李海明 吳水金 黃惠明 李躍森 鄭開斌

摘要：以4個檸檬香茅資源（漳州香茅、廣東香茅、永春香茅、新西蘭香茅）的葉片作為材料，進行-25、-15、0、5、15 ℃低溫處理，測定相對電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性及POD活性，計算半致死溫度（LT50），并應(yīng)用隸屬函數(shù)法對各生理指標(biāo)進行綜合評判。結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，4個檸檬香茅資源的相對電導(dǎo)率呈逐漸升高的趨勢，半致死溫度為-21.81～-20.94 ℃。低溫脅迫過程中，各香茅品種的SOD、POD活性整體呈升高的趨勢;MDA含量隨著處理溫度的降低逐漸升高。采用隸屬函數(shù)綜合評價的4個香茅資源的抗寒性，其由強到弱依次為漳州香茅>永春香茅>新西蘭香茅>廣東香茅。通過抗寒性評價可知，漳州香茅、永春香茅可向低溫地區(qū)引種或作為抗寒育種材料。

關(guān)鍵詞：檸檬香茅;抗寒性;生理生化指標(biāo);隸屬函數(shù)法

中圖分類號： S573+.401 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0123-04

香茅是禾本科香茅屬約55 種芳香性植物的統(tǒng)稱，亦稱為香茅草，為常見的香草之一[1]，其中檸檬香茅（Cymbopogon citratus）又稱檸檬草，葉有很濃的檸檬味，原產(chǎn)于東南亞熱帶地區(qū)，我國廣東、廣西、云南、福建、海南和臺灣等省均有栽培，喜高溫多濕氣候，在無霜或少霜害地區(qū)生長良好，由于根系發(fā)達，能耐旱、耐瘠，生長比較粗放，不論砂土、黏土還是其他瘠瘦的土壤均可生長[2-3]。溫度條件是植物正常生長的重要環(huán)境因素，因此低溫會限制植物分布，是引種環(huán)節(jié)需要考慮的環(huán)境因素之一[4]。目前香茅屬植物的研究集中在提取工藝、精油成分、抑菌作用及成分分析上[5-8]，抗寒性方面的研究相對較少。在低溫脅迫下，植物體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，各項生理生化指標(biāo)的變化能夠科學(xué)、準(zhǔn)確地鑒定出植物抗寒性，是植物體內(nèi)一系列生理生化過程綜合作用的結(jié)果，受外界環(huán)境因子的影響或制約[9];相對電導(dǎo)率、丙二醛 （malondialdehyde，MDA）含量隨著溫度的降低而上升[10-11]，溫度越低，增幅越大;植物體內(nèi)抗氧化酶活性減弱[12]，這些生理生化指標(biāo)的變化，對植物引種和栽培具有一定的指導(dǎo)意義。本研究對4個檸檬香茅資源進行不同低溫處理，測定其各項生理生化指標(biāo)，以期為檸檬香茅資源的引種，尤其是向低溫地區(qū)引種，提供理論參考依據(jù)。植物在低溫脅迫下，體內(nèi)會發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，低溫下細(xì)胞膜的通透性增加，MDA含量隨著溫度降低而上升，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性隨著溫度降低而增強，已作為評價植物抗寒性的生理生化指標(biāo)，對植物引種和栽培具有指導(dǎo)意義。香茅資源的耐寒性及抗寒性方面的研究未見報道，因此本研究對4個檸檬香茅資源（漳州香茅、廣東香茅、永春香茅、新西蘭香茅）進行-25、-15、0、5、15 ℃低溫處理，測定相對電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性及POD活性，計算半致死溫度（LT50），并應(yīng)用隸屬函數(shù)法對各生理指標(biāo)進行綜合評判，篩選出抗寒性強的檸檬香茅資源，以期為檸檬香茅資源向低溫地區(qū)引種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

