楊寶雨，趙軍英，喬為倉，張明輝，劉彥品，侯俊財，陳歷俊*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室 哈爾濱 150030 2 北京三元食品股份有限公司 國家母嬰乳品健康工程技術(shù)中心 北京 100163）

母乳是新生兒生命第1 階段的唯一營養(yǎng)源，被視為嬰幼兒營養(yǎng) “金標準”。其中母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide，HMOs）是母乳的主要成分，因不易被人體胃、腸道消化，而在營養(yǎng)方面被忽視多年。然而，有研究表明，其復雜的結(jié)構(gòu)，使HMOs 具有重要的生理功能[1-3]。它可以通過補充益生元，黏附[4]、模擬腸道上皮細胞結(jié)合配體[5-6]，調(diào)節(jié)免疫應答等多種形式干擾有害物質(zhì)與宿主的相互作用，從而影響新生兒健康狀況[7]。

由于HMOs 無法大規(guī)模模擬，因此在嬰幼兒配方奶粉中添加的低聚糖主要是低聚半乳糖（Galactooligosacchari-des，GOS）和低聚果糖（Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）。Tungland 等[8]對GOS進行了全面的綜述，β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的GOS僅由半乳糖和葡萄糖單元構(gòu)成，不含HMOs 和牛乳低聚糖（Bovine milk oligosaccharide，BMOs）中典型的巖藻糖和唾液酸結(jié)構(gòu)。2016年后，部分高純單體HMOs 分子，如2'-巖藻糖基乳糖（2'-Fucosyllactose，2'-FL）和乳糖-N-新四糖（LNnT）已實現(xiàn)商業(yè)化模擬。雖然人體初步試驗證明，2'-FL與嬰兒配方奶粉中的其它低聚糖結(jié)合食用具有安全性和潛在的健康益處[9-11]，但僅模擬了HMOs 中一種或幾種分子結(jié)構(gòu)。迄今為止，還未從任何動物乳汁中提取復合低聚糖作為商業(yè)來源。Tao 等[12]發(fā)現(xiàn)BMOs 在結(jié)構(gòu)上與HMOs 相似，可作為一種與HMOs 生物學功能相近的代替營養(yǎng)源。通過膜分離技術(shù)分離富集BMOs，不僅能保持它的天然結(jié)構(gòu)，而且具有易操作、無相變和節(jié)能等優(yōu)點。在工業(yè)生產(chǎn)上使用膜分離技術(shù)提取BMOs 是可行的[13]。

本文從HMOs 的含量、分型、結(jié)構(gòu)特征、檢測方法、生理功能、消化吸收、模擬以及潛在代替品8 個方面綜述研究進展，旨在為HMOs 的研究、模擬、替代和商業(yè)化應用提供理論參考。

1 母乳低聚糖的含量及分型

HMOs 數(shù)量和組成在不同個體和哺乳期之間各不相同[14]。初乳一般是分娩后3～7 d 內(nèi)乳腺分泌的黏稠狀淡黃色液體，HMOs 質(zhì)量濃度高達20～25 g/L[15]。15 d 后過渡為成熟乳，此時HMOs 質(zhì)量濃度下降至5～20 g/L[16]，但仍比BMOs 高100～1 000倍。在牛乳基或羊乳基嬰幼兒配方奶粉中BMOs和羊乳低聚糖（Caprine milk oligosaccharide，CMOs）均小于1 g/L[17]。由表1可知，母乳中巖藻糖基化HMOs 較高，其它哺乳動物則相反。CMOs含量雖然高于BMOs，但奶山羊泌乳量較低。此外，HMOs 質(zhì)量濃度的巨大波動還反映了不同母親之間以及不同實驗室使用的非標準分析方法的差異。

表1 成熟母乳、牛乳和山羊乳中的宏量元素和低聚糖比較[12，15，18-22]Table 1 Macronutrients and oligosaccharides in mature human，bovine and caprine milk[12，15，18-22]

