黃曉麗，吳松，黃麗，王鵬，陳中祥，覃東立,3*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黑龍江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，黑龍江 哈爾濱 150076；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141)

稻漁綜合種養(yǎng)是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、資源開發(fā)和環(huán)境保護(hù)相互協(xié)調(diào)發(fā)展的生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)模式之一[1]。近年來，稻漁綜合種養(yǎng)模式得到大力扶持和推廣，2019年養(yǎng)殖面積達(dá)231.75 萬hm2，產(chǎn)量超過290萬t[1]。隨著稻漁綜合種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)規(guī)模的提高，稻田病蟲草害防治過程中施藥與養(yǎng)殖生物生長風(fēng)險及質(zhì)量安全之間的矛盾日益突出[2-3]。農(nóng)藥不僅對水生動物具有致死效應(yīng)，還影響其個體發(fā)育、生殖及行為[4-5]，導(dǎo)致生物體組織病理變化[6-7]，引起生物體脂質(zhì)過氧化損傷和相關(guān)抗氧化酶活力變化等[8-9]。因此，系統(tǒng)評估稻田施用農(nóng)藥對養(yǎng)殖生物的毒性效應(yīng)對于科學(xué)養(yǎng)殖及指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要意義。

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是中國重要經(jīng)濟(jì)甲殼類養(yǎng)殖品種之一。稻蟹種養(yǎng)在東北地區(qū)發(fā)展較快，2019年東北三省稻田養(yǎng)殖面積超過1533.33 km2，遼寧省盤錦市是中國北方最大的中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地[10]。中華絨螯蟹的生長、代謝及繁殖受溫度、營養(yǎng)鹽濃度、重金屬、有機(jī)污染物等環(huán)境因素影響較大[11-14]。水稻種植過程中廣泛使用的除草劑已被證實對中華絨螯蟹具有急性毒性，有學(xué)者在殘留效應(yīng)、組織病理等方面開展了相關(guān)研究[15-18]。苯噻酰草胺是一種在東北地區(qū)廣泛使用的高效、高選擇性的觸殺性除草劑，對水生生物的直接毒性較低，但可轉(zhuǎn)換為毒性較強的二烷基醌亞胺[19]。該農(nóng)藥能夠誘發(fā)斑馬魚(Brachydanioreriovar)紅細(xì)胞核異變，具有遺傳毒性[20]；與其他化合物聯(lián)合作用時對水蚤毒性較大[21]，但其對中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性尚未見報道。

本研究結(jié)合除草劑施用的實際情況，以中華絨螯蟹幼蟹作為研究對象，采用半靜態(tài)體外暴露法，考察了中華絨螯蟹幼蟹短期暴露于苯噻酰草胺14 d過程中蟹體內(nèi)鰓和肝胰腺組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的含量變化，綜合評價了苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹的脂質(zhì)過氧化損傷和相關(guān)抗氧化酶系統(tǒng)的影響，旨在為稻漁綜合種養(yǎng)模式中農(nóng)藥施用及科學(xué)養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

因稻田中苯噻酰草胺的施用時間在每年的5月，因此本研究選擇的受試生物為農(nóng)藥施用期的中華絨螯蟹幼蟹。實驗用中華絨螯蟹幼蟹購自遼寧省盤錦市養(yǎng)殖基地，體重為(20.56±2.40)g。正式實驗前將購買的中華絨螯蟹幼蟹于充分曝氣的自來水中暫養(yǎng)2周，平均水溫(25±2)℃，pH為6.55～7.53，暫養(yǎng)期間正常投喂。暫養(yǎng)后隨機(jī)選取規(guī)格一致、健康有活力、體色正常、無外傷、附肢健全的幼蟹進(jìn)行毒性效應(yīng)實驗。

1.2 儀器與試劑

U-4100紫外可見分光光度計(日本日立)、DZKW-4恒溫水浴箱(北京永光明)、Allegra X-30R低溫冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter)、VORTEX 3漩渦混勻器(德國IKA)、T25組織勻漿機(jī)(德國IKA)。供試藥品為純度98%的苯噻酰草胺粉末狀原藥，購于江西眾和生物科技有限公司；丙酮(分析純)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實驗所需的SOD、CAT、MDA和蛋白質(zhì)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 急性毒性實驗

