游月華，葉惟虎

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬龍華人民醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518109；2南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢430030

細(xì)菌的存在與根管感染及根尖周炎之間存在因果關(guān)系［1-3］。根管治療的臨床目標(biāo)是通過(guò)機(jī)械和化學(xué)手段大量減少根管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌，并采用充填材料將根管系統(tǒng)嚴(yán)密封閉，從而促進(jìn)根尖周病變的愈合［4,5］。連續(xù)旋轉(zhuǎn)鎳鈦機(jī)用器械是目前口腔臨床應(yīng)用最廣泛的機(jī)械預(yù)備器械。ProTaper Gold（2014）采用經(jīng)典的凸三角形截面和漸進(jìn)錐度，增強(qiáng)了切削作用，同時(shí)減少了器械刃部與牙本質(zhì)之間的旋轉(zhuǎn)摩擦［6］，表現(xiàn)出不同的相變行為和循環(huán)疲勞抗性［7］。ProTaper Next（2013）則通過(guò)獨(dú)特的矩形截面設(shè)計(jì)、漸進(jìn)錐度及偏軸心運(yùn)動(dòng)，使其在工作時(shí)與管壁保持兩點(diǎn)接觸，從而提高根管成形效率和循環(huán)疲勞抗力［8-10］。以上兩種漸變錐度旋轉(zhuǎn)鎳鈦系統(tǒng)均可通過(guò)機(jī)械預(yù)備大量減少感染根管內(nèi)的微生物負(fù)載量［11,12］。

重度彎曲根管的充填更推薦應(yīng)用單尖法充填技術(shù)，而使用固定錐度的鎳鈦器械預(yù)備及與之匹配錐度的牙膠尖進(jìn)行單尖充填可獲得更好的封閉效果［13］。EZ Pass（2020）是近期引入牙髓病學(xué)臨床的一套新型固定錐度連續(xù)旋轉(zhuǎn)鎳鈦系統(tǒng)，采用高相變溫度鎳鈦合金絲，以機(jī)械磨削和MaxtTech 6.0熱處理工藝制成。EZ PASS在常溫下以R相為主，并含有少量奧氏相，其預(yù)彎性能和抗循環(huán)疲勞能力均顯著提高。EZ Pass系統(tǒng)由5支單一固定錐度的器械組成，其橫截面形態(tài)為經(jīng)典的凸三角形。目前，有關(guān)EZ Pass清除感染根管內(nèi)細(xì)菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的是通過(guò)根管內(nèi)取樣和瓊脂板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)比較新型固定錐度連續(xù)旋轉(zhuǎn)鎳鈦系統(tǒng)EZ Pass 與兩種傳統(tǒng)的漸變錐度連續(xù)旋轉(zhuǎn)鎳鈦系統(tǒng)（ProTaper Gold及ProTaper Next）對(duì)體外構(gòu)建的上頜中切牙感染根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

T+File順滑通路銼（深圳速航）；EZ Pass（深圳速航）；ProTaper Gold（Dentsply Maillefer）；ProTaper Next（Dentsply Maillefer）；X-Smart Plus 根管馬達(dá)（Dentsply）；ProRinse?30G沖洗針頭(Dentsply Tulsa)；硅橡膠印模材料(Kerr)；紫外分光光度計(jì)（BioMate 3S，Thermo Scientific）；渦旋振蕩器（Thermo Scientific）；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（北京福意）。

1.2 菌株與試劑

糞腸球菌（ATCC 29212）；牛腦心浸液培養(yǎng)基（Millipore Sigma）。

1.3 樣本來(lái)源

選擇因牙周病或正畸而新鮮拔除的單根上頜中切牙51顆。納入標(biāo)準(zhǔn)：牙齒外形正常，無(wú)明顯齲病、缺損或充填物，經(jīng)X線(xiàn)片和顯微鏡下識(shí)別為單根管。去除牙根表面的軟組織及牙結(jié)石，儲(chǔ)存于4 ℃含0.02%NaN3的生理鹽水中。該研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 樣本制備