HMOs 的組成還反映Lewis 表型和ABH 分泌狀態(tài)。這主要取決于Se 基因編碼的α-1-2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase 2，F(xiàn)UT 2）和Le基因編碼的α-1，3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase 3，F(xiàn)UT3）[23]。具有活性Se 位點的個體被歸類為分泌型，其母乳中含有豐富的2′-FL、乳酰-N-巖藻五糖I（Lacto-N-fucopentaose I，LNFP I）和其它α-1-2-巖藻糖基HMOs。與之相比，非分泌型則缺乏FUT 2，即不含α-1-2-巖藻糖基HMOs。具有活性Le 位點的個體被歸為Le 陽性。其表達FUT 3，即α-1-4-巖藻糖基HMOs 轉(zhuǎn)移至N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）的亞末端[24-25]（圖1）。相反，Le 陰性母親的母乳缺乏這些特異性α-1-4-巖藻糖基化HMOs，如乳糖-N-巖藻五糖II （Lacto-N-fucopentaose II，LNFP II）。根據(jù)表型和分泌狀態(tài)，母乳可分為4 種類型：Lewis 陽性分泌型（Se+Le+）、Lewis 陽性非分泌型（Se-Le+）、Lewis 陰性分泌型（Se+Le-）和Lewis 陰性非分泌型（Se-Le-）。這4 組的母乳個體樣品分類只不過是HMO 復雜性的過度簡化，其它與Se和Le 無關(guān)的FUTs（FUT4、5、6、7 或9）也可能參與其中[4]。除了這些基因變異，其它因素也可能影響HMOs 的數(shù)量和組成，如營養(yǎng)和環(huán)境等方面。

圖1 Se、Le 基因與HMOs 類型[25]Fig.1 Se，Le genes and HMOs types[25]

2 HMOs 結(jié)構(gòu)及組成

2.1 HMOs 單體、核心系列和糖苷鍵

HMOs 結(jié)構(gòu)具有多樣性。在個體和哺乳期間，濃度和成分具有很大差異[26]。它們以游離、糖蛋白或糖脂等形式出現(xiàn)[27]。如表2所示，HMOs 結(jié)構(gòu)主要由5 中單體組成，而BMOs 多了一個N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-Hydroxyacetylneuraminic acid，NeuGc）單體，其中5%的酸性低聚糖含有NeuGc[28]。HMOs 中NeuGc 的缺乏，可能是由于300 萬年前，原始人的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的突變造成的[29]。每個HMOs 均以乳糖殘基為核心，通過β-1，3 糖苷鍵或β-1，6 糖苷鍵連接乳糖-N-二糖或N-乙酰乳糖胺單元延伸成直鏈（類型Ⅰ）或支鏈結(jié)構(gòu)（類型Ⅱ）。乳糖、短鏈線性或支鏈結(jié)構(gòu)，在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過α-1，2，α-1，3 或α-1，4 糖苷鍵延伸成巖藻糖基化寡糖或α-2，3，α-2，6 糖苷鍵延伸成唾液酸化寡糖[30]（圖2）。而BMOs 主要以乳糖、乳糖胺為核心。目前，只有7 個含有乳糖胺核心的BMOs 被報道[31]。同時，BMOs 還存在一個半乳糖與乳糖以β-1，3 或β-1，6 糖苷鍵相連的三糖核心，但豐度較低（圖2）[32-33]。此外，植物源中的組成單體種類較多（表2），分別由一系列半乳糖和果糖單體聚合成線性結(jié)構(gòu)（圖3）[28]。除葡萄糖和半乳糖單體之外，不存在與乳源低聚糖相同的組成單體。因此，植物源低聚糖可能只具備復雜HMOs 和BMOs 的部分功能。

圖2 低聚糖延長方式Fig.2 Oligosaccharide elongation mode

表2 母乳低聚糖、牛乳低聚糖及植物源低聚糖組成單體比較Table 2 The composition monomer of HMOs，BMOs and plant-derived oligosaccharides

圖3 母乳低聚糖、牛乳低聚糖、低聚半乳糖、低聚果糖和菊粉的結(jié)構(gòu)比較[28]Fig.3 Structure comparison of HMOs，BMOs，GOS，F(xiàn)OS and inulin[28]

除乳糖外，母乳中還存在大約1 000 種HMOs分子[34]，大多數(shù)以少量出現(xiàn)。根據(jù)HMOs 的結(jié)構(gòu)特性，將其大約分為17 種中性低聚糖核心結(jié)構(gòu)[35-38]（表3）。此外，如表4所示，12 種糖苷鍵也豐富了HMOs 的結(jié)構(gòu)。主要包括3 種半乳糖苷鍵、2 種N-乙酰氨基葡萄糖苷鍵、4 種巖藻糖苷鍵和3 種唾液酸糖苷鍵。總之，HMOs 的多樣性受不同糖單元（表2）、聚糖長度、大小、核心序列（表3）和12 種糖苷鍵的影響（表4）[4]。

表3 乳糖和可作為其它HMOs 核心結(jié)構(gòu)的中性非巖藻糖基HMOsTable 3 Lactose and neutral non-fucosyl HMOs that can serve as the core structure of other HMOs

（續(xù)表3）

表4 構(gòu)成不同HMOs 的12 個糖苷鍵[23，40]Table 4 Twelve glycosidic linkages that constitute diverse HMOs[23，40]

