吳至成 王乙妃 吳琳

摘要：解析一株從臨床病人血液標(biāo)本里篩查出來的菌株T6000的基因組序列信息，并對其進行群體感應(yīng)信號合成酶的基因檢測。使用Illumina Miseq測序平臺獲取該菌的全基因組序列，將其全基因組序列經(jīng)過注釋的基因蛋白質(zhì)序列提交KEGG數(shù)據(jù)庫進行BLASTp比對分析，確定該菌潛在的重要感應(yīng)信號合成酶。結(jié)果表明：t6000基因組序列全長6074257 bp，其中GC所占的百分比為42.88%。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明t6000具有13種重要感應(yīng)信號合成酶及致病機理，為藥物靶位點的確立及新藥的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多形擬桿菌;基因組測序;感應(yīng)信號基因

厭氧菌在某些特定情況下可由正常菌群變?yōu)闂l件致病菌，約占臨床內(nèi)源性細菌感染50-60%，其中類桿菌屬細菌分離率最高，常與其他細菌混合感染，造成腹腔內(nèi)、骨盆及皮膚等感染，有很高的發(fā)病率和致死率[1-3]。類桿菌屬有超過20種，以脆弱類桿菌、多形類桿菌、普通類桿菌等在臨床感染最為常見。

群體感應(yīng)（quorum sensing， QS）是廣泛存在于細菌群體中的依賴細菌密度的信號通訊系統(tǒng)，可通過感知其濃度變化來調(diào)節(jié)群體行為的現(xiàn)象，如致病菌定植、毒力因子的表達、耐藥性和胞外酶的產(chǎn)生，群集運動，生物膜形成和生物發(fā)光等[3，4]。因此，研發(fā)類桿菌屬細菌的的QS系統(tǒng)為新型藥物的治療靶點，可更好地控制細菌群體感染及耐藥性的產(chǎn)生，是今后研究的一個重要方向。本研究從臨床血液標(biāo)本中分離出類桿菌t6000，通過Illumina測序平臺對其全部基因組進行測序，然后使用相關(guān)軟件對測序數(shù)據(jù)進行QS合成酶基因組組裝和編碼基因預(yù)測，以期了解t6000的群體感應(yīng)信號的類型和作用機制。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

t6000是海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病人血液標(biāo)本里篩查出來的菌株。使用蘇州金唯智生物科技有限公司提供的Buffer1、Buffer2、Buffer3、研磨珠等。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA的提取

取45ml新鮮培養(yǎng)菌液至50ml離心管中， 4000rpm，5-10min，棄上清;將研磨珠倒入上述收集到的菌體沉淀中，加入1.2ml Buffer1，渦旋打散菌體;加入120ul Buffer2，轉(zhuǎn)速渦旋振蕩10min混勻，加入400ul Buffer3，再次渦旋混勻，冰上靜置10min;4000rpm 10min將上清移至新的2.0mlEP 管中，上清即為粗提的核酸;電泳并送至金唯智NGS實驗室測序。

1.2.2 基因組測、組裝與編碼基因預(yù)測

對以上提取保留的基因組DNA通過Illumina HiSeq 2000測序平臺對其全部基因組進行有規(guī)律測序，然后使用相關(guān)軟件（如cutadapt v1.9.1軟件）對測序數(shù)據(jù)進行處理和分析，把基因中的接頭序列以及基因的引物去掉，同時也去掉基因中質(zhì)量在20以內(nèi)的堿基序列和含量在10%以上的N堿基序列，從而使試驗得到更加穩(wěn)定、有效的數(shù)據(jù)（clean data）。