實驗在玻璃缸(長35 cm×寬15 cm×高25 cm)中進(jìn)行。實驗用水為曝氣自來水，水溫在24～28 ℃之間、pH在6.57～7.68之間，24 h連續(xù)曝氣，水體溶解氧(DO)保持在6.0 mg/L以上，實驗期間不投喂。實驗采用半靜態(tài)體外暴露法，首先通過預(yù)實驗確定幼蟹的24 h全死亡濃度(10 mg/L)和96 h無死亡濃度(0.01 mg/L)。在0.01～10.00 mg/L的濃度之間，按照等比級數(shù)設(shè)6個濃度梯度(0.01、0.04、0.16、0.64、2.50 和10.00 mg/L)，并設(shè)置空白對照組(曝氣自來水)以及助溶劑(丙酮)對照組，每個濃度組設(shè)4 個平行。每個玻璃缸放入6只中華絨螯蟹幼蟹，以96 h為一個實驗周期，每24 h更換一次實驗溶液。實驗開始后，定時觀察幼蟹的存活狀況，測定水體pH、DO和溫度，分別記錄幼蟹在24、48、72及96 h時的行為變化和死亡情況，及時撈出死亡的實驗動物。

1.4 相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

急性毒性實驗結(jié)束后，繼續(xù)在相同的條件下進(jìn)行氧化應(yīng)激指標(biāo)考察實驗。分別于實驗的0、4、10和14 d，從各濃度組取出3～4只存活的幼蟹。實驗過程中，0.63、2.51、10.00 mg/L苯噻酰草胺濃度組的受試幼蟹全部死亡，因此不進(jìn)行分析。幼蟹置于冰上，迅速解剖取出鰓和肝胰腺組織，經(jīng)預(yù)冷的PBS緩沖溶液淋洗，用濾紙吸收組織表面水分。稱取0.2 g采集的組織樣品，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水以1∶9(W∶V)的配比冰浴勻漿，5 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液測定蛋白質(zhì)、SOD、CAT和MDA，具體操作步驟按照試劑盒中的說明書進(jìn)行。組織中可溶性蛋白質(zhì)含量，抗氧化指標(biāo)SOD、CAT 活性及MDA含量的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒的方法測定。

1.5 半致死濃度(LC50)與安全濃度(SC)計算

采用寇氏法計算苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹的半致死濃度(LC50)[21]。計算公式如下：

LgLC50=Xm-i(∑P-0.5)

式(1)

安全濃度(Safe concentration，SC)計算公式如下[22]：

SC=LC50(96h)×0.1

式(2)

其中，LgLC50為半致死濃度10為底的對數(shù)值，Xm為最大處理濃度的對數(shù)值，i為相鄰組濃度對數(shù)差，∑p為各濃度組死亡率總和。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(X ± SE)表示，利用Prism 7.0 軟件繪制圖片，SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用單因素方差分析法(One-way ANOVA)分析急性脅迫引起的各不同濃度梯度間差異，以P<0.05為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性

不同濃度苯噻酰草胺脅迫下的中華絨螯蟹幼蟹隨著暴露時間的延長出現(xiàn)了不同程度的中毒癥狀。實驗期間，空白對照組和溶劑對照組均無中毒和個體死亡現(xiàn)象，且活力正常。在0.01 mg/L濃度脅迫下，整個過程中大多數(shù)個體都較活潑，個別個體出現(xiàn)了輕微中毒癥狀；在0.04 mg/L濃度組暴露初期，與對照組相比幼蟹無異常行為，暴露72 h后出現(xiàn)游動變緩、反應(yīng)遲鈍等中毒癥狀；在0.16和0.63 mg/L苯噻酰草胺濃度組的幼蟹暴露48 h后逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、抱團(tuán)、附肢脫落和個體死亡的中毒現(xiàn)象。高濃度苯噻酰草胺脅迫對幼蟹具有明顯的毒性作用，在10.00 mg/L濃度脅迫下，幼蟹在短時間內(nèi)出現(xiàn)躁動不安、游動遲緩、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，然后逐漸出現(xiàn)抱團(tuán)、部分附肢脫落、腹部上翻及軀體僵直的中毒癥狀，暴露72 h后90%以上的個體死亡。

幼蟹的死亡數(shù)與苯噻酰草胺溶液間具有明顯的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著苯噻酰草胺濃度的升高和脅迫時間的延長，中華絨螯蟹的存活率明顯下降，死亡率增加。脅迫24 h 時，≤2.51 mg/L濃度組中幼蟹死亡率低于20%，而10.00 mg/L濃度組中幼蟹死亡率達(dá)41 %，與其他組別的死亡率存在顯著性差異(P<0.05)。脅迫48 h時，≤2.51 mg/L濃度組幼蟹死亡率低于25%，而10.00 mg/L濃度組幼蟹死亡率達(dá)62%，與其他組別的死亡率存在顯著性差異(P<0.05)；脅迫96 h 后，≤0.63 mg/L濃度組幼蟹死亡率≤50%，2.51 mg/L濃度組死亡率達(dá)95%，10.00 mg/L濃度組中，幼蟹全部死亡(表1)。在脅迫72 h和96 h條件下，2.51 和10.00 mg/L濃度組與其他組別的死亡率存在顯著性差異(P<0.05)。數(shù)據(jù)分析獲得苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹脅迫24、48、72、96 h的LC50分別為5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L(表1)，安全濃度為0.018 mg/L。