（續(xù)表4）

2.2 HMOs 的結(jié)構(gòu)表征

HMOs 組分極其復雜，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)200種HMOs[32，50]，已經(jīng)分離和鑒定了至少157 種不同的HMOs 結(jié)構(gòu)[23，42]。而BMOs 和CMOs 僅鑒定出50種[51]。成分識別和結(jié)構(gòu)鑒定需通過一種或多種組合技術(shù)實現(xiàn)，主要包括氚標記、熒光衍生化、甲基化、糖苷酶消化、1H 和13C 核磁共振波譜表征（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、高效液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測（High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD），毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）和質(zhì)譜（Mass spectrometric，MS）技術(shù)等[52]。如表5所示，母乳中巖藻糖基化低聚糖含量占比較高，約占母乳中總低聚糖的70%，其中2′-FL 高達4.65 g/L[10]。與HMOs 相比，BMOs 中唾液酸化低聚糖含量較高。至少存在15 種BMOs 和CMOs 與HMOs 具有相同的結(jié)構(gòu)（表5），即具有相同的功能[53]。因此，從其它哺乳動物乳汁中提取低聚糖，將其作為活性物質(zhì)添加到嬰幼兒配方奶粉中具有重要價值。此外，BMOs 的聚合度通常比HMOs 小，主要由三糖和四糖組成，最高為7 聚體，而HMOs 中最高可達15 聚體。

表5 HMOs 和BMOs 共有的結(jié)構(gòu)Table 5 Common structure between BMOs and HMOs

（續(xù)表5）

3 母乳低聚糖的檢測方法

HMOs 具有重要的生物學功能，由于它的復雜性，其表征技術(shù)遠遠落后于核酸和蛋白質(zhì)技術(shù)。即使了解了HMOs 的序列，仍不能對其進行完整的表征。例如：連接2 個環(huán)己糖的糖苷鍵，可以通過5 種羥基中的任一種實現(xiàn)（圖4）[65]。此外，還存在糖基化現(xiàn)象。因此還必須確定鏈的長度、立體化學結(jié)構(gòu)和分支度。分支易發(fā)生在低聚糖中，很少在多肽或蛋白質(zhì)中出現(xiàn)。例如：氨基酸在蛋白質(zhì)的主鏈中只有一種連接方式（酰胺鍵）。傳統(tǒng)上主要是通過甲基化、特異性內(nèi)切糖苷酶、外切糖苷酶、凝膠過濾、紙層析、薄層層析、CE、HPLC、HPAECPAD、NMR 等多種技術(shù)相結(jié)合的方式對乳低聚糖的結(jié)構(gòu)進行表征。然而，這些方法通常需要超過1 mg 的低聚糖樣品[66]，對低濃度HMOs 和BMOs 研究是一個限制。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）、電噴霧（Electrospray ionization，ESI）解吸離子化以及碰撞誘導離子化（Collision induced dissociation，CID）等電離技術(shù)使高分辨率質(zhì)譜（飛行時間質(zhì)譜、四極桿-飛行時間質(zhì)譜等）在低聚糖研究方面取得了重大突破。此外，Wu 等[20]還引入納升液相色譜-芯片-飛行時間質(zhì)譜來分析HMOs，結(jié)果表明其對異構(gòu)體具有良好的分離效果。目前，主要的檢測方法，如表6所示。

