謝思蕓，李怡菲，羅丹嫻，鐘瑞敏，廖彩虎，張霞

（韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

腌制具有延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期、賦予產(chǎn)品特殊風(fēng)味與色澤、提高產(chǎn)品品質(zhì)的特點(diǎn)[1]，是我國(guó)水產(chǎn)品主要的加工方式之一。目前，傳統(tǒng)的腌制方法主要包括干腌和濕腌。干腌方式操作方便，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，但產(chǎn)品多存在含鹽量高、魚肉質(zhì)地硬和貯藏過程脂肪容易酸敗變質(zhì)等問題。濕腌雖然可以提高腌魚制品的均勻性，但是腌制時(shí)間長(zhǎng)、魚肉容易腐敗，無法保證腌魚制品的食品安全是其最大的問題[2]。新型的腌制技術(shù)如脈沖電場(chǎng)技術(shù)[3]、沖擊波技術(shù)[4]、超高壓腌制處理技術(shù)[5]和超聲波腌制技術(shù)[6]等與傳統(tǒng)的腌制方式相比較，能夠顯著提高食鹽的滲透速率，加快腌制速率，同時(shí)對(duì)于產(chǎn)品的色澤、保水性和嫩度等感官品質(zhì)具有積極影響，但是目前多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，而且很多技術(shù)的作用機(jī)理尚不明確，是影響其工業(yè)化應(yīng)用推廣的主要原因。靜態(tài)變壓腌制[7]和真空滾揉腌制技術(shù)[8]作為目前主要的腌制方式而受到關(guān)注，產(chǎn)品多處于真空狀態(tài)下進(jìn)行腌制是其主要的特點(diǎn)。前期研究表明，真空腌制是目前普遍認(rèn)為能夠加快腌制速度的方法，其主要原理在于真空狀態(tài)下，物料容易出現(xiàn)膨脹，導(dǎo)致細(xì)胞間距增大，結(jié)構(gòu)松弛，在細(xì)胞內(nèi)外壓差和毛細(xì)管共同作用下，腌制液更容易滲入組織內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)快速腌制[9-11]。目前的研究多集中在加快腌制速率和腌制效果對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響，對(duì)于真空腌制過程中水分遷移與組織結(jié)構(gòu)的變化研究較少。

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）是指磁場(chǎng)強(qiáng)度在0.5 T以下的核磁共振，是可以通過測(cè)定肉品中氫原子核在磁場(chǎng)中的弛豫特性來確定肉品中水分的不同狀態(tài)，結(jié)合氫離子密度圖像，分析水分的分布情況，是一種無損、快速的檢測(cè)方式[12]。目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肉制品加工。卞瑞姣等[13]在對(duì)秋刀魚腌干過程的研究中發(fā)現(xiàn)，利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)，能夠與秋刀魚在腌干過程的水分狀態(tài)與變化情況建立良好的相關(guān)性，經(jīng)腌制和干制處理，魚肉水分活度降低，同時(shí)改變水分存在狀態(tài)，主要表現(xiàn)在腌制過程中魚肉組織的部分結(jié)合水與自由水轉(zhuǎn)化為不易流動(dòng)水，而經(jīng)干制處理后，魚肉不易流動(dòng)水出現(xiàn)流失與轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。龍門等[14]在對(duì)咸鴨蛋腌制過程的研究中發(fā)現(xiàn)，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)能夠很好地反映鴨蛋腌制過程中的水分分布狀態(tài)，有助于分析產(chǎn)品凝膠形成的原因，同時(shí)與產(chǎn)品的凝膠特性、質(zhì)構(gòu)和持水性等指標(biāo)具有良好的相關(guān)性。掃描電鏡是一種利用高能聚焦電子束掃描樣品表面，從而獲得樣品信息的電子顯微鏡[15]，目前掃描電鏡已經(jīng)被廣泛用于食品行業(yè)，劉歡等[16]利用掃描電鏡研究金錢腱加工后的肌纖維和結(jié)締組織的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在不同的加工條件下，五香金錢腱整體顯示出松散破碎的肌纖維狀態(tài)，不同程度的破碎會(huì)影響肉的嫩度。楊萬根等[17]利用掃描電鏡研究乾州板鴨加工過程中肌纖維的微觀結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示板鴨的肌肉纖維在經(jīng)過腌制和風(fēng)干后，從原本排列緊密變得松散，纖維斷裂，且肌纖維的數(shù)量減少，肌纖維間的孔隙增大。

