范 菲，黃炯力，安 慶，崔 穎，朱 清

（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710054；2.西安計(jì)量技術(shù)研究院，陜西 西安 710068）

1 引言

補(bǔ)骨脂素為光敏化合物，在日光照射的情況下，可導(dǎo)致受照處的皮膚發(fā)生紅腫，并且增加色素；異補(bǔ)骨脂素在吸入、接觸皮膚以及吞食的情況下都是有害的［1，2］。文獻(xiàn)［3～6］中主要報(bào)道了新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的檢測方法，并未研究其測量不確定度；然而測量不確定度能夠定量表征檢測結(jié)果的質(zhì)量，很大程度上決定了其測量結(jié)果的可用性。新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素被我國化妝品安全技術(shù)規(guī)范［7］列為禁用物質(zhì)，其測定結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要，測量不確定度評(píng)定在質(zhì)量的控制方面意義重大，是日常檢驗(yàn)檢測工作的重要組成部分。

本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［8～15］，對(duì)新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的高效液相含量測定方法進(jìn)行了不確定度評(píng)定，建立了數(shù)學(xué)模型，量化了各不確定度的分量，為評(píng)定檢驗(yàn)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了科學(xué)依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

對(duì)照品：新補(bǔ)骨脂異黃酮（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：520052-201401）；補(bǔ)骨脂素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110739-201617）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：520053-201401）；異補(bǔ)骨脂素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110738-201715）。

安安金純橄欖油深層水嫩晶透緊膚水（佛山市安安美容保健品有限公司，批號(hào)：II05B，簡稱緊膚水）；甲醇；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技公司）；無水乙醇（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三蒸水（自制）；其他分析純?cè)噭?/p>

測試儀器：MS105型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BSA124S-CW 型千分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；ULTIMATE 3000型高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；渦旋混勻器（德國IKA）。

2.2 方法

2.2.1 制備溶液

對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：精密稱重新補(bǔ)骨脂異黃酮對(duì)照品5.45 mg、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品5.47 mg、補(bǔ)骨脂二氫黃酮對(duì)照品5.65 mg、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品5.36 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋到刻度，即得。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL、5 mL、10 mL、20 mL置于100 mL量瓶中，作為②、③、④、⑤號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加甲醇稀釋到刻度；再精密吸?、谔?hào)液1 mL，置10 mL量瓶中，得①號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加甲醇稀釋到刻度；最終得①、②、③、④、⑤號(hào)標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

供試品溶液：精密稱取0.5 g供試品置10 mL具塞比色管中，加6 mL甲醇，渦旋使提取溶劑與試樣混勻，超聲20 min，放冷，加甲醇至刻度，轉(zhuǎn)移到10 mL具塞離心管中，離心5 min（11 000 r／min），上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，即得。

2.2.2 色譜條件

安捷倫5 TC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（ACN）-乙酸水溶液（0.1%），進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，30%ACN；2～12 min，30～70%ACN；12～13 min，70～90%ACN；13～15 min，90%ACN；15～16 min，90～30%ACN；16～20 min，30%ACN）；檢測波長為246 nm；流速為1.0 mL／min；柱溫箱溫度為30℃；進(jìn)樣量為10μL。

3 建立數(shù)學(xué)模型與不確定度的來源

3.1 建立數(shù)學(xué)模型

根據(jù)保留時(shí)間測其峰面積，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測溶液中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量濃度，由式（1）計(jì)算得到待測組分的含量（質(zhì)量比）。

式中：w為待測組分的含量（質(zhì)量比），μg／g；m為樣品稱重，g；ρ為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線算得待測組分的質(zhì)量濃度，μg／mL；V為樣品定容體積，mL。

各組分含量的不確定度除了受式（1）中ρ、m和V的影響外，樣品處理過程中的一致性和均勻性也會(huì)對(duì)含量產(chǎn)生影響，應(yīng)該加以考慮。

3.2 確定測量不確定度的來源

通過分析數(shù)學(xué)模型，確定測量不確定的來源如下：

（1）對(duì)照品引入的不確定度：對(duì)照品稱重引入的不確定度u（mst）、玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的不確定度u（Vst）、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度u（Cst）。

（2）樣品引入的不確定度：樣品稱重引入的不確定度u（msa）、樣品定容引入的不確定度u（Vsa）、樣品重復(fù)性引入的不確定度u（c）、回收率引入的不確定度u（R）。

（3）液相色譜儀引入的不確定度u（rHPLC）。

測量模型中，由于輸入量估計(jì)值相互獨(dú)立，所以合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel的計(jì)算公式如下：

由式（2）可推導(dǎo)出樣品的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 量化測量不確定度分量

4.1 對(duì)照品引入的不確定度

4.1.1 對(duì)照品純度引入不確定度u（mst）

采用十萬分之一天平稱重對(duì)照品，則不確定度的分量包括天平最大示值誤差u（m1）、分辨力u（m3）（示值可讀數(shù)）、重復(fù)性u(píng)（m2）、偏載u（m4）等的影響。從對(duì)照品的證書查得新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的純度分別為99.6%、99.4%、99.7%和99.5%，由于證書沒有給出對(duì)照品的誤差范圍，忽略不計(jì)。另外，環(huán)境溫度、重力加速度、大氣浮力均可忽略不計(jì)。經(jīng)查計(jì)量檢定證書，計(jì)算各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表1。

減重法存在二次稱重，因此表1中4項(xiàng)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 電子天平（d＝0.01 mg）各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度Tab.1 Standard uncertainty of each component for electronic balance（d＝0.01 mg）measurement mg