圖4 環(huán)己糖結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of hexos

獻文考參[67][68][23][69][20]，[36]，[50][32]，，[70][48][71]，[72][7][73][74]，[76][75]，[77][16]，[80][78]法方測檢糖聚低乳母用常6表Methods of detection of human milk oligosaccharides Table 6 價評法方劑試生衍備設測檢的化基糖藻巖或化酸液唾被15 個定測時同可項一了立建胺酰甲苯基2-氨譜色相液率辨分0.999于高數(shù)系關(guān)，相性線的好良和度敏靈高有HMOs，具哺了察，觀異差量含的HMOs種12中品樣乳母同不定測過通-譜質(zhì)聯(lián)串相化變的HMOs期乳化變的天90第到天3第后產(chǎn)從在HMOs種20和糖乳了定測-培安沖脈-譜色換交子離陰效在兒生新和量總糖聚低乳母了析，分糖聚低要主種18了量定-培安沖脈-譜色換交子離陰效系聯(lián)的間之成組群物生微便糞的內(nèi)月個1第后生出型泌分和型Lewis 血括包，還庫據(jù)HMOs 數(shù)性中45 個了立建-子離霧噴-電譜色相液效高升HMOs 別識速快于用，可息信等譜質(zhì)間時行-飛圖譜質(zhì)的品樣乳母同不位5對，并構(gòu)結(jié)HMOs種余200了現(xiàn)發(fā)-譜質(zhì)-片芯-譜色相異差在存分成HMOs間之體個同不現(xiàn)，發(fā)較比了行進構(gòu)結(jié)HMOs的基糖藻巖同不個74了析解下式模子離負-時行飛-離電吸解光激助輔質(zhì)譜質(zhì)上床臨在2'-FL的中HMOs明表，并HMOs的要主種8了測檢化酰甲苯譜色相液效高相關(guān)有瀉腹兒嬰防預與2'-FL、LDFT 和出，得化變量HMOs 含10 種的中乳初了定測-5-基-3-甲基1-苯譜色相液效高相感抗和元生益對期早乳哺在兒嬰了映反能可化變的度LNT 濃吡基、2-氨酮啉唑吡求需的物藥染啶性中要主種9的中乳母100 d和，30 d，10 4后產(chǎn)了定測啶吡基氨2-譜色相液效高相的HMOs性中總占糖聚低些，這中乳熟成和乳初，在HMOs 73%HMOs性中種11了定，測法方生衍的酸甲苯基氨鄰進改過通酸甲苯基氨2-譜色相液效高相，發(fā)異差糖聚低乳母的區(qū)地個2了較比。并HMOs性酸種6和遺是能可測，推異差著顯現(xiàn)出HMOs性，中似相HMOs性酸現(xiàn)因原的傳唾察觀于用，適HMOs酸液唾要主種12了量定時同內(nèi)35 min法譜色管細毛動電束系關(guān)的險風病疾定特兒嬰低降對化變達表HMOs 的酸液的中胃腸在HMOs測，監(jiān)HMOs種10的內(nèi)月個6后產(chǎn)了定測，6-，3-1基芘基氨8-泳電管細化變酸磺三高液高高納阱液基間反反反反膠毛柱譜色ACQUITY UPLC BEH Amide Amino Column CarboPac PA-100 CarboPac PA-1 Porous Graphitic Carbon-Chip Hypercarb Porous Graphitized Carbon column Hypercarb Porous Graphitized Carbon Column Rainin C-8 Inertsil ODS-3V and ODS-100Z Inertsil ODS-3V TSKgeODS-100Z--

4 HMOs 的功能

從母乳中提取的HMOs 混合物常用來進行功能研究，然而沒有足夠數(shù)量的純HMOs，因此單個HMOs 的功能作用尚不清楚。母乳喂養(yǎng)的益處早在19世紀末就已被觀察到[25]，最初HMOs 被認為具有“雙歧因子”作用。但自20世紀90年代初以來，越來越多的證據(jù)表明，HMOs 不僅僅是促進嬰兒腸道內(nèi)微生物菌群生長的基質(zhì)，還具有以下功能：

4.1 益生元

HMOs 不易被上消化道消化吸收，能完整到達結(jié)腸，可為結(jié)腸細胞提供營養(yǎng)和能量。在厭氧條件下，選擇性的被雙歧桿菌和擬桿菌等益生菌利用（圖5），產(chǎn)生后生元和短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs），如乙酸、丙酸和丁酸等物質(zhì)。此外，較低pH 值的腸道微環(huán)境也不利于有害菌群的生長（梭狀芽胞桿菌、腸球菌、真細菌和腸桿菌等），從而發(fā)揮益生元作用[81-83]。

當在無菌小鼠體內(nèi)接種泰奧他米克龍類桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）后，LNnT 與飲用水一起灌胃，嬰兒雙歧桿菌相對豐度增加到40%以上[84]，而泰奧他米克龍類桿菌無顯著變化；然而當LNnT 不在飲食中時，嬰兒雙歧桿菌的相對豐度僅為2%左右，說明LNnT 為嬰兒雙歧桿菌生長提供了優(yōu)勢。

BMOs 作為益生元的研究較少，Jakobsen等[85]比較了BMOs 和GOS 對8 種主要嬰兒腸道細菌的單一和共培養(yǎng)的影響，結(jié)果顯示BMOs 具有促進長雙歧桿菌長亞種（B.longum ssp.longum）和吉氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis）生長，抑制產(chǎn)氣莢膜桿菌（Clostridium perfringen）和大腸桿菌（Escherichia coli.）的作用。Ward 等[86]將BMOs 和HMOs 分別作為嬰兒長雙歧桿菌發(fā)酵底物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加BMOs 的嬰兒雙歧桿菌生長狀況優(yōu)于HMOs 的效果，可能是嬰兒雙歧桿菌易消耗聚合度小于7 的化合物，而BMOs 聚合度小于HMOs。因此，BMOs 也是嬰兒雙歧桿菌的良好食物來源[87]。

