楊松，李軍鵬，王彥茗，馬廉亭

據(jù)統(tǒng)計(jì)，蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）發(fā)病30 d內(nèi)死亡率高達(dá)50%，且50%以上的幸存者伴有不可逆的神經(jīng)功能損傷，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)［1］。SAH的主要發(fā)病原因是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂和顱內(nèi)血管畸形，且以顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂多見(jiàn)。近年隨著手術(shù)技術(shù)的提高，越來(lái)越多的SAH患者能夠得到較好的治療，但術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)情感和認(rèn)知障礙［2］。研究表明，SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣是患者死亡的主要原因之一，但減輕遲發(fā)性腦血管痙攣又不能改善患者預(yù)后［3］。近年有學(xué)者提出了早期腦損傷（early brain injury，EBI）的概念并認(rèn)為其是SAH患者致死、致殘的主要原因之一［4］。因此，研究SAH后EBI的發(fā)生機(jī)制、尋找藥物靶點(diǎn)可能為SAH患者提供新的治療思路。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建SAH小鼠模型并給予褪黑素（melatonin，MT）干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，MT能有效減輕SAH后EBI，其機(jī)制可能與MT保護(hù)神經(jīng)元、抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年9月至2020年6月。選取健康成年C57BL/6J雄性小鼠54只，體質(zhì)量22～25 g，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中，溫度（25 ℃）、濕度（65%）恒定，12 h光照/黑暗交替進(jìn)行；并給予小鼠充足的滅菌飲用水、專(zhuān)用飼養(yǎng)飼料。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、SAH組、SAH+MT組，每組18只。所有實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過(guò)中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且嚴(yán)格遵守相關(guān)操作規(guī)范和規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的主要試劑及儀器見(jiàn)表1～2。

表1 主要試劑Table 1 Main reagents

表2 主要儀器Table 2 Main instruments

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 所有小鼠造模前禁食12 h，禁水6 h。SAH組和SAH+MT組小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后仰臥位固定于手術(shù)板上，仔細(xì)分離頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）和頸外動(dòng)脈（exernal carotid artery，ECA），結(jié)扎ECA近心端及遠(yuǎn)心端，中間剪斷，并在ICA和ECA分叉處的ECA起始部置線，然后將ICA、CCA采用動(dòng)脈夾夾閉，將線栓由ECA插入，打開(kāi)ICA處動(dòng)脈夾，將線栓插入ICA；將進(jìn)入ICA的銳化尼龍線繼續(xù)插入至翼腭動(dòng)脈起始部時(shí)，輕抬ECA使此處的彎曲消失，以利于尼龍線順利通過(guò)。向遠(yuǎn)端繼續(xù)插入尼龍線至ICA顱內(nèi)段，有阻力感后再插入2 mm左右，刺破willis環(huán)，造成SAH后迅速將尼龍線拔出，縫合創(chuàng)口［5］。Sham組小鼠除不刺破willis環(huán)外，其他手術(shù)操作同SAH組和SAH+MT組。待小鼠復(fù)蘇后放回鼠籠。SAH+MT組小鼠分別于造模后2 h及12 h腹腔注射MT 150 mg/kg［6］，SAH組小鼠分別于造模后2 h及12 h腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模后24 h，各組分別選取6只小鼠進(jìn)行Garcia評(píng)分，之后處死并取腦組織測(cè)定含水量，選取6只小鼠用于尼氏染色實(shí)驗(yàn)及TUNEL染色，選取6只小鼠用于提取蛋白組織并進(jìn)行Western Blot。

1.4 建模成功的標(biāo)準(zhǔn) 建模后24 h取小鼠腦組織評(píng)估SAH嚴(yán)重程度，具體如下：將基底包括腦干分為6個(gè)節(jié)段，每個(gè)節(jié)段分為0～3級(jí)，對(duì)應(yīng)評(píng)為0～3分：0級(jí)為無(wú)SAH；1級(jí)為輕度SAH；2級(jí)為中度SAH伴可辨認(rèn)動(dòng)脈；3級(jí)為SAH覆蓋腦動(dòng)脈。6個(gè)節(jié)段得分之和≥8分為造模成功，剔除造模不成功小鼠并重新補(bǔ)充小鼠進(jìn)行建模。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)功能缺損程度 參考Garcia評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估三組小鼠神經(jīng)功能缺損程度［7］，包括前肢伸展（0～3分）、自發(fā)活動(dòng)（0～3分）、攀爬（1～3分）、四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱(chēng)性（0～3分）、對(duì)觸痛的反應(yīng)（1～3分）和本體感覺(jué)（1～3分）6項(xiàng)內(nèi)容，Garcia評(píng)分越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。Garcia評(píng)分均是在對(duì)研究者和數(shù)據(jù)測(cè)量者施盲的情況下進(jìn)行的。

