山溪 秦文斌 張振超 姚悅梅 戴忠良 饒斌

摘要：蔗糖磷酸合酶（SPS）是調(diào)節(jié)植物蔗糖生物合成的關(guān)鍵酶。SPS由不同的基因編碼組成，具有不同的表達(dá)模式和功能差異。利用擬南芥SPS蛋白保守結(jié)構(gòu)域在甘藍(lán)全基因組共鑒定到6個甘藍(lán)SPS家族成員。進(jìn)化分析結(jié)果表明甘藍(lán)SPS基因分為3個亞族。6個BoSPSs家族成員被定位在甘藍(lán)的5條染色體上。啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，BoSPSs含有許多與激素、逆境和光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。RNA-Seq結(jié)果表明，BoSPSA1a在各個組織中均具有較高的表達(dá)量，BoSPSB除了在芽中表達(dá)量較高，在其他各個器官/組織中表達(dá)量均較低;冷敏甘藍(lán)（CS-D9）和耐冷甘藍(lán)（CT-923）中BoSPSA1b低溫處理后均上調(diào)表達(dá)，且不同時間點(diǎn)耐冷甘藍(lán)中的表達(dá)量均明顯高于冷敏甘藍(lán)。本研究結(jié)果有助于了解甘藍(lán)SPS家族的信息，增加了對這些基因在甘藍(lán)生長發(fā)育過程中及低溫脅迫中所起的作用的理解。

關(guān)鍵詞：蔗糖磷酸合酶;甘藍(lán);低溫脅迫;BoSPSs基因;基因表達(dá)分析

中圖分類號：S188+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0053-07

高等植物中，蔗糖是生命周期的基本要素，它主要由光合作用源組織產(chǎn)生，并被運(yùn)輸?shù)轿战M織，然后作為各種代謝途徑的碳源和能量源[1]。蔗糖可用于維持細(xì)胞代謝、細(xì)胞壁的生物合成、呼吸作用，或轉(zhuǎn)化為淀粉供以后使用。參與蔗糖合成的重要酶是蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase，SPS），其中SPS催化果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖合成蔗糖-6-磷酸，這是調(diào)控植物蔗糖合成的重要步驟。SPS被認(rèn)為是調(diào)控源葉和蔗糖庫中蔗糖合成或積累的控制因子。SPS通過調(diào)節(jié)碳在淀粉和碳水化合物積累之間的分配，從而在碳水化合物代謝中發(fā)揮重要的作用[2-4]。已有研究表明，植物中有多種SPS的亞型，它們的表達(dá)隨著發(fā)育、組織類型和環(huán)境信號的不同而呈現(xiàn)出差異性[5]。SPS受3種不同的機(jī)制調(diào)控：（1）基因表達(dá)[6];（2）葡萄糖-6-磷酸（激活劑）和無機(jī)磷酸鹽（抑制劑）的變構(gòu)調(diào)控[7];（3）可逆磷酸化共價(jià)修飾[6]。SPS在適應(yīng)寒冷和干旱的器官/組織、黃化子葉、發(fā)芽的種子中受到調(diào)節(jié)[6]。在煙草的雙雜交篩選中，發(fā)現(xiàn)2個14-3-3蛋白亞型與SPS相互作用，此外，缺失分析結(jié)果表明，SPS蛋白親和力的差異是由14-3-3s的可變C末端介導(dǎo)的[4]。

SPS作為糖基轉(zhuǎn)移酶超家族成員，有多種亞型存在[8-9]。目前，植物中發(fā)現(xiàn)有A、B、C、D等 4個SPS亞家族[10]。擬南芥中A家族有2個成員（AtSPSA1和AtSPSA2），AtSPSA1在光合作用合成蔗糖中有重要作用[11]，AtSPSA2主要參與花粉發(fā)育后期的蔗糖代謝[12]。煙草中C家族僅在源葉中表達(dá)，A和B家族在多個組織中均表達(dá)[4]。甘蔗和小麥中4個家族在不同組織中均具有差異性表達(dá)，甘蔗中B家族在幼葉和老葉中高表達(dá)[9]。

