白紅艷 劉妍 劉宜鑫 劉書偉 朱智

摘要：目的 觀察不同實(shí)驗(yàn)條件對紅細(xì)胞膜納米載體制備效率和功能的影響，并探討制備紅細(xì)胞膜效率最佳時(shí)所需的低滲脹破時(shí)間。方法 取小鼠血液分離得到紅細(xì)胞（RBC），分別低滲脹破20 min、1 h、2 h，依次經(jīng)離心、超聲和脂質(zhì)體擠出等操作，制成紅細(xì)胞膜納米載體。通過透射電子顯微鏡（TEM）、ZS90納米粒徑電位分析儀完成形態(tài)表征，采用Western blotting法分析CD47膜蛋白，以及定量分析膜蛋白提取效率。結(jié)果 20 min、1 h、2 h三組不同時(shí)間下制備出的紅細(xì)胞膜納米載體形態(tài)規(guī)則，并成功保留發(fā)揮免疫逃逸作用的CD47蛋白，三組試驗(yàn)蛋白定量分析結(jié)果分別為0.95、1.25、1.328 mg/ml。與20min組比較，1h、2h組蛋白定量水平均增高（P均<0.05），1h組蛋白定量指標(biāo)增長最明顯（P<0.05）。結(jié)論 不同的實(shí)驗(yàn)條件對紅細(xì)胞膜納米載體的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能均無影響，可以影響膜蛋白提取效率。其中延長低滲脹破時(shí)間，蛋白定量結(jié)果增長緩慢，以1 h組制備效率最高。

關(guān)鍵詞：納米載體;紅細(xì)胞膜;仿生;制備

中圖分類號(hào)：R314 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract： Objective To elevate the effect of different experimental conditions on the efficiency and function of the preparation of erythrocyte membrane nanocapsules， and to investigate the time of hypotonic rupture when the efficiency of erythrocyte membrane is the best. Methods Red blood cells （RBC's） were isolated from the blood of mice， which were hypoosmotic and burst for 20 min， 1 h and 2 h， respectively. After centrifugation， ultrasound and liposome extrusion， the RBC membranes were made into nanocrystals. Morphology was characterized by transmission electron microscopy （TEM） and ZS90 nanoparticle potential analyzer， and CD47 membrane protein was analyzed by Western blotting method and the extraction efficiency of membrane protein was quantitatively analyzed. Results The morphology of the erythrocyte membrane nanocarriers prepared at different time of 20 min， 1 h and 2 h were regular， and the CD47 proteins that played the role of immune escape were successfully retained. The quantitative results of the three groups of proteins were 0.95， 1.25 and 1.328 mg/ mL， respectively. Compared with group 20 min， the quantitative levels of proteins were increased at 1h and 2h （both P<0.05）， and the most significant increase was observed at group 1h （P<0.05）. Conclusion Different experimental conditions have no effect on the morphology， structure and function of erythrocyte membrane nanocapsules and can affect the extraction efficiency of membrane protein. With the prolongation of the hypotonic burst time， the quantitative results of protein increase slowly. And group 1h has the highest preparation efficiency.