4.2 抗細菌、病毒和寄生蟲作用

腸黏膜具有較大的表面積，也是糖基化程度最高的組織之一[88]。覆蓋著復雜的聚糖，包括低聚糖、糖蛋白、糖脂和黏蛋白等[89]。其中HMOs 的主要功能被認為是調(diào)節(jié)細胞外環(huán)境，包括細胞間通訊、分子識別和屏障功能等。細菌和病毒感染的第1 步是識別和結(jié)合腸黏膜上特定細胞的表面聚糖[90]。唾液酸化和巖藻糖基化低聚糖含有與這些聚糖類似的結(jié)構(gòu)單元。因此HMOs 可以作為受體類似物，抑制病原體的黏附，從而防止感染（圖5）[91]。諾如病毒或輪狀病毒是嬰幼兒嚴重腹瀉的最常見原因之一[92]，每年造成近50 萬人死亡[93]。研究發(fā)現(xiàn)，α-1，2-巖藻糖基化HMOs 對減少空腸彎曲菌相關(guān)性腹瀉起有益作用，已在墨西哥市100 對母嬰的前瞻性研究中得到證實[7]。Morrow 等[7]在93對母嬰研究中，收集了2年內(nèi)嬰兒喂養(yǎng)和腹瀉數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)母乳中的2′-FL 和乳糖-N-二巖藻糖與嬰兒彎曲桿菌和杯狀病毒腹瀉的發(fā)生率呈負相關(guān)。因此，HMOs 分子可以與病毒結(jié)合并降低感染風險[94]。

此外，抗黏附、抗菌作用不僅適用于細菌和病毒，也可能適用于原生動物寄生蟲，如溶組織內(nèi)阿米巴。全世界大約5 000 萬人感染了溶組織內(nèi)阿米巴，導致阿米巴痢疾或阿米巴肝膿腫，每年造成近10 萬人死亡，成為寄生蟲病第三大死因，僅次于瘧疾和血吸蟲病[95]。Jantscher-krenn 等[96]表明溶組織內(nèi)阿米巴的主要毒力因子之一是HMOs 中的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺特異性凝集素，有助于腸上皮細胞的殺傷和吞噬作用。Urakami 等[97]以HMOs 為陽性對照，比較了BMOs 和CMOs 對腸道沙門菌ⅡD604（S.enterica IID604）與Coao-2 細胞的黏附抑制作用。Maldonado-Gomez 等[98]在體外試驗中，證明了BMOs 可以阻止致病性大腸桿菌、阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhymurium）與Hep-2 細胞的黏附作用。Leong 等[99]發(fā)現(xiàn)CMOs 能夠阻止大腸桿菌NCTC10418 和鼠傷寒沙門氏菌與Caco-2 細胞的黏附，為HMOs、BMOs 和CMOs 作為潛在抗感染劑提供了有力的證據(jù)。

4.3 腸上皮細胞應答調(diào)節(jié)因子

HMOs 中的唾液酸可以附著在腸上皮細胞上，直接影響誘導差異基因表達和調(diào)節(jié)細胞反應（圖5）。因此，當HMOs 存在時，腸致病性大腸桿菌與腸上皮細胞的結(jié)合明顯減少[100]。Kuntz 等[101]通過改變與生長相關(guān)的細胞周期基因，證實了HMOs 可以抑制腸上皮細胞生長并誘導其分化和凋亡。仍需進一步研究以確定HMOs 用來觸發(fā)差異基因表達的受體和信號通路途徑。Kuntz 等[102]研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）和Ras / Raf / ERK 信號通路可能參與其中，但HMOs 是直接與EGFR 相互作用，還是間接調(diào)節(jié)EGFR 的信號仍尚待確定。3′SL 是BMOs 的主要成分，現(xiàn)有證據(jù)表明它可以調(diào)節(jié)腸上皮細胞表面的多糖，從而減少或增加細菌的附著位點[100]。Alicia 等[103]通過CMOs 與Caco-2/HT29-MTX 腸上皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其增加了腸上皮細胞的跨上皮電阻、黏蛋白基因表達和黏蛋白蛋白豐度?？傊?，HMOs、BMOs 和CMOs 成分均可以直接調(diào)節(jié)腸上皮細胞。