甘藍(lán)屬于十字花科蕓薹屬，營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性和抗逆性均較強(qiáng)，在我國年種植面積約90萬hm2，在蔬菜供應(yīng)中有重要地位[13]。本研究利用生物信息學(xué)分析，分離鑒定了甘藍(lán)基因組中的SPS基因家族成員，并從全基因組水平上分析SPS基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件及其在染色體上的分布，探究BoSPS基因在響應(yīng)低溫中的作用。以期為進(jìn)一步研究甘藍(lán)SPS基因的功能和甘藍(lán)蔗糖水平改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)SPS基因家族成員的鑒定

擬南芥的SPS基因來源于TAIR數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/），白菜和甘藍(lán)的基因組序列來源于BRAD數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/）[14-16]，通過Pfam 33.1數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）獲取SPS含有的蔗糖合成酶（Sucrose-synth，PF00862）、糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycos-transf-1，PF00534）和蔗糖-6-磷酸水解酶（S6PP，PF05116）結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型（HMM），利用hmmer（http：//www.hmmer.org/）軟件在全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索同時含有這3個結(jié)構(gòu)域的序列，并將此蛋白序列作為候選BoSPS序列。通過Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和NCBI batch CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）檢測所有候選SPS蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域，將同時含有3個結(jié)構(gòu)域的蛋白序列作為甘藍(lán)SPS基因家族序列[17]，剔除不含以上結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域不完整的序列。甘藍(lán)BoSPSs基因根據(jù)其與AtSPSs序列的同源性及共線性關(guān)系添加后綴（a、b、……等）來命名。

1.2 甘藍(lán)SPS蛋白序列特征預(yù)測和保守基序分析

使用ExPaSy在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對獲得的甘藍(lán)SPS蛋白質(zhì)序列進(jìn)行氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)、脂肪族氨基酸數(shù)量和蛋白質(zhì)疏水性進(jìn)行分析[18]。使用CELLO v.2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）和Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對甘藍(lán)SPS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。使用模體分析工具M(jìn)EME（http：//meme-suite. org/）對甘藍(lán)SPS蛋白進(jìn)行保守基序分析，其中最適基序?qū)挾仍O(shè)置為6～50，最大基序設(shè)置為15，其他為默認(rèn)參數(shù)。

1.3 甘藍(lán)SPS基因系統(tǒng)進(jìn)化分析和內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)擬南芥中SPS基因亞家族的劃分，使用MEGA 6.0軟件，將擬南芥、白菜和甘藍(lán)的16個SPS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法（Neighbor-joining），設(shè)置Bootstrap值為1 000，其他為默認(rèn)參數(shù)。使用基因結(jié)構(gòu)圖繪制工具GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/），根據(jù)BoSPSs基因的編碼（CDS）序列及其相對應(yīng)的DNA序列，繪制BoSPSs基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。

1.4 甘藍(lán)SPS基因染色體定位和共線性分析

根據(jù)BoSPSs基因在染色體上的位置分布信息，使用MapChart 軟件繪制BoSPSs基因的染色體定位圖譜。利用BRAD數(shù)據(jù)庫分析甘藍(lán)與擬南芥、甘藍(lán)與白菜之間的直系和旁系同源基因關(guān)系，利用TBtools[19]繪制共線性圖。

1.5 甘藍(lán)SPS基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析

利用New PLACE在線軟件（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/）分析BoSPSs起始密碼子上游2 000 bp序列中激素響應(yīng)元件（ABRE、ERE、P-Box、TCA-Element、TGA-Element、TGACG-Motif）、脅迫響應(yīng)元件（LTR、MBS、STRE、TC-Rich Repeats）和光響應(yīng)元件（MRE、G-Box、GT1-Motif）等順式作用元件。

