郭錦林

摘要：本研究我們通過雜交瘤技術(shù)篩選得到了特異性識別人IL-4Rα的高親和力單克隆抗體Mab236，該抗體能夠抑制hIL-4、hIL-13與hIL-4受體的結(jié)合和其介導(dǎo)的下游信號通路的活化。Mab236與hIL-4Rα ECD-flag的親和力KD經(jīng)Biacore檢測為93.1 pM。Mab236濃度依賴性地抑制了hIL-4和hIL-4Rα的結(jié)合，ELISA檢測抑制IC50為285.1 ng/ml。在TF-1細胞的增殖抑制實驗中，TF-1細胞經(jīng)hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)后，細胞增殖均顯著增加，加入Mab236后，抗體對不同條件誘導(dǎo)的TF-1細胞增殖均有濃度依賴的顯著抑制作用。在人PBMCs培養(yǎng)體系中，Mab236濃度依賴性地抑制了hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)PBMCs分泌的TARC水平。

關(guān)鍵詞：IL-4Rα;單克隆抗體;哮喘

Abstract In this study， we screened the high affinity monoclonal antibody Mab236 that specifically recognizes human IL-4Rα by hybridioma technology， and this antibody can inhibit the binding of hIL-4 and hIL-13 to hIL-4 receptor and the activation of downstream signaling pathway mediated by it. The affinity KD between Mab236 and hIL-4RαECD-Flag was 93.1 pM by Biacore. Mab236 inhibited the binding of hIL-4 to hIL-4Rα in a concentration-dependent manner， and the inhibition IC50 was 285.1 ng/ mL by ELISA. In an experiment that inhibits TF-1 cell proliferation， the proliferation of TF-1 cells was significantly increased after the induction of hIL-4 or/and hIL-13， After the addition of Mab236， antibody had a concentration-dependent significant inhibition effect on the proliferation of TF-1 cells under different inductive conditions. In the culture system of human PBMCs， Mab236 concentration-dependent inhibited the TARC secreted by hIL-4 or/and hIL-13 induced in PBMCs.

Key Words IL-4Rα， Monoclonal antibody， Asthma

1引言

支氣管哮喘作為一種由多種細胞及細胞因子參與的慢性氣道炎癥，被世界衛(wèi)生組織列為四大頑癥之一，是僅次于癌癥的世界第二大致死和致殘疾病。哮喘患者往往出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀。哮喘的標(biāo)準療法為吸入式糖皮質(zhì)激素+/-長效β2受體激動劑，長期使用該種療法有較強的副作用，且5～10%的患者當(dāng)前仍無有效的治療藥物[1]。

目前，全球約有3億哮喘患者，預(yù)計到2025年將增長至4億，中國現(xiàn)在20歲及以上成年哮喘患者已經(jīng)達到4570萬。據(jù)中國哮喘聯(lián)盟流行病學(xué)2018年調(diào)查顯示，僅有28.8%的哮喘患者得到診斷，全國哮喘患者控制率為40.5%，完全控制率僅為15.6%。實際上，哮喘已成為了我國第二大呼吸道疾病，死亡率達36.7/10萬，全球最高[2]。

研究表明， Th2型細胞應(yīng)答在大多數(shù)哮喘疾病的發(fā)生過程中起著非常關(guān)鍵的作用，其中Th2型細胞因子IL-4和IL-13的上調(diào)是哮喘等疾病中炎癥反應(yīng)的主要驅(qū)動因子[3]。IL-4Rα屬于Th2型炎癥通路中I型受體和II型受體的關(guān)鍵組成部分，阻斷IL-4Rα可同時阻斷Th2型免疫反應(yīng)的兩個強效調(diào)節(jié)因子IL-4和IL-13分別通過I型受體和II型受體發(fā)揮作用，從而抑制Th2型炎癥的中樞通路[4][5] （見圖1）。

本文我們通過篩選hIL-4Rα的單抗來抑制hIL-4或/和hIL-13激活的下游信號，從而抑制Th2型細胞應(yīng)答的水平。我們表達了hIL-4Rα ECD-hFc的融合蛋白作為抗原免疫小鼠，通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，篩選靶向結(jié)合hIL-4Rα的鼠單抗。我們驗證了鼠單抗抑制hIL-4與hIL-4Rα結(jié)合的作用，抑制hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)TF1細胞增殖的作用，以及降低在hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)下人PBMCs分泌TARC的水平。希望該抗體經(jīng)過后續(xù)進一步的開發(fā)能用于哮喘、特應(yīng)性皮炎等Th2型炎癥疾病的治療。

