肖敏 項偉玲 包其郁 高國輝

【摘要】目的：觀察黑苦蕎莖葉（BBL）對2型糖尿病小鼠肝臟影響，并探討其作用機制。方法：將40只SPF級雄性C57/BL6小鼠隨機分為正常對照組（NC組，n=10）和實驗組（n=30），正常對照組全程給予普通飼料喂養(yǎng)，實驗組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)1個月后，通過腹腔注射鏈脲佐菌素的方法建立糖尿病小鼠模型。成功建立2型糖尿?。═2DM）小鼠模型后，隨機分為3組（n=10）：模型對照組（DM組），低劑量黑苦蕎莖葉治療組（DM+L）組，高劑量黑苦蕎莖葉治療（DM+H）組。4組小鼠分別每日給予生理鹽水、生理鹽水、黑苦蕎莖葉（0.21g/kg.d-1）、黑苦蕎莖葉（0.42g/kg.d-1）灌胃14天。實驗結(jié)束后，全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）的變化;ELISA試劑盒檢測血清胰島素（INS）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-P）蛋白含量;HE染色鏡下觀察肝組織的形態(tài)學變化;實時熒光定量PCR法檢測肝臟中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA的相對表達變化;western-blot檢測肝臟組織內(nèi)胰島素受體p-IRS-1蛋白的表達。結(jié)果：黑苦蕎莖葉（BBL）治療組可以顯著降低小鼠血清ALT、AST、ALP、FFA、TG、INS水平;肝組織HE染色結(jié)果顯示，與正常組比較，DM組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞明顯脂肪變形，肝細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量小空泡，而BBL治療組有不同程度的減輕;肝組織PCR結(jié)果顯示，與DM組比較，BBL治療組小鼠肝臟PEPCKE mRNA表達量明顯增加，肝臟組織內(nèi)胰島素受體p-IRS-1蛋白表達明顯上升。結(jié)論：黑苦蕎莖葉（BBL）對糖尿病小鼠有顯著的治療效果，對糖尿病小鼠的肝臟有一定的保護作用。

【關(guān)鍵詞】黑苦蕎莖葉;2型糖尿病; IRS-1;INS;胰島素敏感性;

【中圖分類號】? R587.1? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】? ?A? ? ? 【文章編號】

2型糖尿病，一個復(fù)雜的代謝紊亂性疾病。近年來，糖尿病患病率、發(fā)病率和糖尿病患者數(shù)量急劇上升[1]。胰島素抵抗（ insulin resistance，IR）[2]是2型糖尿病發(fā)病的重要原因和主要特征，它的存在使機體糖代謝器官對葡萄糖攝取和利用的效率下降（ 主要是肝臟、肌肉和脂肪組織）[3]，進而代償性分泌更多的胰島素。胰島素的敏感性主要用于描述胰島素抵抗的程度，當器官對胰島素敏感性越低，胰島素越難以發(fā)揮作用，分解糖類的能力也越低。糖尿病病程進展中，當血糖水平得不到有效控制，會引起多臟器的微血管病變和大血管病變、糖尿病足、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、口腔及眼科并發(fā)癥。如何預(yù)防糖尿病發(fā)生、控制血糖水平及延緩糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的治療方法引起了人們越來越多的關(guān)注。黑苦蕎莖葉在中國是一種非常重要的具有可食用和醫(yī)用價值的植物，已經(jīng)有許多研究證明黑苦蕎莖葉與高血糖癥的低發(fā)病率和改善糖尿病患者的糖耐量有關(guān)[4，5]。黑苦蕎莖葉提取物[6]對身體有益影響與它有高含量的黃酮類物質(zhì)有關(guān)，特別是槲皮素和蘆丁等成分[7]。蘆丁，作為黑苦蕎莖葉的有效成分之一，因為它能保護胰島β細胞的完整性，增加GLUT-4的轉(zhuǎn)移，從而使2型糖尿病小鼠血糖下降，進而發(fā)揮降糖活性[8]。槲皮素，作為蘆丁糖苷配基，通過促進胰島素分泌，抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)生和促進葡萄糖吸收利用[9]。本課題主要闡明黑苦蕎莖葉對糖尿病的治療作用及對肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

SPF級雄性C57/BL6小鼠40只，周齡8-9周，購自上海斯萊克試驗動物責任有限公司。

1.1.2 實驗儀器

WETRUST康麟血糖儀（訊映光電有限公司），全自動生化分析儀（ 日本日立公司），CT15RE型臺式微量高速離心機（日本日立公司），NanDrop2000核酸蛋白分析儀（Thermo），S1000TM Thermal Cycler梯度PCR儀（Bio-Rad），CFX Connect TM熒光定量PCR檢測儀 （Bio-Rad）。