Key words： nano-carrier; erythrocyte membrane; bionic; preparation

針對微納米載體在體內(nèi)運(yùn)輸過程中所面臨的免疫清除難題，受自然細(xì)胞系統(tǒng)的啟發(fā)，研究人員引入紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)菌、血小板和干細(xì)胞[1-3]等天然細(xì)胞，分離出具有獨(dú)特生物學(xué)性能的細(xì)胞膜，以構(gòu)建具有長循環(huán)特性、良好生物相容性的藥物傳遞系統(tǒng)。作為血液中數(shù)量最多且壽命最長的血細(xì)胞，紅細(xì)胞具有可塑變形性、滲透脆性、懸浮穩(wěn)定性等特點(diǎn)，易于分離，是制備納米載體的良好材料。更值得一提的是，CD47作為紅細(xì)胞膜表面蛋白，可以發(fā)出“Don't eat me”信號(hào)，逃避體內(nèi)巨噬細(xì)胞的監(jiān)視和清除，這為紅細(xì)胞膜（RBCM）應(yīng)用于納米載體提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。紅細(xì)胞及紅細(xì)胞膜的來源與提取相對簡單，一般通過離心得到血液中的紅細(xì)胞，采用低滲溶血的方式獲取紅細(xì)胞膜[6];再通過擠壓、超聲、電脈沖等方法可以進(jìn)一步獲得納米級別的紅細(xì)胞膜載體。然而制備紅細(xì)胞膜納米載體時(shí)，離心和低滲溶血的實(shí)驗(yàn)條件難以標(biāo)準(zhǔn)化，存在很多差異，實(shí)際操作的復(fù)雜程度遠(yuǎn)高于理論描述。2019年6月-2020年7月，我們觀察了不同實(shí)驗(yàn)條件對紅細(xì)胞膜納米載體制備效率和功能的影響，并探討了制備紅細(xì)胞膜效率最佳時(shí)所需的低滲脹破時(shí)間。

1.材料與方法

1.1主要儀器與試劑

Sigma 3-30KS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國SIGMA公司;Bioruptor非接觸式全自動(dòng)超聲破碎儀（UCD-300）：比利時(shí)Diagenode公司;NanoDrop One/OneC UV-Vis：美國Thermo Fisher公司;ZS90納米粒徑電位分析儀：英國馬爾文儀器有限公司;-20℃冰箱：德國西門子股份公司;Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)：美國Millipore 公司;Tanon VE-180垂直電泳槽、Tanon VE-180轉(zhuǎn)移電泳槽、Tanon EPS-300電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi：上海天能科技有限公司;Orbital Shaker TS-2：海門市其林貝爾儀器制造有限公司;Western洗膜盒：Biosharp公司。

肝素鈉（10mg/ml）：北京索萊寶科技有限公司;水合氯醛（10%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;凱基SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;PageRuler PrestainedTM Protein Ladder：美國Thermo Fisher公司;SDS-PAGE電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、Western封閉液、RIPA裂解液（中）：Beyotime 公司;Anti-CD47 mouse monoclonal antibody：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG（H+L）：杭州昕誠生物科技有限公司5*DualColor Protein Loading Buffer、Tris緩沖鹽溶液、硝酸纖維素（NC）膜：微科曼得生物工程有限公司;通用型抗體稀釋液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：新賽美生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件的篩選

在查閱文獻(xiàn)了解關(guān)于紅細(xì)胞膜納米載體制備方法時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程的關(guān)鍵條件[7-12]往往描述不一，如低滲脹破時(shí)間、轉(zhuǎn)速及低滲介質(zhì)溫度等（表1）;另外，研究人員在參考文獻(xiàn)時(shí)也會(huì)綜合實(shí)際情況適時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件[11.12]。

針對上述問題，我們認(rèn)為要獲取純凈、豐富、穩(wěn)定、有應(yīng)用價(jià)值的紅細(xì)胞膜納米載體，尚需對提取RBCM過程中的系列條件進(jìn)行優(yōu)化，如裂解紅細(xì)胞膜所需的介質(zhì)溫度、低滲脹破時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速等。

我們分析明確了各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件以及其實(shí)施意義。離心力與轉(zhuǎn)速的換算關(guān)系如下：G=1.11×10（-5）×R×（rpm）2 ，其中，G為離心力，一般以g（重力加速度）的倍數(shù)來表示，R表示半徑，rpm表示轉(zhuǎn)速?？梢婋x心力與轉(zhuǎn)速、半徑成正比關(guān)系。據(jù)了解，醫(yī)院檢驗(yàn)科分離血漿采用的轉(zhuǎn)速標(biāo)準(zhǔn)是3000 rpm，離心機(jī)轉(zhuǎn)頭平均半徑在6 cm左右，此時(shí)的離心力約等于600*g，在此轉(zhuǎn)速標(biāo)準(zhǔn)下的離心力已可以較好的滿足分離血漿的需求。由此說明，800*g的離心力和3000 rpm的轉(zhuǎn)速均可以達(dá)到較好分離血漿的目的，兩者均可以選擇。