1.5.2 腦含水量 采用標(biāo)準(zhǔn)濕法測(cè)定三組小鼠腦含水量，具體如下：建模后24 h，采用1%的戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，立刻斷頭取腦組織，分離右腦、左腦、大腦半球和腦干，并盡快采用電子分析天平稱(chēng)取其濕重；大腦切片后在105 ℃下干燥24 h，盡快采用電子分析天平稱(chēng)取其干重，并計(jì)算腦含水量，腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.5.3 大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目 采用尼氏染色實(shí)驗(yàn)觀察大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元情況，具體如下：取全腦組織制成石蠟切片，脫蠟至水，切片置于60 ℃溫箱，采用0.5%甲苯胺藍(lán)染色40 min；95%乙醇鏡下控制分色，脫水封固；在高倍鏡下（×400）觀察小鼠右側(cè)顳葉皮質(zhì)切片連續(xù)5個(gè)相鄰視野，并記錄存活神經(jīng)元數(shù)目。

1.5.4 神經(jīng)元凋亡率 采用TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況，主要步驟如下：腦組織切片先在50 μl TUNEL反應(yīng)緩沖液中孵化1 h，期間保持37 ℃和黑暗濕潤(rùn)的環(huán)境。然后，切片采用DAPI孵育5 min，以染出所有細(xì)胞核，采用封固液封固，調(diào)整熒光顯微鏡激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515～565 nm，觀察視野并拍照（綠色熒光）。最后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。神經(jīng)元凋亡率=TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目/總神經(jīng)元數(shù)目×100%。

1.5.5 凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量 采用Western Blot檢測(cè)Bax蛋白、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量，主要步驟如下：配制裂解液，研磨組織，裂解提取小鼠右側(cè)顳葉皮質(zhì)總蛋白；配制SDS-PAGE凝膠，蛋白樣品變性處理，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，蛋白顯影，重復(fù)3次取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損程度和腦含水量 三組小鼠Garcia評(píng)分及右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為56.35、60.36、47.87、30.17、26.34，P值均＜ 0.001）；SAH組和SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分低于Sham組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分高于SAH組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量低于SAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 三組小鼠Garcia評(píng)分及右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量比較Figure 1 Comparison of Garcia score and water content of right brain，left brain，cerebral hemisphere and brain stem among the three groups

2.2 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元情況 三組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.14，P＜0.01）；SAH組和SAH+MT組大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目少于Sham組，SAH+MT組大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目多于SAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。Sham組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目最多且狀態(tài)最好，神經(jīng)元胞體與尼氏小體清晰可見(jiàn)；SAH組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元排列松散且出現(xiàn)染色質(zhì)凝集；SAH+MT組小鼠存活神經(jīng)元狀態(tài)較SAH組明顯改善，尼氏小體數(shù)量較SAH組有所增加，見(jiàn)圖3。三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.42，P＜0.01）；SAH組和SAH+MT組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率高于Sham組，SAH+MT組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率低于SAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4～5。2.3 凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量 三組小鼠Bax蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為42.17、85.25、54.19，P值均＜0.01）；SAH組與SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于Sham組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于SAH組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于SAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖2 三組小鼠大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目比較Figure 2 Comparison of number of surviving neuron of cerebral cortex among the three groups

圖3 三組小鼠腦組織尼氏染色結(jié)果（×400）Figure 3 Nissl staining results of brain tissue in three groups of mice

圖4 三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)Figure 4 Morphology of cerebral cortex of the three groups

圖5 三組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率比較Figure 5 Comparison of neuronal apoptosis rate of cerebral cortex among the three groups

圖6 三組小鼠凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 6 Comparison of relative expression levels of apoptosis related proteins among the three groups

