李開(kāi)勇，胡麗可，尹雅潔，夏 險(xiǎn)，梁運(yùn)祥，胡遠(yuǎn)亮，

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002；2.廣東萬(wàn)之源生物科技有限公司，廣東 湛江 524148；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

0 引言

辣椒是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，連續(xù)多年穩(wěn)居國(guó)內(nèi)蔬菜產(chǎn)量第一。為確保供應(yīng)，辣椒主要通過(guò)設(shè)施大棚生產(chǎn)，然而常年連作，施加大量的化肥和農(nóng)藥，導(dǎo)致土壤板結(jié)，微生物種類(lèi)失調(diào)，土傳病害加重，限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。生物防治主要通過(guò)施用菌肥或菌劑，改變根際土壤微生物群落的組成及酸堿度，提高土壤有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)植物對(duì)水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，減少病害，促進(jìn)作物生長(zhǎng)[2，3]。它具有成本低、效果佳、二次污染小等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，已逐漸成為作物病害防治的主要方法之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。

鏈霉菌是生防微生物的主要來(lái)源[4]。鏈霉菌含有大量編碼功能酶系的基因，產(chǎn)生具有固氮、解磷、解鉀等作用的多種酶類(lèi)，提高作物對(duì)養(yǎng)分的吸收能力,促進(jìn)腐殖質(zhì)的形成[5]。鏈霉菌還能提高活性氧清除酶蛋白活性，促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)代謝和黃酮類(lèi)物質(zhì)生成，提高柑橘果實(shí)抗氧化、抗衰老能力[6]，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)預(yù)防植物病害并促進(jìn)生長(zhǎng)[7]。StreptomycesalfalfaeXY25T是一種從紫花苜蓿根際土壤中分離的生防菌株[8]，研究表明該菌株改變了根際土壤微生物結(jié)構(gòu)，減少大白菜根腫病的發(fā)生[9]，提高根際土壤蔗糖酶、脲酶和過(guò)氧化氫酶等活性，緩解土壤酸化，促進(jìn)土壤養(yǎng)分釋放，對(duì)辣椒有增產(chǎn)作用[1]。

植物生長(zhǎng)中遭遇干旱、凍害、澇害、鹽漬化等逆境的情況時(shí)有發(fā)生[10]。干旱條件下，植物代謝受損，導(dǎo)致發(fā)育不良、生長(zhǎng)停滯甚至死亡[11]。此外，根系是植物吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)育起關(guān)鍵作用。然而，S.alfalfaeXY25T對(duì)作物的抗旱性能及根系生長(zhǎng)的影響仍然未知。以辣椒和紫云英為研究對(duì)象，通過(guò)干旱脅迫和種子催芽實(shí)驗(yàn)，研究S.alfalfaeXY25T對(duì)植物抗逆性和根系生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果為生防菌株的科學(xué)使用及促進(jìn)作物生長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與植物

菌株StreptomycesalfalfaeXY25T(CCTCC AA2015019T)，采用高氏Ι號(hào)培養(yǎng)基28℃、培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌水稀釋定容，平板法計(jì)數(shù)。辣椒種子和紫云英種子由山東瑞克斯旺種子公司提供。

1.2 辣椒幼苗根系抗逆性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用珍珠巖∶泥炭土=1∶3作為育苗基質(zhì)，將基質(zhì)混合均勻，121℃、20 min滅菌處理。對(duì)照組用3個(gè)苗盤(pán)，即3個(gè)重復(fù)，每個(gè)苗盤(pán)所用的基質(zhì)接種S.alfalfaeXY25T菌液(7.6 × 106CFU·mL-1，10mL)，充分混合均勻，每穴播1顆經(jīng)預(yù)處理的辣椒種子，共播種10顆。對(duì)照組用無(wú)菌水代替菌液，其他處理方式同處理組。置于光照培養(yǎng)箱，28℃培養(yǎng)，待辣椒幼苗徑長(zhǎng)7 cm左右，進(jìn)行持續(xù)7 d不澆水的干旱處理。脅迫結(jié)束，將所有幼苗取出，測(cè)定抗逆性指標(biāo)，每個(gè)重復(fù)測(cè)3次求平均值。

1.3 抗逆性指標(biāo)測(cè)定

葉片相對(duì)含水量(RWC)。用剪刀收集(避開(kāi)葉脈部分)干旱脅迫后不同處理的辣椒葉片，同組的葉片切碎、混勻，稱(chēng)取1 g(鮮重Wf)，超純水浸泡15 min，稱(chēng)重(飽和鮮重Wt)。然后進(jìn)行殺青處理(110℃、4 h)，置于85℃烘干至恒重(Wd)。RWC(%)=(Wf-Wd)/ (Wt-Wd) *100%.