本文選用真空方式對(duì)草魚進(jìn)行腌制，以魚肉的NaCl含量和水分含量為主要指標(biāo)，結(jié)合核磁共振和電鏡等技術(shù)，探討真空腌制過程中魚肉組織水分遷移的情況以及組織結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)，為探討真空腌制機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚：市售，草魚當(dāng)天宰殺，沿草魚脊骨分割成2份，在與脊骨垂直方向，將魚肉分割為長(zhǎng)×寬×高=2 cm×2 cm×2 cm 的肉塊，每塊魚肉質(zhì)量為（15±2）g，覆蓋一層保鮮膜，于4℃冰箱中冷藏備用。氯化鈉：天津市化學(xué)試劑研究所有限公司；硝酸銀：廣州市金珠江化學(xué)有限公司立新化工廠；亞鐵氰化鉀：天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；鉻酸鉀、乙醇：天津市大茂化學(xué)試劑廠；戊二醛（25%）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

MesoMR23-60H核磁共振成像分析儀：蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；TM3030臺(tái)式電子顯微鏡：日本高新技術(shù)公司；BTP-3LES冷凍干燥機(jī)：美國(guó)SPScientific公司；TE124S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DIII循環(huán)水真空泵：鞏義予華儀器有限公司；SD60制冰機(jī)：廣州市廣紳電器制造有限公司；TESTO-176T4溫度記錄儀：德圖儀器國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

利用4℃、6%的低溫鹽水作為腌制介質(zhì)，在不同腌制時(shí)間（40、80、120、160、200、240、280 min）下，選用真空腌制方式（真空度0.08 MPa）對(duì)魚肉進(jìn)行處理。提前將2 L、4℃、6%的鹽水與魚肉一同放入真空瓶中，并浸沒在含8 L、4℃載冷劑（乙醇∶乙二醇∶水=3∶3∶4，體積比）作為冷卻液的循環(huán)裝置中，調(diào)整真空瓶高度，保證真空瓶?jī)?nèi)外液面齊平，安裝相應(yīng)的溫度探頭并啟動(dòng)真空裝置進(jìn)行腌制；在試驗(yàn)過程中，為了保證溫度的穩(wěn)定性，利用低溫恒溫槽對(duì)載冷劑進(jìn)行恒溫，保證冷卻液溫度控制在（4±2）℃；為了減少溫度帶來的影響，魚肉和鹽水均提前冷卻至4℃。每組試驗(yàn)樣品共12塊魚肉，取樣測(cè)定NaCl含量和水分含量，并進(jìn)行核磁與掃描電鏡檢測(cè)，每組試驗(yàn)平行3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±方差表示。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 NaCl含量的測(cè)定

NaCl含量測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB 5009.44—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氯化物的測(cè)定》[18]的銀量法。計(jì)算方法見式（1）。

式中：X1為食品中氯化鈉的含量，%；0.035 5為1.00 mL硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（濃度1.000 mol/L）的換算系數(shù)；c1為硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；V1為用于滴定的試樣體積，mL；V2為滴定試樣時(shí)消耗的硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；V0為空白試驗(yàn)消耗的硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；V為樣品定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g。

1.4.2 水分的測(cè)定

水分的測(cè)定參考國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[19]的直接干燥法。試樣中的水分含量按式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：X2為試樣中水分的含量，%；m1為稱量瓶和試樣干燥前的質(zhì)量，g；m2為稱量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量，g；m3為稱量瓶的質(zhì)量，g；100為單位換算系數(shù)。