表1 苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹的急性毒性Tab.1 Acute toxicity of mefenacet on the juveniles Chinese mitten crab

2.2 苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹鰓組織中SOD、CAT活力及MDA含量的影響

鰓組織中的SOD活力隨著脅迫時間延長呈先升高后降低的趨勢(圖1)，各濃度組均在第4 d達(dá)到峰值，且隨暴露濃度升高而增加。脅迫第4 d的SOD活力與對照組相比均有升高，0.04和0.16 mg/L濃度組SOD活力顯著高于其他濃度組(P<0.05)。在脅迫第10 d，0.01和0.04 mg/L濃度組SOD活力與對照組相比無顯著性差異，0.16 mg/L濃度組顯著增加。在脅迫第14 d，各濃度組SOD活力略高于對照組但無顯著性差異。鰓中CAT活力與SOD活力呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(P<0.05)，隨暴露時間的延長呈先上升后下降趨勢。各濃度組的CAT活力均在第4 d達(dá)到峰值，并隨暴露濃度升高而增加。在脅迫第4 d，各濃度組間CAT活力無顯著差異。在脅迫第10 d，0.01和0.04 mg/L濃度組與對照組相比無顯著性差異，0.16 mg/L 濃度組中CAT活力顯著低于對照組和其他濃度組(P<0.05)。脅迫第14 d，0.04和0.16 mg/L濃度組顯著低于對照組和其他濃度組(P<0.05)。不同濃度苯噻酰草胺對幼蟹鰓組織抗氧化效應(yīng)的影響存在一定的差異。0.01、0.04 mg/L濃度組，鰓中的MDA含量隨暴露時間的延長整體呈先上升后下降的趨勢，但峰值出現(xiàn)的時間不同。各濃度組MDA含量波動較大，在脅迫14天后，各濃度組間無顯著性差異。

圖1 中華絨螯蟹幼蟹鰓中SOD、CAT活力及MDA含量的影響同一處理時間下，不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同F(xiàn)ig.1 The mefenacet effects on SOD activity,CAT activity and MDA concentration in gill of juveniles Chinese mitten crabUnder the same processing time,different letters mean with significant difference (P<0.05),the same below.

2.3 苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺組織中SOD、CAT活力及MDA含量的影響

幼蟹肝胰腺組織中SOD、CAT活力及MDA含量隨苯噻酰草胺濃度變化的趨勢與鰓組織中的有所不同。肝胰腺組織中SOD活力隨脅迫時間延長呈上升-下降的波動變化趨勢，各濃度組均在脅迫第10 d達(dá)最高值，這與鰓組織中的結(jié)果明顯不同。脅迫10 d后，不同苯噻酰草胺濃度下SOD活力均高于2個對照組，且具有顯著性差異(P<0.05)。肝胰腺中CAT活力對苯噻酰草胺濃度變化反應(yīng)敏感(圖2)，隨著脅迫時間延長呈逐漸上升趨勢。不同苯噻酰草胺濃度處理組肝胰腺中的CAT活力與對照組相比均有升高，0.04和0.16 mg/L脅迫濃度下差異顯著(P<0.05)。隨著苯噻酰草胺濃度從0 升至0.16 mg/L，CAT活力表現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在苯噻酰草胺濃度為0.16 mg/L時達(dá)最高值。肝胰腺組織中的MDA含量隨著脅迫時間延長基本上呈升高趨勢，且隨著暴露濃度升高而增加。在0.04和0.16 mg/L脅迫濃度下，脅迫14 d內(nèi)肝胰腺組織中MDA含量與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺中SOD、CAT活力及MDA含量的影響Fig.2 The mefenacet effects on SOD activity,CAT activity and MDA concentration in hepatopancreas of juveniles Chinese mitten crab