除了選定分離血漿的轉(zhuǎn)速，我們還分析確定了RBCM低滲脹破所需的介質(zhì)溫度及分離紅細(xì)胞膜與血紅蛋白的臨界轉(zhuǎn)速。有關(guān)資料顯示，為保障血液成分的有效性，不同血液成分保存條件不同，懸浮紅細(xì)胞4℃冷藏保存[13]為最佳。低滲過程提取RBCM時(shí)，為了維持紅細(xì)胞膜性能，將低滲脹破的實(shí)驗(yàn)溫度控制在4℃;紅細(xì)胞經(jīng)過低滲脹破，釋放血紅蛋白，得到紅細(xì)胞膜。分離出細(xì)胞膜需要在較大的離心力下才可以實(shí)現(xiàn)RBCM沉淀，數(shù)次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)14000 rpm的轉(zhuǎn)速下得到粉紅色RBCM沉淀，此時(shí)將沉淀溶解后在13000 rpm下再次離心，沉淀顏色即呈淡黃色。因此，14000 rpm下的離心力較大，易將質(zhì)量較小的血紅蛋白與RBCM一并沉淀，而13000 rpm的離心力則可以得到較為純凈的不含血紅蛋白的RBCM。

關(guān)于低滲脹破時(shí)間對RBCM提取效率的影響，鑒于紅細(xì)胞具有的滲透脆性，在固定濃度的低滲鹽溶液中，隨著時(shí)間延長，溶液的濃度會(huì)因紅細(xì)胞破裂釋放的血紅蛋白而逐漸上升，溶液的脹破效果也逐漸降低，明顯低于初始的低滲鹽溶液。故決定通過分組實(shí)驗(yàn)討論脹破時(shí)間可能對RBCM提取效率產(chǎn)生的影響。

因此，本實(shí)驗(yàn)選用雄性KM小鼠（6-8周）9只，定量心臟取血0.8 mL，在等滲離心3000 rpm，6 min，低滲離心13000 rpm，10 min，介質(zhì)溫度4℃等基礎(chǔ)條件下，分組實(shí)驗(yàn)以探討不同的低滲脹破時(shí)間對RBCM功能和提取效率的影響。實(shí)驗(yàn)過程中，為確保紅細(xì)胞膜納米載體制備成功，對紅細(xì)胞膜納米載體進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)、電位等表征測定，并通過 Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)揮RBCM功能的關(guān)鍵蛋白CD47是否存在。最后應(yīng)用定量分析來比較不同低滲脹破時(shí)間下得到的RBCM蛋白量，以反映膜提取效率的高低。

1.3 RBCM收集與處理

取正常雄性KM小鼠（6-8w）心臟血液0.8 mL以獲取RBCs，將采集的血液樣品置于裝有抗凝劑的試管中并編號(hào)。所取血液以3000 rpm，4℃離心6 min后，去除上清液，得到紅細(xì)胞沉淀。隨后以1：4的體積比用磷酸鹽緩沖液（1×PBS，pH=7.3，4℃）沖洗，離心（3000 rpm，4℃，6 min）棄上清液，重復(fù)此提純紅細(xì)胞步驟三次。將得到的RBCs懸浮于0.25×PBS溶液（4℃）中誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂。然后在13000 rpm，4℃離心10 min，去掉上清液。重復(fù)離心步驟，直至上清液透明，沉淀為淡黃色。