1.4.3 核磁共振測(cè)定方法

將完成腌制的魚肉，置于低場(chǎng)核磁共振設(shè)備中用于測(cè)量自旋-自旋弛豫時(shí)間。該儀器配備0.5 T永磁體，對(duì)應(yīng)的質(zhì)子共振頻率為21.718 MHz，測(cè)試溫度為32℃，測(cè)試方法參考GENG等[20]的方法。將樣品放入核磁共振60 mm的石英管中，應(yīng)用60 mm直徑的射頻線圈（90 °和 180 °脈沖時(shí)間分別是 5.4、11.6 μs，回聲時(shí)間為 0.2 ms），收集自旋回訊磁振脈沖（carr-purcell-meiboom-gill，CPMG）衰減信號(hào)。CPMG參數(shù)設(shè)置如下：等待時(shí)間4 500 ms，模擬獲得20 db，信號(hào)增幅3，回波數(shù)量18 000，掃描頻率4，前置放大增幅1。通過4次掃描重復(fù)獲得8 000個(gè)回波數(shù)據(jù)。兩次掃描之間的充盈時(shí)間為4 s，每次測(cè)量重復(fù)3次[21]。使用MultiExp Inv分析軟件進(jìn)行CPMG衰減曲線的分布式多指數(shù)擬合（1 000 000次）。使用SRIT軟件對(duì)弛豫數(shù)據(jù)進(jìn)行多指數(shù)擬合分析獲得改進(jìn)的擬合。從峰位置計(jì)算每個(gè)過程的峰頂時(shí)間，并通過積累積分確定每個(gè)相應(yīng)弛豫時(shí)間的弛豫峰面積[21]。

質(zhì)子密度圖像通過自旋回波（spin echo，SE）成像序列獲取。掃描參數(shù)如下：視角為100 mm×100 mm；切片厚度2.5 mm，切片間距1 mm，重復(fù)采樣等待時(shí)間1 500 ms，回波時(shí)間20 ms，累加次數(shù)16，讀取大小256，相位大小192。采用NIUMAG核磁共振影像系統(tǒng)Ver 1.0軟件對(duì)樣品的質(zhì)子密度圖像進(jìn)行處理[20]。

1.4.4 掃描電鏡測(cè)定方法

參考康大成[22]的方法，并稍作修改，取魚肉中心位置，沿脊背垂直方向切出厚度約為1 mm、寬度為1 cm的樣品，先將樣品浸沒在4℃、2.5%戊二醛中固定2 h，經(jīng)50%、70%、80%、90%乙醇溶液梯度脫水（15 min/次），再將樣品放置在100%乙醇溶液中脫水3次（30min/次），然后，將上述樣品放置在100%叔丁醇中置換3次（3 min/次），最后，將樣品放入-80℃預(yù)凍24 h，冷凍干燥5 h，置于干燥皿中，進(jìn)行電鏡掃描。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定和分析結(jié)果分別采用Origin9.0、GraphPad Prism 6.0、NIUMAG核磁共振影像系統(tǒng)Ver 1.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肉真空腌制過程中NaCl和水分含量的變化趨勢(shì)

腌制時(shí)間對(duì)魚肉NaCl和水分含量的影響見圖1。

圖1 魚肉真空腌制過程中腌制時(shí)間對(duì)NaCl和水分含量的影響Fig.1 Influence of salting time on NaCl and water content during vacuum salting of fish

由圖1可知，在真空腌制過程中，魚肉NaCl含量隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)持續(xù)上升最后下降的趨勢(shì)。在0～40 min，NaCl含量上升速度較快，在40 min時(shí)達(dá)0.77%，隨后NaCl含量持續(xù)上升，并在240 min時(shí)達(dá)到最大值，為1.48%。而魚肉的水分含量隨腌制時(shí)間延長(zhǎng)則呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，由最初的78.0%下降至75.5%，其原因是真空腌制過程，魚肉組織中的空氣和水分被不斷地排出，組織發(fā)生膨脹，導(dǎo)致細(xì)胞間距增大，有利于鹽分的滲透，而NaCl含量增大，又進(jìn)一步促進(jìn)水分排出組織，這與高凱日等[23]的研究結(jié)果一致。

2.2 魚肉真空腌制過程中弛豫時(shí)間的變化趨勢(shì)

腌制時(shí)間對(duì)魚肉弛豫時(shí)間的影響見圖2。

圖2 魚肉真空腌制過程中腌制時(shí)間對(duì)弛豫時(shí)間的影響Fig.2 Influence of salting time on relaxation time during vacuum salting of fish