2材料與方法

2.1材料

SP2/0細胞、TF1細胞，購買于中科院細胞庫;人PBMCs，購買于TPCS;重組hIL-4Rα ECD-hFc、hIL-4Rα ECD-flag及陽性抗體Dupilumab為本實驗室通過HEK293細胞瞬轉(zhuǎn)后純化得到;重組hIL-4、hIL-4-His、hIL-13購買于Sino Biological;鼠單抗Mab236為篩選得到的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)后經(jīng)proteinG純化得到;PEG（1450）購買于sigma;Human CCL17/TARC Quantikine ELISA Kit購買于R&D Systems，貨號：DDN00;CCK-8試劑盒購買于Dojindo，貨號CK04。

2.2方法

2.2.1 鼠單抗的雜交瘤篩選

hIL-4Rα ECD-hFc抗原與弗氏佐劑等體積混勻乳化后，免疫4～6周齡的Balb/c雌鼠三次，2周/次，血清滴度>10000時可用于雜交瘤融合。融合與篩選過程如下：按照脾細胞∶sp2/0細胞=10∶1的比例混合兩種細胞，1500rpm離心7分鐘;吸去上清液，1分鐘內(nèi)加入1ml PEG（1450），輕搖90秒，在2.5分鐘內(nèi)緩慢滴加無血清DMEM培養(yǎng)液5ml，然后一次性加5ml無血清培養(yǎng)液終止反應(yīng)，靜置5分鐘，1280rpm離心8分鐘。將融合后的細胞鋪于96孔板中，并用含HAT加壓篩選，每3～4天進行半量換液一次，一周后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，待雜交瘤細胞覆蓋96孔板底部的約30%時，取細胞上清用hIL-4Rα ECD-hFc抗原包被的酶標(biāo)板進行ELISA檢測。挑選出陽性雜交瘤克隆并通過有限稀釋法進行二輪亞克隆。獲得穩(wěn)定表達抗體的雜交瘤株后進行保種及無血清培養(yǎng)。

2.2.2 Biacore檢測Mab236與hIL-4Rα ECD-flag的親和力

通過篩選確定PH 4.0 10 mM乙酸鈉為偶聯(lián)用溶液，將hIL-4Rα ECD-flag用乙酸鈉溶液稀釋至20 μg/ml，通過程序偶聯(lián)至活化后的CM5芯片上。最終hIL-4Rα ECD-flag的偶聯(lián)量為50.6Ru。將Mab236用1×HBS EP+溶液稀釋，從400 nM開始進行2倍梯度稀釋，共9個濃度。循環(huán)條件為：在FCs所有通道中以30 l/min注射分析物2 min，解離時間為20 min，然后以30 l/min速率注射再生液30 s進行表面再生。各個濃度循環(huán)結(jié)束后利用Biacore T200 Evaluation Software Ver 1.0計算捕獲抗體的信號和無捕獲抗體的信號差值及相互作用的親和力。

2.2.3 抗體對hIL-4與hIL-4Rα ECD-hFc體外結(jié)合的抑制分析

Anti-his抗體以2 μg/ml的濃度包被酶標(biāo)板，用含1% BSA封閉液封閉;hIL-4-His以1 μg/ml的濃度加入封閉好的酶標(biāo)板中，100 μl/孔，室溫孵育1 h后洗板2次;Mab236與Dupilumab以100 μg/ml的起始濃度進行3倍稀釋10個梯度，與200 ng/ml 的Biotin-hIL-4Rα ECD-hFc等體積混勻，室溫孵育1 h;用排槍吸取上述抗體混合液100 μl加入封閉好的ELISA板中，設(shè)立兩個復(fù)孔，室溫孵育1.5 h;洗板后加入Streptavidin-HRP抗體室溫孵育1 h;PBST洗板4次，每孔加100 μl顯色液，顯色5min后每孔加終止液60 μl終止反應(yīng);立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔的OD值并分析數(shù)據(jù)。