對(duì)所收集的51顆離體牙進(jìn)行開(kāi)髓、疏通根管，運(yùn)用ProTaper Gold Sx銼進(jìn)行根管冠部預(yù)敞開(kāi)，以切緣至根尖孔的距離減去1 mm為工作長(zhǎng)度，以T+File（16/02）制備順滑通路，以ProTaper Gold將根管預(yù)備至F2。每次更換器械時(shí)，依次以2 mL 2%NaClO和2 mL 0.9%NaCl沖洗根管；機(jī)械預(yù)備完成后，先后用5 mL 2%NaClO、1 mL 5%Na2S2O3、3 mL 17%EDTA和6 mL 0.9%NaCl進(jìn)行根管沖洗。本研究全程采用ProRinse?30G單側(cè)開(kāi)口沖洗針頭，針頭距根尖止點(diǎn)不少于2 mm。將樣本放入裝有硅橡膠印模材料的5 mL離心管內(nèi)，注入2 mL BHI培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌。

1.5 根管感染模型的建立

參照本課題組前期研究，建立上頜中切牙根管感染模型［14,15］。將單克隆糞腸球菌菌落接種至10 mL腦心浸液培養(yǎng)液中，于37 ℃有氧培養(yǎng)5 h后將菌液稀釋為1×108/mL的菌懸液。以2 mL菌懸液注入離體牙根管，將樣本完全浸沒(méi)；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)21 d，每隔1 d換液1次。

1.6 根管內(nèi)細(xì)菌染色及光鏡觀(guān)察

參照本課題組前期研究［14,15］，隨機(jī)選擇1個(gè)感染標(biāo)本，切除牙冠和根尖，獲得一個(gè)圓柱形牙本質(zhì)塊。將切下的標(biāo)本固定在4%的多聚甲醛中，在10%的甲酸/甲酸鈉中完全脫礦后進(jìn)行石蠟包埋處理，垂直于牙體長(zhǎng)軸進(jìn)行橫向切片（層厚5 μm），并用Taylor改良的Brown&Brenn技術(shù)進(jìn)行染色［16］。將切片置于光鏡下（放大20倍；Axioplan 2熒光成像顯微鏡；Zeiss，德國(guó)），對(duì)根管壁上的生物膜細(xì)菌進(jìn)行定性觀(guān)察；隨機(jī)選取了10個(gè)牙本質(zhì)切片，在每個(gè)切片上取5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行最大細(xì)菌滲透深度的測(cè)量，取其平均值為該切片的最大細(xì)菌滲透深度值。

1.7 根管內(nèi)取樣和菌落計(jì)數(shù)

在根管感染模型建立后即對(duì)剩余的50個(gè)樣本進(jìn)行首次根管內(nèi)取樣（S1）［18］。以15#K銼在根管內(nèi)提拉切削30 s，并用500 μL生理鹽水沖洗根管。使用小型注射器將根管內(nèi)液體收集于5 mL的離心管中，渦旋振蕩30 s，倍比稀釋?zhuān)?0 μL稀釋菌液涂布于腦心浸液瓊脂板，有氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.8 感染根管內(nèi)細(xì)菌的清除

首次根管內(nèi)取樣（S1）后，將剩余的50個(gè)樣本隨機(jī)分為以下5組（n=10），以機(jī)械和化學(xué)手段清除根管內(nèi)細(xì)菌：EZ Pass組：設(shè)定X-Smart Plus根管馬達(dá)的轉(zhuǎn)速為350 r/min,扭矩為1.5 N.cm，依次用P2（15/04）、P3（20/04）和P4（20/06）以單一長(zhǎng)度技術(shù)擴(kuò)大根管；隨后將參數(shù)調(diào)至350 r/min和3.0 N.cm，將根管擴(kuò)大成形至P5（25/06）。ProTaper Gold組：設(shè)定馬達(dá)為“ProTaper”模式，依次用S1（17/02）、S2（20/04）、F1（20/07）和F2（25/08）以單一長(zhǎng)度技術(shù)將根管擴(kuò)大成形。ProTaper Next組：設(shè)定馬達(dá)為“ProTaper”模式，依次用X1（17/04）和X2（25/06）以單一長(zhǎng)度技術(shù)擴(kuò)大成形根管。2%NaClO組：不機(jī)械預(yù)備，僅以2%NaClO進(jìn)行化學(xué)預(yù)備。0.9%NaCl組（陰性對(duì)照組）：不機(jī)械預(yù)備，僅以0.9%NaCl沖洗根管。