電導(dǎo)率。選取待測(cè)葉片，用打孔器(Φ=5 mm)避開(kāi)葉脈部分取小圓片，放置于50 mL的去離子水中，振蕩28℃、2.5 h，采用STARTER 3100C電導(dǎo)儀測(cè)定處理電導(dǎo)率(E1)。然后沸水浴 15 min，冷卻，測(cè)定煮沸電導(dǎo)率(E2)及所用去離子水電導(dǎo)率(E0)。計(jì)算公式如下：相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(E1-E0)/(E2-E0)*100%.

丙二醛(MDA)和根系活力，參照文獻(xiàn)方法[12]。

1.4 種子催芽實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將12個(gè)墊有濾紙的培養(yǎng)盒，分成4組，每組3個(gè)。其中2組為處理組，每盒分別加入S.alfalfaeXY25T菌懸液10 mL，其1組盒播10 顆辣椒種子，另1組播10 顆紫云英種子，3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組 2組6盒，用10 mL無(wú)菌水代替菌液，其他條件同處理組。將種子置于光照培養(yǎng)箱中，黑暗條件下，28 ℃催芽處理5 d，取出紫云英幼苗。此后進(jìn)行光照處理，按時(shí)添加營(yíng)養(yǎng)液，第10 d取出辣椒幼苗，采用Epson Expression 10000XL掃描儀采集數(shù)據(jù)。每個(gè)重復(fù)采集所有植株數(shù)據(jù)，求平均值。辣椒根須多而細(xì)，不易觀察。因此，選擇紫云英根系由武漢拜意爾生物科技有限公司制成石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察根系細(xì)胞變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所有測(cè)定數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行處理和繪圖，采用鄧肯氏新復(fù)極差法在SPSS 21.0中進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)辣椒幼苗抗逆性的影響

干旱脅迫下，植物細(xì)胞因缺水而導(dǎo)致體內(nèi)各種生理反應(yīng)變緩，植物生長(zhǎng)停滯甚至死亡。葉片相對(duì)含水量是研究植物抗逆性的重要指標(biāo)，它能反映植物體的生理狀態(tài)，含水量越高，植物抵御逆境、維持正常生理活動(dòng)的時(shí)間越長(zhǎng)。如圖1A所示，施用S.alfalfaeXY25T辣椒幼苗的葉片相對(duì)含水量較高，說(shuō)明S.alfalfaeXY25T能在干旱條件下緩解植物細(xì)胞脫水速度，提高植物的抗旱能力。相對(duì)電導(dǎo)率主要衡量植物細(xì)胞膜通透性狀況，逆境條件下，植物細(xì)胞膜功能喪失，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外流，從而增大相對(duì)電導(dǎo)率。圖1B所示，施用S.alfalfaeXY25T辣椒葉片的相對(duì)電導(dǎo)率降低67.31%.說(shuō)明干旱造成了細(xì)胞膜的損傷，而該菌劑能緩解干旱逆境對(duì)辣椒細(xì)胞膜的損害。丙二醛(MDA)為細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)植物抗逆性的重要指標(biāo)。丙二醛含量的高低代表細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，其含量越高，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)越強(qiáng)，植物抗逆性就越差[13]。從圖1C中可以看出，干旱脅迫下，施用S.alfalfaeXY25T顯著降低辣椒葉片丙二醛的含量，降幅為34.51%，說(shuō)明該菌在一定程度上，降低了辣椒葉片膜脂過(guò)氧化程度，增強(qiáng)了植物的抗旱性。根系活力是評(píng)價(jià)根系功能的綜合指標(biāo)，也是指示植物抗性變化的重要依據(jù)。根系活力高，植物生長(zhǎng)良好，抗逆性強(qiáng)。如圖1D所示，干旱逆境下，施用S.alfalfaeXY25T辣椒幼苗的根系活力顯著提高48.23%.總之，施用S.alfalfaeXY25T能在一定程度上緩解干旱逆境對(duì)植物的傷害，提高植物的抵御能力，如減輕逆境脅迫對(duì)植物質(zhì)膜的損害和增強(qiáng)植物根系活力(圖1)。

圖1 對(duì)辣椒幼苗葉片相對(duì)含水量，電導(dǎo)率，丙二醛和根系活力的影響

2.2 對(duì)辣椒根系生長(zhǎng)的影響

掃描辣椒根系表明，施用S.alfalfaeXY25T辣椒根系形態(tài)較粗壯，發(fā)育更好(圖2)。通過(guò)測(cè)量辣椒根系生長(zhǎng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，處理組植株的總根長(zhǎng)、平均直徑、總體積和單位土壤體積的根長(zhǎng)，分別顯著提高8.96%，15.22%，46.85%和26.77%(圖3)。說(shuō)明S.alfalfaeXY25T顯著促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)。