1.6 甘藍(lán)SPS基因在不同器官/組織表達(dá)特性以及低溫脅迫下的表達(dá)譜分析

根據(jù)甘藍(lán)在不同組織/器官（愈傷組織、根、莖、芽、葉、花和角果）的RNA-Seq數(shù)據(jù)（SRA accession：GSE42891），本研究通過RPKM （reads per kilobases per million reads） 值來表示甘藍(lán)SPS基因在不同器官/組織中的表達(dá)豐度，并繪制BoSPS的表達(dá)圖。

冷敏甘藍(lán)（CS-D9）和耐冷甘藍(lán)（CT-923）的幼苗長到5張真葉時，轉(zhuǎn)移至4 ℃的春化室進(jìn)行低溫處理（T），對照（CK）的幼苗仍處于正常生長條件（白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照14 h/黑暗10 h），分別對處理6、24 h的幼苗葉片進(jìn)行取樣，葉片剪碎后存儲在-80 ℃冰箱中用于RNA-Seq分析。根據(jù)BoSPSs基因的FPKM值繪制其低溫表達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)SPS基因家族成員的篩選及系統(tǒng)進(jìn)化分析

在甘藍(lán)基因組中篩選到6個BoSPS基因（表1），分別命名為BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2、BoSPSA3、BoSPSB、BoSPSC。這6個BoSPS蛋白序列中均含有蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域、糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和蔗糖-6-磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域。這6個BoSPS蛋白序列的長度從872個氨基酸（BoSPSA1b）到1 065個氨基酸（BoSPSB），相對分子質(zhì)量從97.11 ku（BoSPSA1b）到119.58 ku（BoSPSB），理論等電點(diǎn)從5.55（BoSPSA1b）到6.33（BoSPSA3），BoSPSs蛋白的理論等電點(diǎn)均在7以下，呈酸性形式存在。

BoSPS蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果如表2所示，CELLO在線工具預(yù)測BoSPS蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)中，但是Cell-PLoc在線工具的預(yù)測結(jié)果表明BoSPS蛋白均位于葉綠體中。

將擬南芥、白菜和甘藍(lán)的16個SPS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1）表明，根據(jù)聚類將這些SPS蛋白成員分為3個不同的進(jìn)化枝。其中，進(jìn)化枝A包括BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2和BoSPSA3，進(jìn)化枝B只有BoSPSB，進(jìn)化枝C只有BoSPSC。

2.2 甘藍(lán)SPS基因的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序分析

6個BoSPSs基因分別被定位在5條染色體上（圖2），其中，BoSPSA1b和BoSPSC錨定在染色體C02上，BoSPSA2定位在染色體C03，BoSPSB分布在染色體C05上，BoSPSA3定位在染色體C07，而BoSPSA1a在染色體C09上。根據(jù)甘藍(lán)、白菜和擬南芥的共線性關(guān)系（圖3），與擬南芥SPS基因相比，甘藍(lán)和白菜中的SPS基因均沒有丟失，在蕓薹屬特有的全基因組三倍化事件過程中均被保存了下來。且BoSPSA3和BrSPSA3在進(jìn)化過程中特異性地存在于甘藍(lán)和白菜中。其中甘藍(lán)中的BoSPSA1a和BoSPSA1b，白菜中的BrSPSA1a和BrSPSA1b分別保留了雙拷貝，而甘藍(lán)中的BoSPSB和BoSPSC，白菜中的BrSPSB和BrSPSC均是單拷貝。

通過比較BoSPSs基因的CDS序列及其相應(yīng)的基因組DNA序列，確定了BoSPSs的基因結(jié)構(gòu)（圖4），6個BoSPSs均含有11～13個外顯子，除了BoSPSB，其他5個BoSPSs均含有13個外顯子。BoSPSB在內(nèi)含子丟失上存在差異，導(dǎo)致了其與其他BoSPSs在基因結(jié)構(gòu)上的差異性。