4.4 免疫調(diào)節(jié)劑

根據(jù)觀察到的血液、尿和糞便情況，發(fā)現(xiàn)少量的HMOs 可能從胃腸道吸收并進入全身循環(huán)[104]。當臍血T 細胞與唾液酸化HMOs 接觸時，會增加產(chǎn)生干擾素-γ 的CD3+、CD4+和CD3+、CD8+淋巴細胞以及產(chǎn)生白細胞介素-13 （Interleukin-13，IL-13）的CD3+、CD8+淋巴細胞[105]。這項研究推測，唾液酸化的HMOs 影響淋巴細胞成熟，促進T 細胞向更平衡的Th1/Th2 細胞因子生產(chǎn)轉(zhuǎn)變。Velupillai 等[106]在小鼠感染模型中發(fā)現(xiàn)，富含HMOs 的乳糖-新四糖結(jié)構(gòu)能誘導產(chǎn)生白細胞介素10（Interleukin 10，IL 10），Tao 等[12]在成熟牛乳中也檢測到相同的結(jié)構(gòu)。BMOs 在免疫調(diào)節(jié)方面的研究較少，Martín 等[107]以7 種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌株為研究對象，研究了BMOs 對血液毒性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)BMOs 可以作為抗感染劑用于人類和奶牛。此外，HMOs 的組成在個體之間不同，意味著不同母親的母乳對嬰兒免疫系統(tǒng)的影響不同，從而導致嬰兒患過敏、哮喘或其它與免疫系統(tǒng)有關(guān)疾病的風險不同。此外，Eiwegger 等[108]研究發(fā)現(xiàn)唾液酸化的HMOs 會減少花生過敏患者淋巴細胞亞群中IL-4 的產(chǎn)生，有助于預防過敏。以上研究表明，HMOs 和BMOs 均可以通過調(diào)節(jié)免疫反應保護新生兒。

4.5 神經(jīng)發(fā)育

含有NeuAc 結(jié)構(gòu)的低聚糖可以促進嬰幼兒大腦發(fā)育[109]。人體雖然可以從肝臟中合成NeuAc，但嬰幼兒時期，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-2-表異位酶的活性較低，可能存在發(fā)育能力超過合成能力的現(xiàn)象。出生前幾個月到出生后幾年之間，大腦中的唾液酸濃度增加了一倍以上。大腦的發(fā)育和認知在一定程度上依賴含有神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸和含有糖蛋白的多聚唾液酸[110]（圖5）。Wang等[111]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，當飼料中添加唾液酸化的酪蛋白糖巨肽時，仔豬的學習和記憶能力增強。Sakai 等[112]通過給成年大鼠飼喂唾液酸乳糖后，發(fā)現(xiàn)腦神經(jīng)節(jié)苷脂和游泳能力的都得到了提高。此外，Vázquez 等[113]通過研究表明，嚙齒動物攝入2'-FL 可改善學習和記憶能力。Wang 等[114]通過對新生兒的尸檢分析表明，母乳喂養(yǎng)的嬰兒大腦中神經(jīng)節(jié)苷脂唾液酸和含有糖蛋白的多聚唾液酸濃度明顯高于配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒。因此，唾液酸低聚糖添加到嬰幼兒配方或其它功能性食品中，可以作為大腦激活因子。

4.6 對乳母的保護作用

母乳并非無菌，其含有復雜的菌群，且個體之間差異較大[115]。母乳中的細菌可以接種到嬰兒腸道，也可以被視為調(diào)節(jié)母乳成分的潛在共生菌或?qū)е氯橄傺椎燃膊〉牟≡w。到目前為止，母乳低聚糖的潛在益處大都與母乳喂養(yǎng)的嬰兒有關(guān)。然而，母乳低聚糖也可能影響乳母，其潛在機制可能類似（圖5），即HMOs 可作為益生元或抗菌劑影響乳腺中的葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、乳酸桿菌和腸球菌等細菌或直接調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞應答和局部免疫反應[25]。葡萄球菌是造成乳腺炎的一個主要原因[116]。Lane 等[117]基于生物傳感器的快檢方法，發(fā)現(xiàn)部分葡萄球菌菌株可以與HMOs 中的2′-FL 結(jié)合，然而是否可以降低乳腺炎風險尚不清楚。此外，Hallgren 等[118]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在妊娠期孕婦的尿液中檢測到了HMOs。因此，HMOs 不僅對嬰兒有重要的生理功能，而且對乳母也有潛在的益生元和抗菌作用。

圖5 HMOs 的功能[91]Fig.5 Functions of HMOs[91]

5 消化和吸收特性

嬰兒缺乏水解或消化HMOs 所必需的酶，使得HMOs 能夠抵抗胃酸、胰酶和刷狀緣酶的降解，從而進入結(jié)腸[119-120]。因此，從嚴格意義上說，HMOs不是嬰幼兒的營養(yǎng)素，而是膳食纖維的一種。大約1%的HMOs 被吸收并在全身循環(huán)，它們很可能到達腸道以外的許多器官，包括肝臟和大腦，以及呼吸道和泌尿道，而后隨尿液以完整或部分降解的形式排出[121-122]。而大多數(shù)的HMOs 被腸道微生物代謝或隨糞便排出[78-79]。因此，母乳低聚糖的生物學功能可能不局限于腸道，也可能會在新生兒多個不同水平上影響嬰兒。