1.1.3 實驗試劑

黑苦蕎莖葉（購自西安利時生物科技有限公司），鏈脲佐菌素（購自臺州艾明康生物有限公司），蛋白裂解液RIPA（碧云天），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾維贊），Trizol（invitrogen），SYBR Green（Bio-Rad），SYBR Premix Ex Taq II（Takara）， Insulin and actin Primers（上海生工設(shè)計） ，小鼠INSR、G-6-P的ELISA試劑盒（購自上海源葉生物科技有限公司），PVDF膜（Millipore Corp，USA），一抗稀釋液（Beyotime，China）， ECL-化學發(fā)光試劑盒（ECL-plus，ThermoScientific）， p-IRS-1抗體（華安生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（ 購買于Gibco 公司） ，馬血清（ 購買于Gibco 公司） ，胰蛋白酶（ 購買于Gibco公司） ，，LY294002 （ 購買于碧云天公司），DEPC水（購買于碧云天公司），PEPCK 及β-actin 引物（上海生工公司），CCK8 試劑盒（ 購買于日本同仁公司） 。

1.2實驗方法

1.2.1 小鼠模型建立及分組

40只SPF級雄性C57/BL6小鼠，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組（NC）10只和實驗組30只，NC組喂養(yǎng)普通飼料，實驗組喂養(yǎng)高糖高脂飼料常規(guī)飼料66.5% +20%紅糖+ 10%豬油+ 2.5% 膽固醇+ 1% 膽酸鹽）。喂養(yǎng)35d后，將小鼠禁食12h后，使用腹腔注射法注射40mg/kg鏈脲佐菌素（STZ，臨用前用 0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液配成 1%、pH 4.2 的溶液），72h后禁食6h，斷尾取血測空腹血糖（（ fasting blood glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG大于11.6mmol/L）且小鼠出現(xiàn)三多（多飲、多食、多尿）癥狀，則成功構(gòu)建糖尿病小鼠模型。NC組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。建模成功后將模型小鼠隨機分為三組：模型對照（DM）組、低劑量黑苦蕎莖葉治療（DM+L）組、高劑量黑苦蕎莖葉治療（DM+H）組。

1.2.2干預(yù)及標本采集

使用生理鹽水溶解黑苦蕎莖葉（濃度為0.04g/ml），DM+L組小鼠灌胃0.21g/kg.d-1黑苦蕎莖葉，DM+H組小鼠灌胃0.42g/kg.d-1黑苦蕎莖葉，NC、DM組則灌胃等量生理鹽水。14d后，將小鼠禁食6h，稱量小鼠體重，斷尾取血測量空腹血糖（FBG），摘眼球取血0.6ml血樣，離心后取上清于干凈的離心管中，利用全自動生化分析儀檢測ALT 、AST、ALP、TG、FFA。取各組肝臟標本并編號。部分肝臟組織組織使用4%多聚甲醛固定用于組織包埋，部分肝臟組織液氮速凍后保存于-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.3各組小鼠血清中INS和G-6-P蛋白含量的測定

使用ELISA試劑盒檢測小鼠血胰島素含量（INS）、肝臟組織中G-6-P蛋白含量的測定。

1.2.4? 肝臟組織的病理學觀察

取各組肝臟標本放入對應(yīng)編號的包埋盒并編號，部分組織使用4%多聚甲醛固定的肝臟標本24-48h，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切成4μm切片，將切片后的肝臟組織進行HE染色，鏡下觀察并拍照各組肝臟組織形態(tài)變化。

1.2.5? 肝組織中胰島素受體底物P-IRS-1蛋白的表達

通過含有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液裂解小鼠肝組織，使用增強的BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。分離等量的蛋白質(zhì)并通過SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%BSA封閉，一抗（1：1000 稀釋）4℃ 過夜。辣根過氧化物酶標記的二抗（1：5000稀釋）室溫孵育2h，用ECL-化學發(fā)光試劑盒使蛋白質(zhì)條帶顯影。

1.2.6 肝臟組織IRS-1 mRNA表達量測定

采用Trizol一步法提取小鼠肝臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作嚴格遵照試劑盒說明書，用實時熒光定量PCR測定PEPCK mRNA表達量，以β-actin為內(nèi)參。PEPCK mRNA 上游引物序列5’-TGAAAGGCCGCACCATGTAT-3’;下游引物序列5’- GCACAGATATGCCCATCCGA-3’。反應(yīng)體系：反應(yīng)體系20μl：SYBR Green（2×）10μl，10μmol/L上下游引物各0.4μl，ddH2O 7.2μl，模板0.2μl。反應(yīng)條件： 95℃變性30s;循環(huán)40次：95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸34s;融解：95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s;冷卻：60℃ 15s。

1.3? 統(tǒng)計學處理

結(jié)果表示為平均值±SEM。 數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件分析，在方差分析的基礎(chǔ)上采用q檢驗，當p <0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 四組小鼠生化指標比較

與NC組比較，DM組血清中ALT、AST、ALP含量均升高（P<0.05，表1）;與DM組比較，DM+L組、DM+H組ALT、AST、ALP均下降（P <0.05），與DM+L組相比，DM+H組小鼠ALT、AST、ALP下降無顯著差異（P>0.05）。與NC組相比，DM組血清TG、INS、FFA水平均明顯升高（P<0.05）;與DM組比較，DM+H組TG、INS、FFA水平均有所下降， DM+L組TG、INS、FFA水平均顯著下降（P<0.05，表1）。