對通過以上試驗測試得出的數(shù)據(jù)，利用拼接軟件velvet 1. 2. 10 完成序列拼接。采用SSPACE 3.0序列對比軟件對所得到的序列與資源庫中的序列進行對比分析，并且在序列中通過相互之間的關(guān)系對其中插入一些序列片段，從而形成了一條新的序列，即scaffold序列。最后再通過GapFiller1-10軟件把gap添加到得到的scaffold序列上，還可以對這條序列進行編輯從而使之得到延伸，就得到了含量在10%以下的N堿基以及質(zhì)量在20上的堿基序列的scaffold序列，再采用prodigal3.02軟件對基因組進行預(yù)測即可。

1.2.3基因功能注釋

通過上述方法得到基因預(yù)測的蛋白序列，使用BLAST軟件2.2.31+與基因組百科全書（即KEGG）數(shù)據(jù)庫進行序列比對（E-value<1e-5），完成基因功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組裝與編碼基因預(yù)測

對基因的序列通過Velvet 1.2.20軟件進行序列拼接試驗（原始的序列19252032個reads，讀長2887804800 bp，插入片段大小350bp），拼接獲得51個contigs，N50大小為329919bp。經(jīng)過優(yōu)化與補洞處理后，獲得完整的脆弱擬桿菌株t6000基因組序列，全長6074257 bp，其中GC所占的百分比為42.88%，每一段序列的長度大多數(shù)在119103.08bp左右，其中編碼區(qū)的基因大約在4796左右，在整條序列的基因組所占90.39%左右，平均長度為1144.87bp。根據(jù)菌株t6000含量和reads覆蓋平均深度統(tǒng)計圖可得出（圖1），把基因進行拼接后所得到的GC含量的所占比例大約在30～55%，主要分布的序列深度階段在400～650×的區(qū)域之間。

2.2 KEGG數(shù)據(jù)庫基因注釋分析

KEGG數(shù)據(jù)庫（即KEGG），基因組信息通過對不同的生物過程進行數(shù)據(jù)分析和整合可以畫出與之相適合的生物代謝通路圖 [7]。試驗將菌株的所對應(yīng)的基因序列和KEGG數(shù)據(jù)庫信息對比分析，結(jié)果表明，注釋基因2544個，占基因總數(shù)的53.04%，該菌株的編碼基因主要定位在氨基酸生物合成、氨基酸和核苷酸糖代謝和碳代謝等代謝通路。

根據(jù)KEGG對該菌株的分析結(jié)果可知，195個代謝通路中，其中與群體感應(yīng)相關(guān)的基因包括41個，這些基因組成不同的酶類參與調(diào)控細菌t6000群體行為，參與的酶及對應(yīng)的基因信息見表1。將群體感應(yīng)基因在通路圖上展示出來，并與目前已報道的感應(yīng)信號合成酶的基因進行對比，迅速了解大部分感應(yīng)信號分子的致病機制和代謝途徑，信號通路如下圖2所示。通路圖中，紅色標(biāo)注的是注釋到的基因[6-20]。

多形類桿菌t 6000 可以編碼13種群體感應(yīng)合成酶：PhnA、PhnB調(diào)控鼠李糖脂的生物合成;Gad A/B、GadC調(diào)控耐酸性質(zhì);Trb 調(diào)控轉(zhuǎn)運共生質(zhì)粒;Pel調(diào)控角質(zhì)酶合成;RpfB調(diào)控鐵攝取、多重耐藥性及排出有害物質(zhì)、鞭毛生物合成、Hrp系統(tǒng)、EPS合成、生物膜的形成、胞外酶等多個過程;ToxE、ToxI分別調(diào)控毒黃素的生物合成及轉(zhuǎn)運;CcfA調(diào)控接合機制;CylA調(diào)控靶細胞裂解;Sec調(diào)控降解酶、芽孢形成的基因、毒力、生物膜形成及菌體的衰亡。

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基金：海南省自然科學(xué)基金（417146）;

海南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（2017089）

[基金項目]海南省自然基金項目（817324）

[作者簡介]吳至成（1972-），男，海南?？谌?，副主任檢驗師

[通訊作者]吳琳（1984-），女，海南海口人，副教授