3 討論

腦血管痙攣指顱內(nèi)動(dòng)脈的持續(xù)性收縮狀態(tài)，其是SAH的并發(fā)癥之一，且被認(rèn)為是SAH后的主要致死原因之一，但減輕遲發(fā)性腦血管痙攣又不能改善患者預(yù)后［2］。既往研究表明，SAH患者出血后30 d內(nèi)死亡者占50%，且死亡病例中60%～70%是在SAH后48 h內(nèi)死亡，但遲發(fā)性血管痙攣常于SAH后1～2周出現(xiàn)［8］，這說(shuō)明遲發(fā)性腦血管痙攣并非是SAH后的主要致死原因。近年研究認(rèn)為，SAH后EBI可能是導(dǎo)致患者致殘、致死的主要原因，而神經(jīng)元凋亡又是SAH后EBI的主要病理過(guò)程之一［9］。神經(jīng)元凋亡可分為誘導(dǎo)啟動(dòng)階段、細(xì)胞內(nèi)調(diào)控階段、實(shí)施階段和吞噬搬運(yùn)4個(gè)階段［10］，對(duì)凋亡進(jìn)程有重要作用的凋亡相關(guān)蛋白包括Caspase蛋白家族、IAP蛋白家族、Bcl-2蛋白家族及P53蛋白等，其中Bcl-2蛋白家族的主要功能是調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，家族成員通過(guò)形成同源（Bcl-2/Bcl-2，Bax/Bax）或異源（Bcl-2/Bax）二聚體而影響細(xì)胞色素c的釋放，最終Bcl-2同源二聚體可抑制細(xì)胞凋亡，Bax異源二聚體可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但無(wú)論哪一條凋亡信號(hào)途徑均需要通過(guò)激活Caspase蛋白家族實(shí)現(xiàn)。

MT又名抑黑素，最早是于牛松果體內(nèi)提取出來(lái)的，因其可以使皮膚的黑色素凝集從而變白而得名，其主要由松果體分泌，人視網(wǎng)膜也能分泌少量的MT［11］。MT在心臟和腎臟等多種器官的缺血和再灌注損傷中均具有重要的保護(hù)作用，臨床研究表明，術(shù)前以預(yù)防為目的地注射MT能夠明顯改善患者心臟功能，減輕氧化損傷和心肌細(xì)胞凋亡［12］。

林達(dá)等［13］研究表明，MT可以減輕SAH后細(xì)胞凋亡，從而減輕SAH后EBI。毛崇丹等［14］進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，MT可以抑制NLRP3炎性小體，從而減輕小鼠SAH后EBI。也有研究表明，MT可以通過(guò)抗炎、抗氧化機(jī)制而減輕SAH后腦損傷［15］。本研究結(jié)果顯示，SAH組和SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分低于Sham組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率高于Sham組，大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目少于Sham組；SAH+MT組小鼠Garcia評(píng)分高于SAH組，右腦、左腦、大腦半球、腦干含水量及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率低于SAH組，大腦皮質(zhì)存活神經(jīng)元數(shù)目多于SAH組，提示SAH小鼠存在神經(jīng)功能缺損、腦水腫及神經(jīng)元凋亡增加等情況，而MT能有效減輕神經(jīng)功能缺損、腦水腫并抑制神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果還顯示，SAH組與SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于Sham組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于Sham組（P＜0.05）；SAH+MT組小鼠Bax蛋白、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于SAH組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于SAH組，提示SAH小鼠Bax蛋白表達(dá)上調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比例升高，裂解性Caspase-3明顯升高，細(xì)胞更傾向于發(fā)生凋亡；而MT能夠下調(diào)Bax蛋白，上調(diào)Bcl-2蛋白水平，降低Bax/Bcl-2比例，抑制Caspase-3蛋白活化，從而抑制SAH后神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，SAH小鼠存在神經(jīng)功能缺損、腦水腫及神經(jīng)元凋亡增加等情況，而MT可以通過(guò)下調(diào)Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、抑制Caspase-3蛋白活化而阻斷神經(jīng)元凋亡過(guò)程，進(jìn)而減輕SAH后EBI；但MT的具體作用通路及靶點(diǎn)還不明確，仍需后期進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：楊松進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)撰寫(xiě)、修訂論文；李軍鵬進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析；王彥茗進(jìn)行結(jié)果分析與解釋?zhuān)获R廉亭負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。