由圖2可知，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，不同狀態(tài)的水分弛豫時(shí)間均發(fā)生變化，說明在腌制過程中，鹽含量增加會(huì)明顯改變樣品中水的存在形式。隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)（0～120 min），強(qiáng)結(jié)合水弛豫時(shí)間（T21）變化不明顯，弱結(jié)合水弛豫時(shí)間（T22）呈先上升后下降最后保持平緩的趨勢(shì)，且在120 min達(dá)到最大值。束縛水弛豫時(shí)間（T23）的變化與T22的變化一致，也是呈現(xiàn)先上升后下降，最后保持平緩的趨勢(shì)，同樣在120 min處達(dá)到最大值。自由水弛豫時(shí)間（T24）的變化則是先平緩上升，再突然出現(xiàn)陡升（120 min～160 min），最后又基本穩(wěn)定（160 min～280 min）。其原因可能是在 0～120 min的腌制時(shí)間內(nèi)，魚肉組織中逐漸滲入帶電的金屬離子，與帶相反電荷的蛋白質(zhì)基團(tuán)相互作用，從而形成一個(gè)電子雙電層，削弱了蛋白質(zhì)間的分子斥力[24]，能夠降低蛋白質(zhì)的表面疏水性，蛋白質(zhì)開始出現(xiàn)聚集，從而導(dǎo)致了自由水、束縛水和結(jié)合水的自由度增加，這與孔保華等[25]的研究結(jié)論相一致；而120 min后出現(xiàn)拐點(diǎn)可能與魚肉腌制過程中魚肉中蛋白質(zhì)的進(jìn)一步聚集、交聯(lián)，最后形成溶膠有關(guān)，溶膠的形成反而會(huì)導(dǎo)致自由水的自由度增加，而束縛水和結(jié)合水的自由度下降，這與裴志勝等[26]和林婉瑜等[27]研究結(jié)論相一致。

2.3 魚肉真空腌制過程中弛豫峰面積比例的變化趨勢(shì)

腌制時(shí)間對(duì)弛豫峰面積比例的影響見圖3。

圖3 魚肉真空腌制過程中腌制時(shí)間對(duì)弛豫峰面積比例的影響Fig.3 Influence of salting time on relaxation peak area ratio during vacuum salting of fish

由圖3可知，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉的弛豫峰面積比例（P21、P22、P23、P24）均發(fā)生變化。對(duì)于結(jié)合水弛豫峰面積比例（P21、P22）而言，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，均出現(xiàn)整體上先上升后下降再上升的變化，這說明在腌制過程中存在部分結(jié)合水與其它水分相互轉(zhuǎn)變的情況。而對(duì)于束縛水弛豫峰面積比例（P23）而言，隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)上下波動(dòng)的變化趨勢(shì)，在120 min時(shí)P23最大，說明此時(shí)有大量其它的水分形式轉(zhuǎn)變?yōu)槭`水，隨后P23逐漸減小，說明此時(shí)束縛水又轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌执嬖谛问?。?duì)于自由水弛豫峰面積比例（P24）而言，隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)先上升后下降，而后再上升的變化。值得注意的是，P24出現(xiàn)銳減變化的時(shí)間點(diǎn)（120 min）正是P23出現(xiàn)劇增變化及P22出現(xiàn)銳減變化的時(shí)間點(diǎn)，其原因可能是此時(shí)的鹽溶性蛋白質(zhì)進(jìn)一步溶出并與水發(fā)生水化作用，形成溶膠狀態(tài)，使得其中一部分水分被束縛在溶膠中，而另一部分水分則被排擠出溶膠組織外，這與上述3種水分的弛豫時(shí)間變化所表現(xiàn)的水分自由度變化相一致。