2.2.4 抗體對hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)的TF1細胞增殖的抑制分析

處于對數(shù)生長期的TF1細胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基洗2遍;TF1細胞計數(shù)，懸浮成5E4/ml的密度;Mab236抗體先稀釋成20ug/ml的濃度，再以3倍的稀釋度梯度稀釋10個梯度，設(shè)立Dupilumab陽性對照。將稀釋好的抗體加入96孔細胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，設(shè)立兩個復(fù)孔;hIL-4或/和hIL-13以終濃度10ng/ml加入TF1細胞中，充分混勻后立即加入上述已加好抗體的96孔細胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，在37℃、5%CO2條件的孵箱中孵育培養(yǎng);7天后96孔細胞培養(yǎng)板每孔加入20μl CCK-8溶液，在37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6h，混勻后酶標(biāo)儀讀OD450值，GraphPad Prism6進行數(shù)據(jù)分析。

2.2.5 抗體對hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)的人PBMCs 分泌TARC的抑制分析

Mab236與Dupilumab分別用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成100 μg/ml、20 μg/ml和4 μg/ml的濃度，加入96孔細胞培養(yǎng)板中，50 μl/孔;將新鮮人PBMCs濃度調(diào)整為2E6 /ml，接種到上述加好抗體的96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔，設(shè)立兩個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時;hIL-4或/和hIL-13各稀釋成40 ng/ml的濃度，分別加入或等體積混合后加入到上述孵育好的細胞中，50 μl/孔;96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2天，收取細胞培養(yǎng)液上清用Human CCL17/TARC Quantikine ELISA Kit檢測上清中TARC的含量。

3結(jié)果

3.1 Mab236與hIL-4Rα ECD-flag的親和力

經(jīng)過三輪雜交瘤的融合與篩選，我們一共得到了66株與hIL-4Rα ECD-hFc具有高親和力的鼠單抗，我們對這些鼠單抗的親和力及生物學(xué)活性進行了多輪的比較分析，結(jié)果表明鼠單抗Mab236親和力及生物學(xué)活性綜合表現(xiàn)最佳。本文我們展開了對Mab236體外生物學(xué)活性的分析。

首先，我們用Biacore的方法將Mab236進行了親和力的測定。實驗結(jié)果顯示，Mab236與hIL-4Rα ECD-flag有很高的親和力（見圖2），親和力KD為93.1pM（見表1）。Mab236與hIL-4Rα的高親和力是其后續(xù)表現(xiàn)出較好生物學(xué)活性的一個必要前提。

3.2 抗體抑制hIL-4與hIL-4Rα ECD-hFc體外結(jié)合的作用

IL-4Rα可以與γc鏈形成異二聚體，成為I型IL-4受體，由IL-4激活;也可以與IL-13Rα1形成異二聚體，成為II型IL-4受體，由IL-4或IL-13激活。I型和II型受體被激活后，可活化下游信號通路，介導(dǎo)炎癥細胞的增殖、活化等功能[6]。因此抑制IL-4、IL-13與其受體結(jié)合是抑制其下游信號活化的前提。

我們通過競爭抑制ELISA證實，Mab236可高效抑制IL-4與hIL-4Rα ECD-hFc體外的結(jié)合（見圖3），Mab236抑制IC50為285.1 ng/ml （見表2）。此實驗為進一步驗證抗體抑制IL-4和/或IL-13激活的細胞下游信號提供了作用機理的基礎(chǔ)。

3.3 抗體對hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)TF1細胞增殖的抑制作用

人紅系白血病細胞TF-1表達hIL-4Rα和hIL-13Rα1受體，其增殖可由hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)[7]?？贵w特異性結(jié)合TF-1細胞表面hIL-4Rα，抑制hIL-4和/或hIL-13與其膜受體的結(jié)合，可抑制其下游信號的活化。本研究通過考察不同抗體濃度下由hIL-4和/或hIL-13誘導(dǎo)的TF-1細胞增殖的水平，評價抗體對TF1細胞在不同誘導(dǎo)條件下增殖的抑制活性。

實驗結(jié)果顯示，TF-1細胞經(jīng)10 ng/ml hIL-4、10 ng/ml hIL-13或10 ng/ml hIL-4 + 10 ng/ml hIL-13誘導(dǎo)后，細胞的增殖水平顯著增加。在培養(yǎng)體系中加入Mab236或Dupilumab后，三種不同條件誘導(dǎo)的TF-1細胞增殖均出現(xiàn)了抗體濃度依賴的顯著抑制作用（見圖4、圖5、圖6），Mab236對hIL-4、hIL-13、hIL-4 + hIL-13誘導(dǎo)TF1細胞增殖的抑制IC50分別為：33.14 ng/ml 、61.64 ng/ml 、57.52 ng/ml （見表3），均顯示了抗體高效抑制TF-1細胞中IL-4Rα受體下游信號的生物活性。