2.12四組小鼠血清G-6-P的ELISA結(jié)果

與NC組相比，DM組血清G-6-P水平均明顯升高;與DM組比較， DM+L組G-6-P水平均顯著下降（P<0.05，圖1），DM+H組G-6-P水平無明顯差異（P>0.05，圖1）。

2.2?; 四組小鼠肝臟組織病理學檢查

肝臟組織切片光鏡下觀察，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，肝竇規(guī)則，肝細胞無糖原積蓄，無空泡變性，未見明顯脂肪變性及炎細胞浸潤;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞的胞漿內(nèi)可見大量小空泡，有的肝細胞內(nèi)見多個小空泡融合成大空泡，空泡變性，肝細胞核被擠于一邊，肝細胞明顯脂肪變性，血竇變窄;高劑量組小鼠，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝細胞胞漿內(nèi)空泡明顯減少，僅肝小葉周邊少數(shù)肝細胞呈脂肪變性改變，只有個別細胞水腫，空泡變性;低劑量組，部分細胞水腫，空泡變性，輕度脂肪變性;與DM組相比，DM+H組和DM+L組相比有不同程度的減輕。（圖2）

2.3 四組肝臟組織PEPCK mRNA表達比較

與NC組比較，DM組小鼠肝臟PEPCK mRNA 表達均升高;與DM組比較，DM+L組、DM+H組小鼠肝臟PEPCK mRNA表達均下降（P<0.05，圖3），DM+L組與DM+H組PEPCK mRNA表達無顯著性差異（P>0.05，圖3）。

2.4? 四組小鼠肝臟組織中胰島素受體底物p-IRS-1蛋白表達的檢測

與NC組比較，DM組小鼠肝臟組織中p-IRS-1的蛋白水平均降低（P<0.05）;與DM組比較，DM+H組、DM+L組小鼠肝臟組織中的p-IRS-1的蛋白表達水平升高，其差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 與DM+L組相比，DM+H組p-IRS-1蛋白表達無顯著性差異（P>0.05，圖4）。

3.討論

糖尿病是內(nèi)科慢性常見疾病，由多病因引起以慢性高血糖為特征的代謝相關(guān)性疾病，是由于胰島素分泌和（或）利用缺陷所引起。2型糖尿病是從以胰島素抵抗為主伴胰島素進行性分泌不足，到以胰島素進行性分泌不足為主伴胰島素抵抗，它與氧化應(yīng)激增加，氧自由基增加以及抗氧化防御系統(tǒng)降低密切相關(guān)。黑苦蕎莖葉被證實與高糖癥的低發(fā)病率和改善糖尿病患者的糖耐量有關(guān)，這與它有高含量的黃酮類物質(zhì)有關(guān)，特別是槲皮素類和蘆丁等有效成分，可以促進循環(huán)中葡萄糖利用，促進胰島β細胞分泌胰島素，經(jīng)ERK1/2通路保護胰腺β細胞對抗氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮擬胰島素活性和抗氧化作用[10]。

本研究的結(jié)果表明，黑苦蕎莖葉對C57/BL6糖尿病小鼠有顯著的治療效果。表現(xiàn)為經(jīng)黑苦蕎莖葉治療后C57/BL6糖尿病小鼠糖耐量改善，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）均降低，肝細胞中的PEPCK mRNA均明顯降低，p-IRS1蛋白的表達也顯著降低，血清中的INS、G-6P分泌增加。表明黑苦蕎莖葉可以增加C57/BL6糖尿病小鼠的血糖耐受能力，保護肝臟避免高糖環(huán)境下引起的氧化應(yīng)激損傷[11]。2型糖尿病發(fā)病通常經(jīng)過兩個階段，一開始是糖耐量減低的發(fā)生，此時IR起主要作用，之后IR和β細胞的胰島分泌受損同時加重導致直接發(fā)展成為臨床DM。胰島素抵抗包括糖利用障礙，胰島素作用的靶細胞（如肝細胞、骨骼肌細胞和脂肪細胞等） 攝取和利用葡萄糖受阻，骨骼肌細胞是利用葡萄糖進行有氧代謝，產(chǎn)生ATP，當肌細胞對糖的吸收和利用受阻，同時沒有其他外界刺激促使骨骼肌細胞重新對葡萄糖進行攝取和利用，此時便會發(fā)生胰島素抵抗。

綜上所述，黑苦蕎莖葉提取物可以提高糖尿病小鼠的糖耐量，降低血清肝臟轉(zhuǎn)氨酶，保護肝功能，降低血脂，促進胰島素分泌，顯著上調(diào)PEPCK mRNA表達，上調(diào)p-IRS1蛋白的表達，減少高糖帶來的對肝臟的損傷，從而發(fā)揮其治療糖尿病和保護肝臟的作用。

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（1.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州325035）