3 討論

3.1 苯噻酰草胺對中華絨螯蟹的急性毒性

苯噻酰草胺對水生生物具有較為顯著的毒性[23-24]，對不同水生動物產(chǎn)生的急性致死效應(yīng)不同。苯噻酰草胺對日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)、蘇拉威西秀體溞(Diaphanosomacelebensis)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)的24 h LC50分別為30.39、23.01和50.00 mg/L[23]，對熱帶蝌蚪的24、48、72和96 h LC50值分別為3.06、2.95、2.79和2.70 mg/L[24]，對鯉(Cyprinuscarpio)的96 h LC50為6.0 mg/L[25]。本研究中苯噻酰草胺對幼蟹的24、48、72和96 h LC50值分別為5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L，可見甲殼類等無脊椎動物比魚類對苯噻酰草胺更敏感。參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對魚類的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[21]，苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹的毒性等級為高毒(0.1 mg/L

苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹毒性的濃度-效應(yīng)明顯，隨著暴露時間的延長LC50越小，且在急性毒性實驗后仍繼續(xù)死亡，這可能是由于農(nóng)藥在幼蟹體內(nèi)富集或轉(zhuǎn)化為毒性更強的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致。因此，低濃度苯噻酰草胺不會造成中華絨螯蟹幼蟹大規(guī)模迅速死亡，但長期低劑量暴露可造成不可逆損傷，甚至死亡。

3.2 苯噻酰草胺脅迫對中華絨螯蟹幼蟹相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

本研究中，苯噻酰草胺脅迫下，中華絨螯蟹幼蟹鰓組織中的SOD活力、CAT活力隨著暴露時間和濃度的增加，均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，且達(dá)到峰值的時間具有同步性；肝胰腺組織中的SOD、CAT活力變化趨勢與鰓相似，也表現(xiàn)為隨著暴露時間延長先增加后降低。然而，中華絨螯蟹幼蟹鰓中SOD、CAT活力誘導(dǎo)作用明顯早于肝胰腺，這可能是因為鰓組織能夠直接吸收水環(huán)境中的污染物，對苯噻酰草胺暴露更敏感，這一研究結(jié)果與苯并[a]芘對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的毒性研究結(jié)果相似[32]。本研究結(jié)果表明，低濃度苯噻酰草胺的脅迫能夠在短期內(nèi)促進(jìn)中華絨螯蟹幼蟹的防御能力，這是由于當(dāng)外源污染物進(jìn)入到受試生物體內(nèi)，導(dǎo)致自由基大量形成，促使體內(nèi)SOD、CAT活力增加進(jìn)而加快自由基的清除[33]；而高濃度苯噻酰草胺或長時間脅迫下，自由基形成過量且超出生物體可清除的范圍時，SOD、CAT活力受到抑制[34]，這可能是SOD和CAT活力先升后降的原因。

MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物之一，也是反映細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明，苯噻酰草胺脅迫下，MDA在肝臟中的誘導(dǎo)水平顯著高于鰓組織，說明幼蟹肝胰腺組織受到的脂質(zhì)過氧化作用遠(yuǎn)高于鰓組織。蔣閏蘭等[35]研究也發(fā)現(xiàn)，不同菲濃度處理中華絨螯蟹機(jī)體受氧化損傷程度存在組織差異，其中肝胰腺受損傷的程度較鰓組織嚴(yán)重。分析機(jī)體受氧化損傷程度出現(xiàn)組織差異的原因與組織在機(jī)體內(nèi)的功能不同有關(guān)，鰓組織主要功能是進(jìn)行氣體交換，而肝胰腺是有毒物質(zhì)的主要代謝場所。作為有機(jī)污染物，苯噻酰草胺具有親脂性，肝胰腺中脂肪含量較高有利于苯噻酰草胺蓄積。在不同苯噻酰草胺濃度脅迫下，MDA含量存在顯著性差異，表明生物體受氧化損傷程度與苯噻酰草胺濃度密切相關(guān)，在菲對中華絨螯蟹毒性效應(yīng)的研究也證實了這一結(jié)論[35]。肝胰腺中MDA含量變化規(guī)律與鰓中不同，其與苯噻酰草胺濃度間關(guān)系更為密切，且與鰓相比，肝胰腺中MDA含量對苯噻酰草胺濃度變化有更高的敏感性。本實驗中，肝胰腺中MDA含量與較高濃度苯噻酰草胺間有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

4 結(jié)論

苯噻酰草胺對中華絨螯蟹幼蟹毒性等級為高毒，24、48、72、96 h LC50分別為5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L，安全濃度為0.018 mg/L。低濃度苯噻酰草胺不會造成受試生物大規(guī)模迅速死亡，但長期低劑量暴露可造成不可逆損傷。在較高濃度苯噻酰草胺脅迫下，中華絨螯蟹幼蟹引起肝胰腺和鰓組織的脂質(zhì)過氧化損傷；在0.018 mg/L濃度苯噻酰草胺脅下，能夠通過誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化酶CAT和SOD活力升高來降低苯噻酰草胺脅迫危害。