使用MEME在線分析工具在BoSPS蛋白中預(yù)測出15個保守元件。結(jié)果（圖5）顯示，BoSPSA1b中無motif9和motif15;而僅BoSPSB具有motif11。其他BoSPSs在蛋白基序中均具有類似的結(jié)構(gòu)。

2.3 甘藍(lán)SPS基因啟動子順式作用元件分析

甘藍(lán)SPS啟動子序列中有許多與激素、逆境和光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測了BoSPSs成員中激素響應(yīng)元件（ABRE、ERE、P-Box、TCA-Element、TGA-Element、TGACG-Motif）、脅迫響應(yīng)元件（LTR、MBS、STRE、TC-Rich Repeats）和光響應(yīng)元件（MRE、G-Box、GT1-Motif）等13個順式作用元件。由表3可知，這些順式作用元件在6個BoSPSs啟動子序列中具有差異性分布，其中6個BoSPSs啟動子區(qū)域均含有脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）。

2.4 甘藍(lán)SPS基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)特性分析

甘藍(lán)SPS基因組織/器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果（圖6）顯示，相比于其他器官/組織，BoSPSA1a和BoSPSC在花中的表達(dá)量比較高，二者高水平的表達(dá)量在甘藍(lán)開花期間能夠確保甘藍(lán)花中蔗糖的穩(wěn)定合成;BoSPSA1a和BoSPSC在愈傷組織中的表達(dá)量比較高。甘藍(lán)6個BoSPSs成員中，BoSPSA1a在花中的表達(dá)量最高;而BoSPSB在各個組織中的表達(dá)量均比較低，但在芽中表達(dá)量較高。BoSPSA1a在各個組織中的表達(dá)量均比較高。

由圖7可知，低溫處理6 h時，與對照相比，CS-D9 處理中BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2均明顯上調(diào)表達(dá)，而BoSPSB則明顯下調(diào)表達(dá);CT-923中BoSPSA1b、BoSPSA2、BoSPSA3均明顯上調(diào)表達(dá)，而BoSPSB、BoSPSC則明顯下調(diào)表達(dá)。低溫處理24 h時，與對照相比，CS-D9中BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2 BoSPSB均明顯上調(diào)表達(dá)，而BoSPSA3 BoSPSC則明顯下調(diào)表達(dá);CT-923中BoSPSA1a、BoSPSA1b BoSPSA2均明顯上調(diào)表達(dá)，而BoSPSC則明顯下調(diào)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

隨著越來越多植物基因組測序的完成，更多的SPS基因家族成員得到了分離鑒定[20-21]。大多數(shù)植物中編碼SPS的基因?yàn)?～5個[22-23]，擬南芥中發(fā)現(xiàn)了4個，而白菜中有6個，玉米和大豆中發(fā)現(xiàn)了7個SPS基因[10，20]，陸地棉中發(fā)現(xiàn)了10個[24]。本研究在甘藍(lán)全基因組水平上分離鑒定出6個BoSPSs基因，我們發(fā)現(xiàn)擬南芥、甘藍(lán)和白菜中SPS基因的數(shù)量是不同的，擬南芥中有4個AtSPS基因，白菜中有6個BrSPS基因。其中，BoSPSs和BrSPSs均多于AtSPSs，但又不是理論上的3倍數(shù)量關(guān)系，這可能是蕓薹屬植株所特有的全基因組三倍化事件，以及后來發(fā)生的偏性基因丟失事件造成的[14]，而蔗糖物種中Ka/Ks的分子進(jìn)化分析結(jié)果表明，多倍性降低了SPS基因的選擇壓力[25]。在擬南芥、甘藍(lán)和白菜的共線性分析中，我們發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)與擬南芥發(fā)生分化之后，BoSPSAs保留了雙拷貝，BoSPSB和BoSPSC均保留了單拷貝。通過基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序分析，我們發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)中各SPS基因均具有較大的差異，而外顯子結(jié)構(gòu)的差異在基因家族的進(jìn)化中起著重要作用[26]。