每個(gè)樣本使用的沖洗液總量為16 mL。其中EZ Pass組、ProTaper Gold組、ProTaper Next組、2%NaClO組沖洗順序和沖洗液量如下：先以6 mL 2%NaClO沖洗根管，隨后以2 mL 5%Na2S2O3中和根管內(nèi)殘存的次氯酸鈉及2 mL 17% EDTA 去除玷污層，并以6 mL 0.9%NaCl進(jìn)行終末根管沖洗。0.9%NaCl組（陰性對(duì)照組）每個(gè)樣本僅用16 mL 0.9%NaCl進(jìn)行沖洗。完成上述機(jī)械及化學(xué)預(yù)備后，對(duì)50個(gè)樣本全部進(jìn)行第2次根管內(nèi)取樣（S2）。計(jì)算根管內(nèi)細(xì)菌減少率（%）和對(duì)數(shù)減少量（log10CFU）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。采用單因素方差分析比較各組初次取樣后的根管內(nèi)細(xì)菌量的差異。采用單因素方差分析比較各組間根管內(nèi)細(xì)菌減少率和對(duì)數(shù)減少值，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)3周的培養(yǎng)，光鏡下觀(guān)察到根管表面可見(jiàn)廣泛的糞腸球菌生物膜，同時(shí)已有大量的細(xì)菌滲入牙本質(zhì)小管深層；細(xì)菌存在于大多數(shù)牙本質(zhì)小管中，并堵塞了根管壁上的牙本質(zhì)小管開(kāi)口。糞腸球菌進(jìn)入牙本質(zhì)小管的最大深度平均值為475 μm（圖1A、B）。

圖1 代表性Taylor改良的Brown&Brenn染色光鏡下人工感染根管的牙齒牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌影像Fig.1 Taylor-modified Brown and Brenn-stained light microscopy images of E.faecalis within the dentinal tubules of a tooth with infected root canals.A:Bottom area of the buccal canal;B:Isthmus area.

0.9%NaCl 組、2%NaClO組、EZ Pass組、ProTaper Gold組、ProTaper Next組感染根管內(nèi)細(xì)菌量基線(xiàn)值分別為7.28×109、7.19×109、7.35×109、6.96×109、7.01×109CFU/mL，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

進(jìn)行根管內(nèi)細(xì)菌清除處理后，EZ Pass組、ProTaper Gold組、ProTaper Next組、2%NaClO組細(xì)菌減少率的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，89.5%～98.2%），但均顯著高于陰性對(duì)照組[（54.50±2.4）%]（圖2）；EZ Pass組（1.47±0.12）、ProTaper Gold組（1.74±0.14）及ProTaper Next組（1.63±0.17）根管內(nèi)細(xì)菌對(duì)數(shù)減少值的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均顯著高于2%NaClO組（0.98±0.08）（P＜0.05）；以上4組的對(duì)數(shù)減少值皆顯著高于陰性對(duì)照組（0.34±0.03）（P＜0.01，圖2）。

圖2 使用5種方法對(duì)感染根管行機(jī)械化學(xué)清理后主根管內(nèi)CFU計(jì)數(shù)的減少Fig.2 Effects of root canal disinfection for CFU reduction in the main canals with the 5 antibiofilm strategies(Mean±SD).CFU reduction rate(%):*P＜0.001 vs 0.9%NaCl;Log10 CFU reduction:*P＜0.001 vs 0.9%NaCl,*P＜0.001 vs 0.2%NaClO.