檸檬香茅資源種植于福建省漳州市龍文區(qū)朝陽鎮(zhèn)的福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗地（117°43′41″E、24°32′57″N）。于2020年7月選擇田間長勢良好的檸檬香茅品種資源檸檬香茅、永春香茅、廣東檸檬香茅、新西蘭香茅，分別剪取莖上部葉片，迅速帶回實驗室，葉片用自來水沖洗干凈，再用超純水沖洗3次后濾紙吸干，用濕潤的紗布包裹，分別在-25、-15、0、5、15 ℃的溫度下處理24 h，處理后的樣品用于各項生理指標(biāo)測定。

1.2 方法

1.2.1 電導(dǎo)率的測定 參考鄒琦的方法[13]測定相對電導(dǎo)率。將低溫處理后的葉片剪成0.5 cm大小，稱取葉片0.1 g，每個處理3個重復(fù)，放入干凈的具刻度的玻璃試管中，加入去離子水，浸沒樣品，靜置12 h 后，用 DDS-11A型電導(dǎo)率儀測定葉片浸提液電導(dǎo)率，記為R1。然后將玻璃試管管蓋旋緊，放入水浴鍋 99 ℃水浴 30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導(dǎo)率，記為R2，計算葉片相對電導(dǎo)率（REC）=（R1/R2）×100%。

1.2.2 半致死溫度（LT50）的計算 利用相對電導(dǎo)率，擬合Logistic方程，能夠確定植物的半致死溫度 （LT50），用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對不同處理溫度與葉片相對電導(dǎo)率之間的關(guān)系進行非線性回歸分析，用 Logistic方程y=k/（1+ae-bx）來擬合，式中：y為相對電導(dǎo)率;x為處理溫度;k為細(xì)胞傷害率飽和容量，即y的最大極限值;a、b為方程參數(shù)。為了確定 a、b的值，將方程線性化處理得到ln[（k-y）/y]=lna-bx，令 y1=ln[（k-y ）/y]，轉(zhuǎn)化為細(xì)胞傷害率與處理溫度的直線方程。通過回歸求得 a、b值及決定系數(shù)r2，用曲線的拐點作為香茅半致死溫度，即LT50=-（lna）/b，確定不同香茅品種的抗寒性。

1.2.3 酶液的制備 稱取低溫脅迫處理后的香茅葉片約1.0 g，分別取各處理材料按照質(zhì)量體積比（g/mL）1 ∶ 9的比例加入9.0 mL的0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）（pH值=7.0），研磨，4 ℃ 條件下 8 000 r/min 離心10 min，取上清液即為待測酶液。

1.2.4 生理生化指標(biāo)的測定 參照鄒琦的方法[13]測定生理指標(biāo)。SOD活性采用NBT光反應(yīng)還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用DPS 3.0與Excel 2013進行數(shù)據(jù)分析和顯著性分析。參照文獻[14-15]的方法計算抗寒性隸屬函數(shù)值，應(yīng)用隸屬函數(shù)法對各生理指標(biāo)進行綜合評判。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下葉片相對電導(dǎo)率及半致死溫度測定

由圖1可知，4個香茅品種資源在15 ℃時，相對電導(dǎo)率相當(dāng)，在62%左右，隨著脅迫溫度的降低，4個品種的相對電導(dǎo)率呈增加的趨勢，可見檸檬香茅葉片相對電導(dǎo)率與低溫脅迫溫度呈負(fù)相關(guān)，葉片細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，電導(dǎo)率不斷升高。5 ℃時，永春香茅的相對電導(dǎo)率最低，為65.59%，其次是新西蘭香茅，為71.29%;當(dāng)溫度到0 ℃時，漳州本地香茅的相對電導(dǎo)率最低，為84.40%，其余3個品種相當(dāng);當(dāng)溫度脅迫到-25 ℃，4個品種的相對電導(dǎo)率相當(dāng)。