6 HMOs 的模擬與應用

HMOs 在嬰兒身體健康方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[123]。受限于原料來源和倫理問題，導致HMOs 大多不存在于嬰兒配方奶粉中。此外，牛乳中天然BMOs 含量較低，其開發(fā)仍處于初級階段。因此，通常把GOS 和FOS 添加到嬰幼兒配方奶粉中，以期達到與母乳喂養(yǎng)相似的腸道菌群。GOS 是由乳糖經(jīng)β-半乳糖苷酶催化形成的不同鏈長非均相混合物，一般由3～8 個半乳糖分子和1 個葡萄糖殘基組成，具有類似于HMOs 益生元的功效[124]。FOS是由果糖以β-2，1 或β-2，6 糖苷鍵連接而成的線性或分支型果糖聚合物，通常在末端連接一個葡萄糖殘基，易在菊苣/芋中提取[125]。Knol 等[126]通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)，喂食含有GOS 和FOS （質(zhì)量比9：1）的配方奶粉會得到與母乳喂養(yǎng)嬰兒相似的腸道菌群。Roberfroid[127]和Boehm[90]對FOS 和GOS 的臨床和益生元效果進行了綜述。盡管已證明在許多靶點有效，如減少嬰兒特應性皮炎的發(fā)生率[128]，但在結(jié)構(gòu)上與HMOs 和BMOs 有很大不同 （圖3）。FOS 和GOS 是線性鏈，而HMOs 和BMOs 是支鏈結(jié)構(gòu)。前者不存在巖藻糖、唾液酸和N-乙酰葡糖胺等單體，也沒有表現(xiàn)出固有的結(jié)構(gòu)復雜性。為彌補嬰幼兒配方奶粉與母乳之間的差距，已開發(fā)出許多模擬HMOs 方法。例如：化學催化、酶催化、微生物發(fā)酵、膜分離以及轉(zhuǎn)基因等。如表7所示，全球主要的HMOs 生產(chǎn)廠家約10 家。

表7 全球主要市售HMOs 及其生產(chǎn)廠家Table 7 Global commercially available HMOs and their manufacturers

化學模擬需要對每一個HMOs 分子進行重復保護和脫保護步驟。Dékany 等[129]使用化學方法開發(fā)了一種晶體中間體技術(shù)，來輔助保護HMOs 的純化步驟，并利用該方法快速模擬了2′-FL。盡管化學模擬方法得到了發(fā)展，但對于工業(yè)規(guī)模的HMOs 模擬仍有一些缺陷，如只能模擬短鏈HMOs、立體選擇性和總產(chǎn)率低以及存在有毒試劑殘留風險等。因此，酶法和微生物法得到快速發(fā)展。例如，Choi 等[130]使用幽門螺桿菌的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，以核苷酸糖和GDP-β-L-巖藻糖為供體模擬了2′-FL 或3′-FL 結(jié)構(gòu)。Endo 等[131]使用細菌唾液酸轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中表達模擬唾液酸化HMOs。Thomas 等[132]利用從母乳中純化的FUT3，模擬了唾液酸化路易斯a、路易斯a 抗原和X 抗原，但僅限于小規(guī)模的制備。由于耦合微生物方法的高復雜性和低生產(chǎn)率，現(xiàn)又開發(fā)了使用重組大腸桿菌系統(tǒng)的單細胞方法。Ishikawa 等[133]在重組大腸桿菌細胞中，通過表達集胞藍細菌slr1975 基因編碼的GlcNAc 2-差異構(gòu)酶和NeuAc 合酶基因編碼的NeuAc 合成酶模擬出NeuAc。

依據(jù)低聚糖的分子質(zhì)量大小，可采用膜分離法進行提取。Sarney 等[134]利用β-半乳糖苷酶和納濾開發(fā)了一種從脫脂母乳中回收HMOs 的方法。運用此法可從1 L 脫脂母乳中獲得約6.7 g HMOs，并且酶解技術(shù)顯著提高了膜分離的效率和選擇性。Altmann 等[135]以酶解脫脂牛乳為原料，采用不同的納濾膜，實現(xiàn)了實驗室、中試和工業(yè)規(guī)模的BMOs 富集。Cohen 等[136]采用超濾和納濾集成技術(shù)富集了天然GMOs，其回收率達90%。此外，將人FUT2 基因?qū)胄∈?，可表達2′-FL。Kelder 等[137]將同源系半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胄∈笠踩〉昧祟愃频慕Y(jié)果，這表明乳腺會在糖基轉(zhuǎn)移酶存在下產(chǎn)生相應的低聚糖[138]。同時，將2 種不同巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胄∈?，還能夠模擬巖藻糖基化糖綴合物。因此，對小鼠進行轉(zhuǎn)基因操作，可以預期地表達基因產(chǎn)物、糖基轉(zhuǎn)移酶、低聚糖和重組糖蛋白等物質(zhì)。