3.4抗體對hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)的人PBMCs 分泌TARC的抑制作用

IL-4和IL-13的重要作用機理之一是誘導(dǎo)T細胞分泌趨化因子—胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（thymus and activation regulated chemokine， TARC，又名CCL17），募集活化炎癥細胞至炎癥部位，介導(dǎo)炎癥應(yīng)答反應(yīng)。IL-4Rα的I型受體與II型受體分別主要在造血細胞與非造血細胞上表達，人PBMCs中IL-4Rα的I型受體與II型受體均有廣泛表達[8]。本研究我們檢測了抗體對hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)人PBMCs分泌TARC的抑制作用。

Mab236對10 ng/ml hIL-4、10 ng/ml hIL-13或10 ng/ml hIL-4 + 10 ng/ml hIL-13誘導(dǎo)人PBMCs分泌TARC的抑制作用如圖7、圖8和圖9所示。實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)體系中加入IL-4或/和IL-13均顯著誘導(dǎo)了PBMCs中TARC的分泌，在應(yīng)用較高抗體濃度時，5 μg/ml和25 μg/ml的Mab236均能將PBMCs分泌的TARC抑制到很低的水平，且該抑制作用具有濃度依賴性。此實驗證實Mab236可抑制人PBMCs由hIL-4或/和hIL-13激活的下游信號。由此推測，在人體內(nèi)若該抗體也能實現(xiàn)對趨化因子TARC分泌的有效抑制，將能抑制炎癥細胞被募集至炎癥部位，從而降低體內(nèi)炎癥級聯(lián)應(yīng)答的水平。

4 討論

在本文研究中，我們以同靶點抗體藥物Dupilumab為參照，評價了Mab236的體外生物學(xué)活性。研究結(jié)果表明，Mab236可高效結(jié)合hIL-4Rα，并抑制hIL-4與hIL-4Rα的結(jié)合。在用hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)TF-1細胞的體外增殖試驗中，加入Mab236后，不同誘導(dǎo)條件下的TF-1細胞增殖均被抗體濃度依賴性地顯著抑制。在人PBMCs中，Mab236濃度依賴性地抑制了hIL-4或/和hIL-13誘導(dǎo)PBMCs分泌的TARC，揭示其有望實現(xiàn)在人體內(nèi)抑制由TARC誘導(dǎo)的炎癥細胞向炎癥部位的遷移和活化，從而降低Th2型炎癥應(yīng)答水平。

IL-4 和 IL-13 被認為是哮喘和特應(yīng)性皮炎等炎癥反應(yīng)的主要驅(qū)動因子。在全球范圍內(nèi)，靶向IL-4Rα僅有的已上市抗體藥物是賽諾菲和再生元共同研發(fā)開發(fā)的Dupilumab（通用名：達必妥），Dupilumab已獲批用于中重度特應(yīng)性皮炎、伴鼻息肉鼻竇炎和哮喘的治療[9] [10]。截至目前，Dupilumab已在全球40多個國家地區(qū)獲批上市，為賽諾菲每年帶來超過20億歐元的收入。根據(jù) Evaluate Pharma 報告指出，Dupilumab 將成為賽諾菲未來增長的關(guān)鍵驅(qū)動力，隨著臨床適應(yīng)癥的不斷增加以及市場的不斷擴張，該藥在 2024 年將成為繼艾伯維修美樂之后的全球第二大暢銷抗炎藥，銷售額將達到 80.58 億美元。

本研究我們篩選得到的鼠單抗Mab236可同時抑制由hIL-4 或/和 hIL-13 激活的下游信號，在本文評價的體外實驗中顯示出了略優(yōu)于Dupilumab的生物學(xué)活性，后續(xù)我們將進一步考察其體內(nèi)生物學(xué)活性以及工藝開發(fā)的可行性，希望將來能應(yīng)用于Th2型炎癥疾?。òㄏ?、特應(yīng)性皮炎、特發(fā)性蕁麻疹、慢性鼻息肉性鼻竇炎以及食物過敏等疾病）的治療。

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（上海麥濟生物技術(shù)有限公司 上海 201203）