彭東升，王應仙，王 瑞，張恒琦，孫文兵

(1.污染物分析與資源化技術湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學 化學化工學院，湖北 黃石 435002)

0 引言

牛奶和奶類商品是全球消費量最高的食品之一。在很長的歷史中，乳制品行業(yè)廣泛使用過氧化氫(H2O2)和防腐劑來防止變質或延長乳制品的使用壽命[1]。但是過量的H2O2可以給牛奶的營養(yǎng)價值帶來有害影響。例如，它可以誘發(fā)葉酸的降解，而葉酸是人體必需的維生素[2]。此外高水平攝入H2O2會引起嚴重的胃腸道問題，所以尋找牛奶中過氧化氫的檢測方法是很有必要的。

熒光碳點(CDs)是尺寸小于10 nm的碳納米顆粒，因其高熒光量子產(chǎn)率，出色的水分散性而受到越來越多的關注。碳點可以由多種無機、有機或生物材料或食物及其殘渣合成，這些原料都是十分價廉易得的。近年來，一些碳基熒光探針被用于生物和化學領域傳感，并取得了很大的進展。

本文以檸檬酸，硼酸和尿素為原料，使用一步水熱法合成了氮、硼摻雜碳點N,B-CDs，然后在該碳點溶液中加入AgNPs構建了一種檢測H2O2的新型熒光探針體系。由于內濾效應，AgNPs對碳點的熒光有猝滅作用；但加入H2O2之后，碳點的熒光得以恢復。本探針體系不僅易于制備，而且對牛奶中H2O2的檢測具有較高的選擇性、靈敏性和可靠性，是一種有良好應用前景的傳感平臺。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

過氧化氫、硝酸銀、硼氫化鈉、檸檬酸、硼酸、尿素、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉；七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硝酸鉛、氯化鉀、氯化鈉、七水硫酸鋅、六水氯化鐵和檸檬酸鈉(均為分析純，購自國藥試劑有限公司)；透析袋(MWCO=1000)；超純水(自制)。純牛奶購于當?shù)爻小?/p>

1.2 儀器

熒光光譜儀(F-4700型，日本Hitachi公司)；紫外可見分光光度計(UH4150型，日本Hitachi公司)；紅外光譜儀(Nicolet 5700型，美國熱電尼高力公司)；場發(fā)射透射電鏡(FEI Tecnai G2 F20型，美國FEI公司)。

1.3 N,B-CDs和AgNPs的合成方法

CDs的合成參考文獻[3]，并稍作修改：1.00g檸檬酸，0.70g尿素和0.50g硼酸混合并用50ml的超純水溶解定容后加入反應釜中，然后在馬弗爐中180℃下加熱6h.待溶液降低至室溫后用離心機10 000r/min離心15min，隨后將清液用0.22μm微孔濾膜除去雜質，最后轉移到透析袋中透析36h得到純化碳點溶液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

AgNPs的合成參考文獻[4]，并稍作修改：將6ml 10mM硼氫化鈉滴加到100ml 0.5mM的硝酸銀和0.5mM檸檬酸鈉中，然后在室溫下攪拌30min，得到深黃色AgNPs溶液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 反應時間的優(yōu)化

在狹縫寬度都為10nm，電壓為450V，激發(fā)波長為340nm，檢測范圍為370～600nm.固定N,B-CDs和AgNPs的濃度為0.5mg·L-1和200μmol·L-1，添加25 μmol·L-1H2O2，37℃下每隔2min記錄熒光光譜。

1.5 pH對反應體系的影響

N,B-CDs和AgNPs的濃度為0.5mg·L-1和200μmol·L-1，添加25μmol·L-1H2O2用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.2mmol·L-1，pH 7.0)定容至5ml，37℃下避光反應30min.測定熒光光譜，掃描范圍為370～600nm.