已知稱取新補(bǔ)骨脂異黃酮（N）、補(bǔ)骨脂素（P）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮（B）和異補(bǔ)骨脂素（L）對(duì)照品分別為5.45 mg、5.47 mg、5.65 mg和5.36 mg，則對(duì)照品稱重引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

4.1.2 玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Vst）

玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的不確定度由3個(gè)部分組成：容量允差u（V1）、估值誤差u（V2）、液體溫度和液體膨脹系數(shù)u（V3）。

urel（V1）：根據(jù)JJG 196—2006專用玻璃量器檢定規(guī)程，10 mL量瓶的容量允差為±0.020 mL，根據(jù)三角分布考慮，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel（V2）：10 mL量瓶的估值誤差為0.05 mL，根據(jù)三角分布考慮，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

urel（V3）：甲醇體積膨脹系數(shù)是1.2×10－3／℃，實(shí)驗(yàn)室溫度在±5℃之間變動(dòng)，根據(jù)均勻分布考慮，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜合上述3個(gè)分量，得10 mL容量瓶引入的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同理計(jì)算出其它玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表2，最終得

表2 玻璃量器的不確定度Tab.2 Uncertainty of each volumetric glassware mL

4.1.3 擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對(duì)不確定度urel（Cst）

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，進(jìn)行測定，以峰面積和工作溶液濃度進(jìn)行線性擬合，見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液校準(zhǔn)結(jié)果Tab.3 Results of calibration for standard solutions

根據(jù)擬合曲線，算得樣品中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素平均濃度C所產(chǎn)生的不確定度為：

式中：s（A）為標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差；為標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液平均質(zhì)量濃度，μg／mL；C為樣品溶液平均質(zhì)量濃度，μg／mL；N為平行測定的次數(shù)，N＝2；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；n為標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液測定的次數(shù)，n＝2×5＝10。

將各值代入公式（4），計(jì)算得到u（C），再由公式（5）計(jì)算得到由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

4.2 被測樣品引入的不確定度

4.2.1 稱量被測樣品引入不確定度urel（msa）

使用萬分之一電子天平稱重樣品，按照4.1.2節(jié)中的過程進(jìn)行計(jì)算，各分量的不確定度見表4。

減重法存在二次稱重過程，則表4中4項(xiàng)合成的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表4 電子天平（d＝0.1 mg）各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度Tab.4 Standard uncertainty of each component for electronic balance（d＝0.1 mg）measurement mg

精密稱取樣品0.525 5 g和0.515 4 g兩份樣品，則稱重引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.2.2 定容被測樣品引入不確定度urel（Vsa）

根據(jù)JJG 10—2005專用玻璃量器檢定規(guī)程，10 mL比色管容量允差是±0.10 mL，按三角分布考慮，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

充滿液體至刻度的估值誤差是0.5 mL，按三角分布考慮，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

最終合成得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.2.3 樣品重復(fù)性引入不確定度urel（c）

精密稱取樣品10 g，精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備溶液4 mL，混合均勻，在重復(fù)條件下，精密稱取樣品6份，各測定2次（n＝6，N＝2）。由式（6）、式（7）計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表5。

表5 樣品重復(fù)性結(jié)果（n＝6）Tab.5 Repetitive test results of samples（n＝6） μg·mL－1

4.2.4 回收率引入相對(duì)不確定度urel（R）

精密稱取空白樣品6份，進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別測定2次（N＝2，n＝6）。由式（8）、式（9）計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定，結(jié)果見表6。

表6 回收率結(jié)果（n＝6）Tab.6 Repetitive test results of recovery（n＝6） （%）

4.3 液相色譜儀引入的不確定度urel（rHPLC）

經(jīng)查校準(zhǔn)證書可知，液相色譜儀二極管陣列檢測器的不確定度為0.21%，按均勻分布考慮，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.4 評(píng)定測量不確定度

4.4.1 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

把各不確定分量代入式（3），計(jì)算得出相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（x）。

4.4.2 擴(kuò)展不確定度

根據(jù)模型和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算6份化妝品中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的含量均值w，取包含因子k＝2（置信概率95%）。按公式（10）計(jì)算得到的液相色譜法測定化妝品中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的擴(kuò)展不確定度分別為1.65μg／g、1.82μg／g、1.66μg／g和1.61μg／g。

4.5 不確定度報(bào)告

液相色譜法測定化妝品中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的含量分別為：

5 結(jié)論

對(duì)化妝品中4種禁用成分的不確定度分量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明7個(gè)不確定度因素均可以不同程度影響到化妝品中新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素的含量測定結(jié)果。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合為主要因素；對(duì)照品、樣品稱量及移液定容引入不確定度其次；樣品純度、回收率、重復(fù)性引入不確定度均較小?？梢圆捎迷黾酉盗袠?biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)；定期檢定和維護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器及量器，使其保持較高的靈敏度，或者將移液定容改為天平稱量；從而降低測量不確定度。

如果樣品基質(zhì)復(fù)雜，可采用內(nèi)標(biāo)法測定，從而降低基質(zhì)引入的不確定度。本次試驗(yàn)對(duì)20批化妝品進(jìn)行檢測，均未檢出新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和異補(bǔ)骨脂素4種物質(zhì)?？疾鞓悠窌r(shí)使用加標(biāo)樣品，建議在今后的工作中，配制的工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的濃度應(yīng)該盡量接近被測組分的濃度，以降低標(biāo)準(zhǔn)工作曲線變動(dòng)引入的不確定度。