將得到的RBCM沉淀溶在1×PBS溶液中，采用超聲破碎儀對其進(jìn)行超聲處理。超聲后的RBCM通過擠壓方法獲得紅細(xì)胞膜納米載體，用于后續(xù)的定量、定性分析。

1.4 紅細(xì)胞膜納米載體表征

分別將紅細(xì)胞膜納米載體通過透射電子顯微鏡（TEM）、ZS90納米粒徑電位分析儀進(jìn)行形態(tài)、水合粒徑（DLS）、Zeta電位測定。

1.5 Western blottingting分析CD47膜蛋白

樣品處理上樣后，100V電泳，待樣品泳至濃縮膠和分離膠的分界處，調(diào)整電壓為120V，電泳樣品至凝膠末端即終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。在轉(zhuǎn)膜模具中依次放置NC膜、凝膠等材料，驅(qū)除氣泡后閉合模具進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。完成轉(zhuǎn)膜后利用封閉液室溫封閉2h，將封閉后的轉(zhuǎn)印膜依次分別與一抗（CD47蛋白抗體）、二抗（山羊抗鼠抗體）進(jìn)行免疫反應(yīng)，特異性抗體可對凝膠電泳處理過的細(xì)胞膜進(jìn)行著色，通過底物化學(xué)發(fā)光ECL，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中可分析NC膜著色的位置和著色深度，即獲得特定蛋白質(zhì)（CD47蛋白）的相關(guān)信息。

1.6 紅細(xì)胞膜納米載體膜蛋白定量測定

由于蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，因此蛋白質(zhì)溶液在280 nm處具有特征性的紫外吸收峰。根據(jù)朗伯-比爾定律，一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在280nm波長處的吸光度與其濃度呈正比，所以測定蛋白質(zhì)溶液280 nm處的吸光值獲得蛋白含量，可完成紅細(xì)胞膜提取效率的測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1紅細(xì)胞膜納米載體表征測定

紅細(xì)胞膜納米載體的TEM圖片如圖A、B、C所示，20 min、1 h、2 h三組不同低滲脹破時(shí)間下的納米載體呈規(guī)則、完整球形狀，粒徑在120 nm左右。圖D、E顯示紅細(xì)胞膜依次經(jīng)過超聲破碎儀、脂質(zhì)體擠出器處理后的直徑大小。Zeta電位為-10 mV左右（圖F）。

2.2 紅細(xì)胞膜納米載體膜蛋白電泳分析

上圖所示三組不同條件下制備的紅細(xì)胞膜納米載體的Western blotting結(jié)果，蛋白條帶的存在證實(shí)紅細(xì)胞納米載體成功保留了紅細(xì)胞的表面膜蛋白CD47。

2.3 紅細(xì)胞膜納米載體膜蛋白定量結(jié)果分析

與20min組比較，1h組和2h組紅細(xì)胞膜納米載體蛋白定量水平均增高，且2h組高于1h組（P<0.05）。

3.討論

納米細(xì)胞膜涂層技術(shù)突破了普通納米載體系統(tǒng)在循環(huán)中快速消除的局限性，可被用于藥物載體、靶向成像、診療一體化等方面。以紅細(xì)胞膜修飾的納米載體具有長循環(huán)、可降解的優(yōu)點(diǎn)，在納米載藥仿生系統(tǒng)中得到了廣泛關(guān)注。目前，雖然關(guān)于紅細(xì)胞膜納米載體的研究眾多，但研究中使用的紅細(xì)胞膜均來自于天然紅細(xì)胞，且制備方法描述不一，存在差異，這就使得利用紅細(xì)胞膜作為納米載體的各項(xiàng)研究開展受到材料來源困難的限制，不能有效開展大規(guī)模制備及研究應(yīng)用。因此，明確紅細(xì)胞膜納米載體制備的實(shí)驗(yàn)條件是亟待解決的問題。