2.4 魚肉真空腌制過程中核磁成像（magnetic resonance imaging，MRI）的變化

魚肉真空腌制過程中MRI的變化趨勢(shì)見圖4。

圖4 魚肉真空腌制過程MRI的變化圖Fig.4 Changes of MRI during fish vacuum salting

MRI是核磁共振技術(shù)的主要成像工具，不僅可以確定食品樣品中水分的分布，還可以顯示魚肉真空腌制在不同腌制時(shí)間組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化[20]。水的分布可以用偽彩色圖像來表示，其中紅色表示高的質(zhì)子密度，即具備更好自由度；藍(lán)色代表低質(zhì)子密度，即具備低自由度[28-29]。從圖4中可以看出，隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)，質(zhì)子密度圖像MRI顏色由藍(lán)色向黃色轉(zhuǎn)變，說明魚肉組織的自由度持續(xù)上升，而且黃色區(qū)域在120 min開始明顯增大，達(dá)到160 min后，黃色區(qū)域呈現(xiàn)最大化，并基本維持不變，可能是因?yàn)樵?20 min開始，蛋白質(zhì)發(fā)生疏水性聚集，形成溶膠，此時(shí)結(jié)合水自由度達(dá)到最大，大量結(jié)合水轉(zhuǎn)變?yōu)槭`水，與弛豫時(shí)間、弛豫峰面積比例變化的結(jié)論一致。

2.5 魚肉真空腌制過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化

圖5是魚肉樣品經(jīng)戊二醛固定凍干后的掃描電鏡圖。

圖5 魚肉真空腌制過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化圖Fig.5 Changes in the microstructure of fish during vacuum salting

由圖5可知，初始的魚肉樣品的肌纖維結(jié)構(gòu)呈明顯的絲狀，而且纖維組織間結(jié)構(gòu)緊致，40 min的魚肉樣品與初始的樣品結(jié)構(gòu)相似，纖維組織清晰且結(jié)構(gòu)緊致，其原因可能是此時(shí)魚肉腌制時(shí)間較短，鹽分較少進(jìn)入組織，因此能較好地保留肌纖維絲狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)腌制時(shí)間達(dá)到80 min時(shí)，樣品肌纖維開始出現(xiàn)膨脹，纖維組織結(jié)構(gòu)被打開，肌纖維的絲狀結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，120 min的樣品與80 min的較相似，但膨脹程度和結(jié)構(gòu)松散程度較80 min明顯，肌纖維絲狀結(jié)構(gòu)開始模糊，其原因可能是，在真空腌制過程，鹽分大量進(jìn)入組織中，降低蛋白質(zhì)的疏水性，顯著提高蛋白質(zhì)的溶解性，水化能力增強(qiáng)，當(dāng)腌制時(shí)間達(dá)到160 min時(shí)，樣品的肌纖維已經(jīng)充分膨脹，纖維結(jié)構(gòu)開始呈片狀出現(xiàn)，而且隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)（160 min～280 min），肌纖維結(jié)構(gòu)完全呈片狀出現(xiàn)，與姜晶丹等[30]的研究結(jié)果一致，其原因可能是，隨著鹽分含量持續(xù)增加，加劇蛋白質(zhì)間的交聯(lián)，水化能力增強(qiáng)，導(dǎo)致纖維細(xì)胞內(nèi)粗絲和細(xì)絲膨脹，細(xì)胞的間隔變小從而連接形成片狀，此結(jié)論與弛豫時(shí)間、核磁成像等結(jié)論一致。

3 結(jié)論

本文對(duì)魚肉真空腌制過程中的水分遷移與組織結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明：隨著腌制時(shí)間延長(zhǎng)，魚肉組織的NaCl含量持續(xù)上升，而水分含量持續(xù)下降，而隨著鹽分的不斷滲入，魚肉組織蛋白質(zhì)因疏水性持續(xù)下降而逐漸聚集并形成溶膠，導(dǎo)致水分的自由度發(fā)生變化，并出現(xiàn)明顯的水分遷移現(xiàn)象，魚肉組織的肌纖維由最初清晰、緊致的絲狀結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生膨脹、松散最終變成片狀。綜上所述，魚肉在真空腌制過程中的水分遷移和組織結(jié)構(gòu)變化與魚肉腌制過程中的凝膠化呈現(xiàn)很好的相關(guān)性。該結(jié)論為真空腌制技術(shù)在魚肉腌制的應(yīng)用上提供了相關(guān)理論基礎(chǔ)。采用透射電鏡技術(shù)與電泳技術(shù)探討腌制過程組織肌纖維的Z帶的變化以及蛋白質(zhì)組成的變化仍然是下一步研究的重點(diǎn)。