圖2 施用S. alfalfae XY25T對(duì)辣椒幼苗根系的影響 圖3 施用S. alfalfae XY25T對(duì)辣椒幼苗根系生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.3 對(duì)紫云英根系的影響

經(jīng)鏈霉菌催芽的紫云英根系更粗壯，平均直徑增大44.76%(圖4)。石蠟切片結(jié)果表明，處理組紫云英根系細(xì)胞增大，尤其是縱切觀察，現(xiàn)象更明顯，處理組根尖細(xì)胞形態(tài)完整(圖5)。說(shuō)明S.alfalfaeXY25T能保護(hù)根尖細(xì)胞不受傷害，從而增強(qiáng)根系發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)吸收的功能。

圖4 施用S. alfalfae XY25T對(duì)紫云英根直徑的影響 圖5 施用S. alfalfae XY25T對(duì)紫云英根尖細(xì)胞的影響

3 討論與結(jié)論

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，經(jīng)常面臨各種逆境的不利影響，提高作物對(duì)逆境的適應(yīng)能力具有重要意義。相對(duì)電導(dǎo)率主要衡量細(xì)胞膜的通透性變化，逆境脅迫破壞植物細(xì)胞膜，從而增大相對(duì)電導(dǎo)率[14]。MDA指示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度，逆境下MDA積累會(huì)加劇植物損傷[15]。本研究中，施用S.alfalfaeXY25T辣椒葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA的含量顯著降低，說(shuō)明該菌株可以減少逆境對(duì)植物細(xì)胞造成的損傷。此外，充足的水分是植物生理活動(dòng)的必要條件，根系活力反映植物代謝能力的強(qiáng)弱，兩者與植株生命強(qiáng)度息息相關(guān)[16]。本研究表明，S.alfalfaeXY25T顯著提高葉片相對(duì)含水量和根系活力，說(shuō)明該菌株可以幫助維持植株生命活動(dòng)，提高辣椒的抗旱性能。

農(nóng)業(yè)上利用生防微生物防治作物病害，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，取得了一定的成效。研究表明，鏈霉菌提高土壤中速效鉀、速效磷等養(yǎng)分的含量[5,17]，顯著促進(jìn)茄子和圣女果幼苗生長(zhǎng)[18]，并提高柑橘[6]、大白菜[9]的抗病性能。本研究通過(guò)辣椒和紫云英種子催芽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施用S.alfalfaeXY25T辣椒幼苗的總根長(zhǎng)、平均直徑、總體積和單位土壤體積的根長(zhǎng)顯著提高，紫云英根系細(xì)胞生長(zhǎng)加快，說(shuō)明該菌株促進(jìn)作物根系生長(zhǎng)。根系是植物作用于土壤的重要器官，根系健壯，物質(zhì)合成、養(yǎng)分吸收以及運(yùn)輸能力越強(qiáng)，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)和發(fā)育。在植物生長(zhǎng)早期，根系的長(zhǎng)度和根系活力成正相關(guān)[19]，這與干旱條件下，根系活力提高的結(jié)果相互印證。但植物根系對(duì)干旱非常敏感，在干旱條件下其數(shù)量、長(zhǎng)度和直徑等形態(tài)會(huì)發(fā)生很大變化[20]。根系生長(zhǎng)加快可能是S.alfalfaeXY25T促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和作物生長(zhǎng)的主要原因。該菌株可能產(chǎn)生細(xì)胞分裂素等活性物質(zhì)，打破種子的休眠期，刺激根系細(xì)胞的橫向伸長(zhǎng)，從而提高植物營(yíng)養(yǎng)吸收、物質(zhì)合成以及抵御外界逆境的能力[21]。

綜上所述，干旱條件下，施用S.alfalfaeXY25T緩解葉片水分損失，提高根系活力，通過(guò)降低葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量減少對(duì)細(xì)胞的傷害，從而提高辣椒幼苗對(duì)逆境的適應(yīng)能力。此外，施用S.alfalfaeXY25T促進(jìn)辣椒和紫云英幼苗根系生長(zhǎng)。本研究為該菌株促進(jìn)作物生長(zhǎng)和在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)，后續(xù)將進(jìn)一步從代謝產(chǎn)物分離、鑒定和分子水平上，深入研究該菌株提高作物抗逆性和促生長(zhǎng)機(jī)理，以便在農(nóng)業(yè)上取得更好的應(yīng)用效果。