紅細(xì)胞膜納米載體在完成表征測定和 Western blotting實(shí)驗(yàn)后，證實(shí)其粒徑、Zeta電位均與Min Gao [14]構(gòu)建的PFC@PLGA-RBCM性質(zhì)相近，且CD47蛋白也被成功保留，由此確定已得到形態(tài)表征和性能均符合要求的納米載體。這表明經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)條件可以實(shí)現(xiàn)理想紅細(xì)胞膜納米載體的制備，不同的低滲脹破時(shí)間不會(huì)影響紅細(xì)胞膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和表面電位等物理性能，但會(huì)影響膜提取效率。

在評估上述不同低滲時(shí)間的脹破效能時(shí)，采用方差分析，P<0.05可以認(rèn)為不同時(shí)間下的RBCM濃度存在差異。表2中列出的數(shù)值顯示，經(jīng)過脂質(zhì)體擠出器操作后，膜蛋白數(shù)量減少，這是由于擠壓膜不可避免的會(huì)吸附囊泡，使膜蛋白有一定損失。由表2可知，1h組和20min組相比，脹破時(shí)間延長40min，膜提取效率增加31.6%。與20min組、1h組相比，2h組時(shí)間分別延長100 min及60 min，而膜提取效率增加39.8%、6.2%。由此可見，隨著時(shí)間延長，膜蛋白數(shù)量的增長幅度逐漸降低，1h組同時(shí)平衡了膜蛋白數(shù)量和脹破時(shí)間，是較為理想的高效率組別。所以，在制備紅細(xì)胞膜納米載體實(shí)驗(yàn)中，建議根據(jù)需求選擇較為合適的低滲脹破時(shí)間。若研究過程中所需紅細(xì)胞膜數(shù)量較多，建議選擇1h低滲脹破處理以提高試驗(yàn)效率。

隨著對細(xì)胞膜納米載體研究的深入，發(fā)現(xiàn)盡管細(xì)胞膜穩(wěn)定性不如人工合成的納米材料，體內(nèi)安全性也待進(jìn)一步探索和研究，但其長循環(huán)特性、可降解性及免疫耐受性使其相比于人工合成材料仍具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已有相關(guān)研究表明，紅細(xì)胞膜納米載體除輸送藥物外，用途廣泛。如Min Gao [14]構(gòu)建PFC@PLGA-RBCM作為長循環(huán)氧載體，改變了腫瘤乏氧環(huán)境，可協(xié)助膠質(zhì)瘤的放療;張良方團(tuán)隊(duì)構(gòu)建RBC-血小板復(fù)合膜，不僅進(jìn)一步增強(qiáng)了納米顆粒的功能，同時(shí)還保留了兩種來源細(xì)胞的特性，如長半衰期與免疫耐受性，特別是血小板的癌癥靶向性[15]。因此，我們相信利用紅細(xì)胞膜作為納米載體的研究具有巨大研究價(jià)值。但仍需要注意的是，生物膜的生物安全性和天然活性對納米載體功能至關(guān)重要，操作過程中需避免引入污染物（如熱原、病毒等），并防止膜蛋白的變性。

綜上所述，在控制等滲離心條件為3000rpm、6min，低滲離心條件為13000rpm、10min，并保持實(shí)驗(yàn)中介質(zhì)溫度為4℃時(shí)，紅細(xì)胞膜納米載體保留了原有的特征性膜蛋白CD47，粒徑可達(dá)到100-200nm。在此基礎(chǔ)上，選擇1h的低滲脹破時(shí)間可在較短時(shí)間內(nèi)獲得高質(zhì)量的紅細(xì)胞膜納米載體，進(jìn)一步提高納米載體的提取效率，為紅細(xì)胞膜納米載體的深入研究提供豐富的原材料。

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第一作者簡介：白紅艷（1998-），女，本科生，主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)影像學(xué)。E-mail：1461750847@qq.com

劉妍（1997-），女，本科生，研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)影像學(xué)。E-mail：2330198849@qq.com

徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院 江蘇徐州 221004