1.6 H2O2的檢測

將100μL N,B-CDs(5mg·L-1)，1 000 μL AgNPs(1mmol·L-1)和100μL 上述PBS緩沖液與不同濃度的100μL H2O2混合定容至5ml.在室溫下孵育30分鐘，然后340nm的激發(fā)波長和430nm的發(fā)射波長下進行熒光測量。

1.7 探針體系檢測的選擇性

為評價該方法對于H2O2檢測的選擇性，選擇了H2O2和10種金屬離子(濃度均為50μmol·L-1)，通過F/F0的數(shù)值來比較。按照1.6節(jié)所述方法進行。

1.8 牛奶樣品中H2O2的檢測

牛奶前處理步驟參考文獻[5]，并稍加修改。將20mL 1mol·L-1H2SO4與80mL牛奶混合，離心(20min，8 000r/min)，收集上清液用1mol·L-1NaOH調整pH到7.0，得到牛奶標準溶液。在稀釋的牛奶樣品中摻入不同濃度的H2O2，然后進行熒光測量。

2 結果與討論

2.1 N,B-CDs的表征

FT-IR可用于表征碳點表面的官能團結構。如圖1a所示：在3 430 cm-1和3 202cm-1處是O-H/N-H伸縮振動吸收峰；1 670 cm-1,1 400cm-1和1 583 cm-1處的三個峰分別歸屬于C=O，B-O和C=C伸縮振動。1 166cm-1，1 085cm-1處的吸收峰分別歸屬于B-OH,C-O-C的彎曲振動。紅外光譜證實了前體通過水熱碳化反應形成了含N和B摻雜的碳點。圖1b為碳點的高分辨TEM圖?？梢娞键c呈球形，直徑范圍為2.0～4.5nm，均值為2.3nm(圖1b)，分布較窄；在水溶液中分散良好。

圖1c為碳點水溶液的紫外-可見光吸收光譜。230nm和330nm處存在特征吸收峰，前者是由碳點的共軛C=C鍵中C原子sp2雜化軌道上電子的π-π*躍遷引起的，后者來源于C-O和C=O的n-π*的躍遷[6]。圖1d為碳點的熒光發(fā)射光譜圖?？砂l(fā)現(xiàn)激發(fā)波長從310nm增加到400nm，碳點的發(fā)射波長并沒有隨著激發(fā)波長的增加而發(fā)生明顯的位移，這可能是碳點粒徑均一所致；在340nm處激發(fā)下，在415nm處獲得最大發(fā)射強度。

2.2 熒光檢測機制

在AgNPs存在下，碳點的熒光被猝滅。為了進一步闡明熒光猝滅機制，對碳點的熒光和AgNPs的紫外吸收光譜進行了測量。如圖2a所示，AgNPs在325～475 nm之間顯示出較寬的吸收峰，最大吸收波長為400nm.碳點激發(fā)和發(fā)射光譜分別在300～400nm和400～525nm范圍內。當激發(fā)波長340nm時，在最大發(fā)射波長為420nm.還觀察到AgNPs的吸收峰與CDs的激發(fā)和發(fā)射峰之間有明顯的重疊，這表明AgNPs加入所導致的熒光猝滅可能是由于內濾效應(IFE)或熒光共振能量(FRET)轉移引起的。但IFE不能縮短碳點的熒光壽命，且輻射能量轉移不受距離的限制；FRET中的輻射能量轉移是由振動碰撞引起的，因此有10nm的距離限制。為探究熒光猝滅機制，進一步測量了碳點的熒光壽命(圖2b)。AgNPs加入前后碳點的平均熒光壽命分別為10.85ns和10.84ns，即AgNPs的加入對碳點熒光壽命幾乎沒有影響，這證實了碳點的熒光猝滅是由AgNPs的IFE所致。進一步檢測紫外吸收，結果如圖2c所示。從中可以看出存在和不存在碳點時AgNPs的吸收峰保持不變，這意味著沒有新物質形成，從而進一步證實碳點的熒光猝滅是由于AgNPs的IFE而非FRET.從圖2c中也可以看出在H2O2加入以后AgNPs的紫外吸收特征峰明顯下降，這說明H2O2成功刻蝕了AgNPs.