3 討論

微生物侵入牙髓腔并以生物膜的形式長(zhǎng)期存在，被認(rèn)為是根管治療失敗和根尖周炎持續(xù)存在的主要原因［1,14］。理論上根管預(yù)備的生物學(xué)目標(biāo)是清除根管系統(tǒng)內(nèi)的所有微生物［17］，但臨床實(shí)踐中往往要在清除感染和保存牙體組織之間達(dá)到一個(gè)平衡，以最終長(zhǎng)期保存患牙，實(shí)現(xiàn)其美學(xué)和功能［4］。

根管感染模型建立前應(yīng)將所有樣本根管制備形成統(tǒng)一的根尖直徑和錐度，并使用次氯酸鈉沖洗清除根管內(nèi)殘存的微生物，為避免次氯酸鈉延遲作用過(guò)度抑制糞腸球菌生長(zhǎng)，還需使用5%Na2S2O3沖洗中和以及17%EDTA去除玷污層，最后0.9%NaCl終末沖洗消除所有沖洗液對(duì)建模的影響。糞腸球菌是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究驗(yàn)證的根管感染研究模型菌種，不論有氧或無(wú)氧條件，其均能在離體牙根管內(nèi)形成成熟的生物膜結(jié)構(gòu)［18］。本課題組前期研究表明［14,15］，采用有氧培養(yǎng)技術(shù)能成功構(gòu)建成熟的根管內(nèi)糞腸球菌生物膜模型。

本研究評(píng)估了固定錐度的新型連續(xù)旋轉(zhuǎn)鎳鈦系統(tǒng)EZ Pass對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果，并與漸變錐度的鎳鈦系統(tǒng)ProTaper Gold 及ProTaper Next 作比較。研究結(jié)果顯示，2%NaClO組根管內(nèi)細(xì)菌減少了89.50%，其對(duì)數(shù)減少值為0.98，顯著高于陰性對(duì)照組；這表明次氯酸鈉沖洗是清除感染根管內(nèi)細(xì)菌的有效手段［19,20］。本研究中EZ Pass組、ProTaper Gold組、ProTaper Next組與2%NaClO組所使用的沖洗液種類(lèi)、濃度和體積是一致的，結(jié)果顯示3個(gè)機(jī)械化學(xué)預(yù)備組根管內(nèi)細(xì)菌減少對(duì)數(shù)值的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），卻均顯著高于單純的化學(xué)預(yù)備組（2%NaClO組）（P＜0.05）；這表明使用EZ Pass、ProTaper Gold和ProTaper Next進(jìn)行機(jī)械預(yù)備均可顯著減少根管內(nèi)細(xì)菌量，三者的細(xì)菌清除能力相當(dāng)。本研究結(jié)果顯示，ProTaper Gold組根管內(nèi)細(xì)菌減少率為98.20%，ProTaper Next組減少率為97.70%；這與部分研究［10,11,17］結(jié)果基本一致，這兩種鎳鈦器械的根管內(nèi)細(xì)菌減少率都不低于95%。

研究結(jié)果顯示，0.9%NaCl組根管內(nèi)細(xì)菌減少率和對(duì)數(shù)減少值均顯著低于各機(jī)械化學(xué)預(yù)備組或單純化學(xué)預(yù)備組（P＜0.05）。然而，盡管未使用任何機(jī)械或化學(xué)預(yù)備手段，陰性對(duì)照組根管內(nèi)細(xì)菌量卻降低了54.5%，這主要是因取樣時(shí)K銼對(duì)根管壁上微生物的機(jī)械切削作用和生理鹽水的流體動(dòng)力學(xué)沖刷作用所致［14,15］。

無(wú)論是基于何種形態(tài)設(shè)計(jì)、熱機(jī)械處理工藝和運(yùn)動(dòng)方式，鎳鈦器械都是在根管內(nèi)繞著某個(gè)軸心進(jìn)行環(huán)形切削。然而，根管橫截面形態(tài)是沿著牙根長(zhǎng)軸方向不斷變異的，沒(méi)有哪一種器械或技術(shù)可將所有的根管壁表面都切削到［21,22］。再者，細(xì)菌往往以生物膜的形式廣泛存在于根管交通支及側(cè)支等器械無(wú)法到達(dá)的不規(guī)則區(qū)內(nèi)［23］。因此，交替使用機(jī)械和化學(xué)手段進(jìn)行根管內(nèi)細(xì)菌清理顯得尤為重要。

綜上所述，新型連續(xù)旋轉(zhuǎn)鎳鈦系統(tǒng)EZ Pass可顯著減少感染根管內(nèi)的細(xì)菌負(fù)載量，其根管內(nèi)細(xì)菌清除能力與ProTaper Gold和ProTaper Next相當(dāng)，值得臨床推廣應(yīng)用。