從Logistic方程和擬合的結(jié)果（表1）來看，低溫脅迫下相對電導(dǎo)率與溫度之間的關(guān)系曲線能較好地用 Logistic曲線方程y=k/（1+ae-bx）進行擬合，r2值在0.840～0.982之間，表明不同低溫處理的相對電導(dǎo)率的變化符合 Logistic方程的變化規(guī)律，與半致死溫度呈較強的線性關(guān)系，擬合結(jié)果較為精確，4個檸檬香茅資源的LT50從小到大依次是漳州香茅、永春香茅、新西蘭香茅、廣東香茅，半致死溫度依次為-21.81、-21.49、-21.13、-20.94 ℃。半致死溫度高，說明品種的抗寒性相對較差，易受低溫脅迫的危害。可見，漳州本地香蒿的抗寒性最好。

2.2 低溫脅迫下不同香茅品種SOD活性的變化

從表2可以看出，隨著溫度的降低，廣東香茅和永春香茅的SOD活性較為穩(wěn)定，廣東香茅在 -25 ℃ 時的酶活性為145.27 U/g，比15 ℃的酶活性134.35 U/g增加8.13%，永春香茅在 -25 ℃ 時的酶活性比15 ℃的酶活性增加21.20%;15～0 ℃，漳州香茅的SOD活性增加不顯著，當(dāng)溫度降至-25 ℃時，SOD的活性與前4個溫度相比，極顯著增加;另外，新西蘭香茅隨著溫度的降低，SOD活性整體逐漸增加，當(dāng)溫度降至 -25 ℃ 時，SOD的活性與前4個溫度相比極顯著增加。SOD的活性升高，表明植物在受到低溫脅迫時，是植物的酶保護系統(tǒng)對低溫的一種應(yīng)激反應(yīng)，起到保護植株的作用，可見漳州香茅、新西蘭香茅的抗寒性比廣東香茅、永春香茅好，各香茅品種資源的抗寒性表現(xiàn)為漳州香茅>新西蘭香茅>永春香茅>廣東香茅（表2）。

2.3 低溫脅迫下不同香茅品種POD活性的變化

從表3可以看出，4個香茅品種隨著脅迫溫度的降低，POD活性呈現(xiàn)升高的趨勢，其中廣東香茅的POD活性在15 ℃時為440.00 U/（g·min），溫度在 5 ℃ 時，其POD活性略有降低，但與15 ℃時的POD活性差異不顯著，隨著脅迫溫度的降低，POD活性不斷升高，在-25 ℃時POD活性為 1 086.67 U/（g·min），增加了146.97%;漳州香茅的POD活性與廣東香茅相似，5 ℃時略有下降，隨著脅迫溫度的降低，POD活性不斷升高，在-25 ℃時POD活性為 2 376.67 U/（g·min），增加了184.06%;新西蘭香茅的POD活性隨著溫度的降低不斷增加，在 -25 ℃ 時POD活性為1 476.67 U/（g·min），增加了486.75%;永春香茅的POD活性隨著溫度的降低不斷增加，在-25 ℃時POD活性為 856.67 U/（g·min），增加了252.06%;從POD活性累積來看，新西蘭香茅、永春香茅的POD活性明顯比其余2個品種的活性要高，POD活性的增加，表明抗寒能力增強，可見，新西蘭香茅、永春香茅的抗寒性高于其他2個品種。

2.4 低溫脅迫下不同香茅品種MDA含量的變化

由表4可知，4個香茅品種的丙二醛含量由15 ℃ 至-25 ℃均表現(xiàn)出上升的態(tài)勢。說明溫度越低，植物自身的受害程度越嚴(yán)重。但品種間對比可以發(fā)現(xiàn)，在脅迫的5個溫度下，廣東香茅的MDA含量明顯高于其他3個香茅品種，說明廣東香茅的抗寒能力低于其他3個香茅品種;漳州香茅在脅迫的5個溫度下，各脅迫溫度的MDA含量明顯低于其他3個品種，說明漳州香茅的受傷害程度小，而廣東香茅的受傷害程度大。

2.5 不同檸檬香茅資源的抗寒性綜合評價

應(yīng)用隸屬函數(shù)法對4個檸檬香茅資源各抗寒性生理指標(biāo)進行綜合分析（表5）表明，漳州香茅的抗寒性優(yōu)于其他3個香茅資源，漳州香茅、永春香茅、新西蘭香茅、廣東香茅的平均隸屬度分別為 0.694 9、0.680 5、0.403 2、0.272 0。平均隸屬度綜合反映了品種資源的抗寒能力，其值越大則表明抗寒性越強。因此，低溫脅迫下4個香茅資源的抗寒性由強到弱依次為漳州香茅>永春香茅>新西蘭香茅>廣東香茅。