2'-FL 和LNnT 是HMOs 中最豐富的2 種寡糖，大約占總HMOs 的35%。于2015年獲得歐盟和美國食品藥品監(jiān)督管理局的監(jiān)管許可，其最大添加量及使用范圍如表8所示。Marriage 等[10]和Reverri 等[139]通過喂養(yǎng)臨床試驗發(fā)現(xiàn)，含2'-FL 的嬰兒配方奶粉可以有效維持嬰兒的生長和耐受性，且2'-FL 的相對吸收和排泄與母乳喂養(yǎng)方式無顯著差異。我國對2'-FL 能否作為一種新的食品添加劑，仍處于社會公開征求意見階段（表8）。此外，僅添加1 種或2 種HMOs 到嬰幼兒配方奶粉中無法再現(xiàn)母乳HMOs 的復雜作用。因此，開發(fā)一種HMOs 替代品需要亟待解決。

表8 我國及其他發(fā)達國家關(guān)于HMOs 最大添加量及使用范圍aTable 8 The maximum amount and scope of HMOs in China and and other developed countriesa

7 BMOs 可作為模擬HMOs 的潛在來源

牛乳清是制作奶酪時產(chǎn)生的副產(chǎn)物，通常當作廢液排掉[140]或通過噴霧干燥制備乳清粉以低價出售[141]。與其它畜乳汁相比，具有量大和成本低等特點。因此，利用乳清進行大規(guī)模提取BMOs 作為HMOs 替代品具有重大意義。通過中式膜設備從乳清中分離BMOs 的工藝已經(jīng)研發(fā)出來[136，142]。BMOs 的功能研究也逐漸從體外轉(zhuǎn)向體內(nèi)和臨床試驗[143]（圖6）。Daniel 等[144]研究發(fā)現(xiàn)，乳清中的許多BMOs 組成與HMOs 相同。在測定的15 種酸性BMOs 中，3 種也存在于HMOs 中，8 種中性BMOs中，4 種也存在于HMOs 中。此外，HMOs 中的成分不一定每個都有效，組合起來效果似乎更好。Locascio 等[81]利用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法對雙歧桿菌消耗HMOs 進行了糖組學分析，研究表明嬰兒腸道分離的嬰兒長雙歧桿菌ATCC 15697 （Bifidobacterium longum biovar infantis ATCC 15697）消耗了總HMOs 的63.9%，主要包括5 個最豐富的短鏈HMOs 和3 個長鏈HMOs。

圖6 BMOs 研究進程Fig.6 Research progress of BMOs

團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，乳清滲透液中游離BMOs總濃度比原料乳高10 倍[67，145]，此結(jié)果與目前文獻中所述的牛乳只含有微量低聚糖相比，該濃度要高得多。脫除乳糖后，BMOs 濃度可再提高4 倍。因此，膜分離技術(shù)為工業(yè)化生產(chǎn)HMOs 替代品提供了新的解決方案。

8 結(jié)論

HMOs 含量在母乳中僅次于乳糖及脂質(zhì)。越來越多的證據(jù)表明，母乳的保護作用可能部分歸因于HMOs，如益生元、病原體抑制、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和大腦發(fā)育等。HMOs 在分子結(jié)構(gòu)方面也不同于經(jīng)典的GOS 和FOS。為彌補嬰幼兒配方奶粉與母乳之間的差距，部分發(fā)達國家已將2'-FL 和LNnT 作為嬰幼兒配方奶粉的補充劑。目前，盡管還沒有商業(yè)化乳源性HMOs 代替物，但許多研究已表明，BMOs 具有HMOs 類似的結(jié)構(gòu)和生物功能，并且在工業(yè)規(guī)模上使用膜分離技術(shù)提取可行的。因此，商業(yè)開發(fā)化BMOs 模擬GOS、FOS 和HMOs，并應用于嬰幼兒配方和特殊醫(yī)學等功能性食品上，既有食品健康的需求，也符合牛乳高附加值加工趨勢。然而全方位的HMOs 模擬仍不能被商業(yè)化，因此母乳仍然是嬰兒喂養(yǎng)的“黃金標準”。