良好的準(zhǔn)確度。

選取同一份茶葉樣品按照本方法制備供試品溶液，平行制備6份，考察精密度，結(jié)果見(jiàn)表6，亞硝酸鹽和硝酸鹽的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 值均小于5%，表明該方法的精密度好。

2.4健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

采用本文驗(yàn)證的方法對(duì)全國(guó)市售46個(gè)綠茶中亞硝酸鹽和硝酸鹽進(jìn)行檢測(cè)，最終結(jié)果見(jiàn)表7，在46個(gè)綠茶樣品中，亞硝酸鹽整體檢出率很低，最高為11.1%，為個(gè)別茶樣，檢出含量范圍為未檢出（notdetected，ND ）～2.1 mg/kg，各地所采集的綠茶均存在未檢出的情況，目前看來(lái)不存在食用風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。硝酸鹽檢出率為100%，含量范圍為62.01～295.48 mg/kg，硝酸鹽含量隨綠茶嫩度的降低而升高。目前對(duì)于茶葉中亞硝酸鹽和硝酸鹽均沒(méi)有限量要求，但茶作為受歡迎的飲料，愛(ài)飲茶之人每日攝入，可參照國(guó)內(nèi)外飲用水的限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)的初步探索，目前各國(guó)飲用水的硝酸鹽限量普遍為10 mg/L，歐盟最低，為5 mg/L，茶湯若按歐盟對(duì)于飲用水中硝酸鹽的限量進(jìn)行折算，則茶葉中硝酸鹽含量不高于250 mg/kg 為安全，愛(ài)喝濃茶者則對(duì)應(yīng)的安全值還要降低。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，盡管大部分茶樣硝酸鹽含量在此安全范圍內(nèi)，但仍然有27.8%樣品硝酸鹽含量逼近甚至超過(guò)250 mg/kg，存在健康風(fēng)險(xiǎn)。

3結(jié)束語(yǔ)

本文建立了采用離子色譜法測(cè)定茶湯中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測(cè)方法，前處理簡(jiǎn)單，符合日常飲茶方式，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本實(shí)驗(yàn)方法不僅可消除小分子有機(jī)酸、色素帶來(lái)的干擾問(wèn)題，檢出限低，可用于建立標(biāo)準(zhǔn)方法，而且可直觀地了解飲茶時(shí)真實(shí)攝入的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，幫助進(jìn)一步制定合理的限量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)參考飲用水限量對(duì)綠茶進(jìn)行了健康風(fēng)險(xiǎn)的初步探索，部分綠茶硝酸鹽存在健康風(fēng)險(xiǎn)，盡管本實(shí)驗(yàn)綠茶樣本來(lái)源較廣較隨機(jī)，且飲茶的習(xí)慣和方式各國(guó)各地、甚至個(gè)人喜好都不同，但可以為茶葉健康風(fēng)險(xiǎn)作出初步的提示，應(yīng)逐步引起居民和監(jiān)管部門(mén)的關(guān)注，全面和深入地開(kāi)展污染現(xiàn)狀研究和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確定有效的檢測(cè)手段和制定合理的限量標(biāo)準(zhǔn)，推動(dòng)我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

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（編輯：莫婕）