3 討論與結(jié)論

低溫使植物組織的細(xì)胞膜受損而發(fā)生電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率也隨之增大，因此電導(dǎo)率法逐漸廣泛應(yīng)用于植物耐寒性研究[16]。本試驗結(jié)果表明，隨著溫度的降低，各香茅品種的相對電導(dǎo)率逐漸增大，說明低溫處理對葉片細(xì)胞膜造成了傷害，當(dāng)溫度脅迫到-25 ℃時，4個香茅資源的相對電導(dǎo)率相當(dāng)，這表明4個香茅資源在-25 ℃細(xì)胞膜損傷程度相當(dāng)。低溫半致死溫度能較直觀準(zhǔn)確地反映植株的抗寒能力和耐低溫的能力，值越低表明抗寒性越強[17]，本試驗結(jié)果表明，4個檸檬香茅資源的LT50從小到大為漳州香茅、永春香茅、新西蘭香茅、廣東香茅，溫度依次為-21.81、-21.49、-21.13、 -20.94 ℃。該結(jié)果可為福建省乃至我國引種香茅資源的選擇和抗寒保護提供理論依據(jù)。

植物受到低溫脅迫時體內(nèi)活性氧產(chǎn)量增加，細(xì)胞膜脂過氧化作用增強，嚴(yán)重時導(dǎo)致細(xì)胞受損或植株死亡。 SOD和POD是植物保護酶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類，在植物抵御低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，其活性大小與植物抗寒性強弱有一定的相關(guān)性，SOD活性大的種質(zhì)其抗寒性強。過氧化物酶則通過催化與其他底物發(fā)生反應(yīng)將 H2O2維持在一個較低的水平，防止過量積累，研究表明，抗寒性強的種質(zhì)過氧化物酶活性高于抗寒性弱的種質(zhì)[18-19]。本試驗顯示，隨著脅迫溫度的降低，SOD與POD活性升高，其中廣東香茅和永春香茅的SOD活性比漳州香茅和新西蘭香茅要高，但是漳州香茅和新西蘭香茅在低溫-25 ℃時，活性成倍增加，達極顯著水平;從POD活性累積來看，新西蘭香茅、漳州香茅的POD活性明顯比其余2個品種的活性要高，POD活性的增加，表明抗寒能力增強，可見新西蘭香茅、漳州香茅的抗寒性高于其他2個品種。

丙二醛作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，已經(jīng)成為衡量植物抗寒性的一個通用指標(biāo)，丙二醛含量越高，說明植物自身的受害程度越嚴(yán)重，并且在同一溫度下，丙二醛含量越高，說明植物抗逆性越差，即丙二醛含量與抗寒性呈負(fù)相關(guān)[20]。4個香茅資源的丙二醛含量由15 ℃至-25 ℃均表現(xiàn)出上升的態(tài)勢，且各脅迫溫度廣東香茅的丙二醛含量明顯高于其他3個香茅品種，說明廣東香茅的抗寒能力低于其他3個香茅品種;漳州香茅在脅迫的5個溫度下，丙二醛含量明顯低于其他3個品種，說明漳州香茅的受傷害程度小，而廣東香茅的受傷害程度大。

植物是一個統(tǒng)一的有機體，抗寒性是由多因素聯(lián)合控制的綜合性數(shù)量性狀，各項指標(biāo)能在一定程度上反映植株抗寒能力，如僅靠一種測定指標(biāo)難以對其抗寒性進行客觀分析。利用隸屬函數(shù)法進行多指標(biāo)綜合評價是常用的科學(xué)方法[21-22]。本研究依據(jù)隸屬函數(shù)值大小評價的抗寒性強弱順序為漳州香茅>永春香茅>新西蘭香茅>廣東香茅。

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