Crof等對已知的SPS基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將其分為4個不同的亞家族，其中，雙子葉植物中有3個亞家族，分別為A、B、C亞族，而D亞族是單子葉植物所獨(dú)有的[9]。本研究中BoSPSs可分為3個亞家族，BoSPSA1a、BoSPSA1b、BoSPSA2、BoSPSA3屬于A族，這是雙子葉植物和單子葉植物中SPS最大也是最重要的一個亞家族。許多植物中，A亞族的SPS基因在各檢測器官/組織中均具有較高的表達(dá)量。張莉等在對甘藍(lán)型油菜的研究中發(fā)現(xiàn) BnSPSA1-2、BnSPSA1-3、BnSPSC-1和BnSPSC-2在葉片中表達(dá)量較高[27]。本研究中也發(fā)現(xiàn)BoSPSAs在7個器官/組織中（愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果）均具有較高的表達(dá)量。

SPS基因的表達(dá)模式和生物功能在不同植物不同亞家族中存在差異性[28]。水稻的OsSPS1屬于B亞族，僅在葉片的葉肉細(xì)胞、未成熟花序中表達(dá)[29-30]，甘蔗中SofSPSB（B族）在葉片中的表達(dá)量可以忽略不計(jì)，說明SofSPSB不參與蔗糖的合成[28]。本研究中，甘藍(lán)BoSPSA1a在花中的表達(dá)量比較高，可能參與花中蔗糖的合成。據(jù)推測，SPSC在煙草中參與夜間代謝階段的蔗糖合成[31];而蘋果中MdSPS6參與葉片和果實(shí)發(fā)育后期的蔗糖合成[32]。玉米中的ZmSPS1、ZmSPS6和ZmSPS7在葉片中高表達(dá)，ZmSPS2在葉片和花粉中都有高表達(dá)，而ZmSPS3、ZmSPS4和ZmSPS5在所有組織中均表現(xiàn)出較低的組成表達(dá)，為維持不同組織對蔗糖的基本需求提供了依據(jù)[5]。甘蔗中D家族基因具有構(gòu)成性表達(dá)，并在甘蔗中蔗糖合成發(fā)揮基本的功能。甘藍(lán)BoSPSA1a和BoSPSA3在各個組織中均具有較高的表達(dá)水平，而同一亞族的BoSPSA1b在根中表達(dá)量很低。BoSPSC在角果和花中表達(dá)量比較高，說明它可能在種子發(fā)育時期與甘藍(lán)產(chǎn)量的積累相關(guān)。在CS-D9和CT-923中，低溫處理時，參與蔗糖合成的主要是進(jìn)化枝A中的BoSPSs基因（除了BoSPSA3），均是上調(diào)表達(dá)，其中CT-923比CS-D9中BoSPSs基因的表達(dá)上調(diào)幅度更大。低溫處理24 h時，BoSPSC基因的表達(dá)量明顯下調(diào)。甘藍(lán)SPS的活性與蔗糖的合成速率有關(guān)，這些結(jié)果表明，在低溫脅迫下，耐冷甘藍(lán)中的BoSPSs能促進(jìn)蔗糖的合成，增強(qiáng)甘藍(lán)的低溫耐性。

在甘藍(lán)全基因組中，通過分離鑒定得到6個BoSPSs，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析將BoSPSs分為3個亞族。該家族成員啟動子區(qū)域的順式作用元件與激素、逆境、光響應(yīng)相關(guān)，基因的表達(dá)也具有明顯的組織特異性，BoSPSA1a在各個組織中的表達(dá)量均較高，BoSPSB除了在芽中表達(dá)量較高，在其他各個組織/器官中表達(dá)量均較低。低溫脅迫下，BoSPSA1a、BoSPSA1b和BoSPSA2的表達(dá)量均上調(diào)。推測這些BoSPSs基因可能在甘藍(lán)低溫響應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。

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