隨著AgNPs的IFE減弱，體系的熒光強度得以部分恢復。不同濃度的AgNPs刻蝕程度不同，體系熒光強度的恢復也不一樣(圖3a)。實驗中還發(fā)現(xiàn)在一定范圍內，AgNPs濃度與體系熒光強度存在線性關系(圖3a)。在刻蝕AgNPs較充分的前提下，建立起刻蝕劑H2O2濃度與體系熒光強度的定量關系，也就能實現(xiàn)對H2O2的定量檢測。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

2.3.1 AgNPs濃度的選擇 由圖3a可知，AgNPs濃度越大，碳點的熒光猝滅程度越大，但在AgNPs濃度達到200μM后，繼續(xù)增大其濃度，發(fā)現(xiàn)碳點的熒光猝滅程度變化不明顯了，因此AgNPs適宜濃度確定為200μM.

2.3.2 檢測時間的影響 有研究表明，反應時間是影響過氧化氫刻蝕金屬納米顆粒的重要因素[7]。如圖3b所示，加入H2O2后，隨著反應時間的延長，熒光強度逐漸恢復，并且在30min后熒光強度趨于穩(wěn)定。因此選擇30min作為最佳檢測時間。

2.3.3 pH的影響 pH對體系熒光強度的影響也進行了研究。從圖3c可以看到，在pH=7.0時，碳點熒光恢復達到最大值。在pH大于7或小于7條件下，碳點熒光強度都無法恢復到最大值，這是可能因為pH較大或者較小會導致銀納米粒子表面電荷變化，從而降低了H2O2的刻蝕效果[8]，故反應體系的最佳pH值定為7.0.

2.3.4 過氧化氫的檢測 在優(yōu)化條件下定量檢測H2O2.碳點的熒光強度隨H2O2濃度的增加而逐漸增加(圖4a)。用實驗獲得的熒光強度比值與對應的H2O2濃度數(shù)據(jù)繪圖4b，并進行線性擬合，發(fā)現(xiàn)在0～60μM的濃度范圍內，F(xiàn)/F0與H2O2濃度有良好的線性關系(R2=0.994)。根據(jù)標準偏差規(guī)則的三倍估算得出(3δ/S)檢測限為0.35μM.

2.4 選擇性

為評價N,B-CDs/AgNPs探針體系檢測H2O2時的選擇性，在碳點溶液中分別加入H2O2和 10種不同物質(濃度均為50μmol·L-1)，測熒光強度并通過熒光強度比值F/F0來比較判斷。如圖5所示，添加10種物質后，溶液F/F0沒有明顯變化，這表明N,B-CDs/AgNPs探針體系對檢測H2O2具有較高選擇性。

圖5 加入不同物質后體系的熒光強度比值F/F0

2.5 實際樣品的檢測

使用該方法對某市售牛奶樣品進行檢測，未發(fā)現(xiàn)H2O2.為了考證本文所構建的H2O2檢測方法的實用性，將不同濃度的H2O2摻入牛奶樣品中，用于模擬真實樣品，檢測結果列于表1.由該表可知本檢測方法對H2O2的回收率為95.5%～111.4%，相對標準偏差(RSD)≤0.5%，具有較高的準確度和精密度?？梢奛,B-CDs/AgNPs探針體系為檢測牛奶樣品中的過氧化氫提供了一種新方法。

表1 牛奶樣品中過氧化氫的加標回收(n=3)

2.6 不同檢測體系的比較

牛奶和奶類商品中H2O2的檢測一直備受人們的重視。作為比較，表2列出了幾種探針體系對H2O2的檢測結果。從表中發(fā)現(xiàn)對于H2O2的檢測，雖然N,B-CDs/AgNPs探針體系線性范圍較窄，但具有更低的檢測限，即更高的靈敏度。

表2 不同檢測方法的比較

3 結論

本文以檸檬酸、尿素和硼酸為原料，采用水熱法成功合成了N,B-CDs；以硼氫化鈉、硝酸銀和檸檬酸鈉為原料通過化學反應制備了AgNPs，將兩者混合得到了熒光探針體系N,B-CDs/AgNPs.用該熒光探針體系檢測牛奶樣品中的過氧化氫，建立了分析牛奶等蛋白質樣品中過氧化氫的新方法，該方法操作簡單，選擇性較好、靈敏度高。