李曉斌，曹 旭，糟小賓，李 碩，陳賀寧，朱 順，李小科＊＊，葉永安＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 北京100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京100700）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。HBV感染相關(guān)疾病，如肝硬化（Cirrhosis）、肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC），嚴重威脅人類的生命[1]。據(jù)估計，目前我國慢性HBV感染者約7000萬例，其中慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患 者 約2000萬-3000萬例[2]。當前尚缺乏根除HBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的方法，因此CHB的治療以達到“功能性治愈”為目標。抗病毒仍為目前治療CHB的有效手段，常用藥物包括核苷/核苷酸類似物（NAs）及聚乙二醇化干擾素（PEG-IFN），但因耐藥風(fēng)險及嚴重副反應(yīng)的存在限制其臨床療效[3]。中醫(yī)藥以其整體觀念、辨證論治的特點在CHB治療上顯示出獨特的優(yōu)勢，可發(fā)揮抑制病毒復(fù)制、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫等諸多療效。本團隊前期的研究觀察到中藥聯(lián)合恩替卡韋可提高HBeAg陽性CHB患者的HBeAg清除率[4]，并降低其NAs停藥后臨床復(fù)發(fā)的風(fēng)險[5]，充分證明中藥治療CHB的潛在療效，具有極大的研究空間。

中藥苦參（Radix Sophorae Flavescentis），味苦性寒，具有清熱燥濕，殺蟲，利尿之功效?？鄥⒌幕钚猿煞秩缈鄥⑺?、氧化苦參堿等可抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫，從多方面發(fā)揮治療CHB的作用[6]。目前關(guān)于苦參類制劑治療CHB已開展大量研究，基于臨床癥狀及體征、血清學(xué)指標[7]和免疫學(xué)指標[8]的觀察均提示苦參的活性成分可有效干預(yù)CHB的發(fā)生發(fā)展。然而，目前的研究多局限于通過某單一活性成分作用于某靶點或通路來論述其機制，未體現(xiàn)多成分、多靶點、多通路的特點，也未從整體角度闡釋苦參治療CHB的作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)由Hopkins提出[9]，具有整體性、系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)“整體觀”一致。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥研究相結(jié)合，科學(xué)地闡明“藥物-靶點-疾病”關(guān)系，有助于中藥的系統(tǒng)研發(fā)[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，采用分子對接技術(shù)，篩選苦參治療CHB的活性成分，預(yù)測其潛在分子機制，初步闡釋苦參治療CHB的有效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為系統(tǒng)研究開發(fā)苦參提供參考。

1 材料與方法

1.1 苦參活性成分與潛在靶點篩選

通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索苦參的活性成分，根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的2個藥物吸收、分布、代謝、排泄屬性值（ADME）進行活性成分初步篩選，獲得活性化合物及其作用靶點。將所得靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）進行規(guī)范。

1.2 慢性乙型肝炎的相關(guān)靶點篩選

以“chronic hepatitis B”為關(guān)鍵詞，檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）中與慢性乙型肝炎相關(guān)的靶點，合并后刪除重復(fù)值。

1.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

獲得苦參活性成分靶點及疾病相關(guān)靶點后，取兩者交集并進行藥物成分靶點-CHB疾病靶點映射得到苦參治療CHB的潛在作用靶點。用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“相關(guān)活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)并進行可視化。利用Cytoscape的內(nèi)置工具“network analyze”插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，獲得有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等。選取連接度≥中位數(shù)為關(guān)鍵活性成分，連接度≥2倍中位數(shù)為關(guān)鍵靶點。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將苦參治療CHB的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定種屬為“Homo sapiens”，蛋白互作評分≧0.04，獲取其相互作用關(guān)系，刪去無相互作用的靶點。R軟件可進行生物信息分析并對結(jié)果可視化。通過R 3.6.2，計算PPI網(wǎng)絡(luò)中各靶點的連接度，連接度越大，與其相互作用的靶點個數(shù)越多，選取連接度≥2倍中位數(shù)的靶點進行可視化。將其與1.3所得關(guān)鍵靶點取交集得到苦參治療CHB的核心靶點[11]。核心靶點具有同時與活性成分及其他靶點互作關(guān)系密切的特點。

1.5 基因富集分析

在R 3.6.2中，通過“org.Hs.eg.db”包獲取潛在作用靶點的entrezID，利用“ClusterProfile”包對其進行GO注釋分析及KEGG通路分析。設(shè)置p value Cutoff=0.05,q value Cut off=0.05，選取GO分析結(jié)果中富集程度最高的前10條及KEGG分析中富集程度最高的前20條通路進行可視化。

1.6 分子對接驗證

將關(guān)鍵活性成分導(dǎo)入Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得其2D結(jié)構(gòu)，將核心靶點導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org），選擇合適的蛋白結(jié)構(gòu)。用PyMol軟件對靶蛋白結(jié)構(gòu)去水，分離配體和受體。以靶蛋白作為受體，以藥物活性成分作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標確定分子對接的活性位點，根據(jù)靶蛋白活性口袋設(shè)置Gridbox坐標及大小，采用AutoDock vina進行分子對接，選取自由結(jié)合能最低的結(jié)合構(gòu)象，使用PyMol軟件進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 苦參治療慢性乙型肝炎的活性成分與靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索得到苦參活性成分（OB≥30%，DL≥0.18）45個，包括槲皮素、苦參堿、苦參素等，活性成分作用靶點共113個。合并Genecards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，共獲得人類CHB相關(guān)靶點基因8287個。將苦參的作用靶點和CHB相關(guān)靶點取交集后，得到苦參治療CHB的潛在作用靶點97個，具有治療CHB作用的相關(guān)活性成分23個，詳見表1。

表1 苦參治療CHB的相關(guān)活性成分

2.2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將苦參的相關(guān)活性成分及潛在作用靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，構(gòu)建苦參治療CHB的“相關(guān)活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape 3.7.2的內(nèi)置“network analyze”插件分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲屬性，得到活性成分及靶點基因的連接度、介度、緊密度。連接度越大，圖中節(jié)點的面積越大，則該節(jié)點發(fā)揮作用的可能性越大（圖1）。經(jīng)計算，活性成分的連接度中位數(shù)為5，故選取連接度≥5為關(guān)鍵活性成分，包括槲皮素（quercetin）、木 樨 草 素（uteolin）、芒 柄 花 黃 素（formononetin）等，關(guān)鍵活性成分的拓撲參數(shù)見表2。關(guān)鍵活性成分作用的靶點個數(shù)較多，可能為苦參治療CHB的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。靶點的連接度中位數(shù)為2，故選取連接度≥4（2倍中位數(shù)）為關(guān)鍵靶點，共18個，包括PTGS1、ESR1、PRSS1、PPARG、AR、NCOA2、NCOA1、GSK3B、IL6、ESR2、ICAM1、CHRM3、CHRM1、CHEK1、F7、GABRA1、RELA、CASP3。由圖1可知，苦參的一種活性成分可對應(yīng)一個或多個疾病靶標，多種活性成分可對應(yīng)相同的疾病靶標，提示苦參治療CHB具有多成分、多靶標的特點。

圖1 苦參治療CHB的“相關(guān)活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵活性成分拓撲參數(shù)

2.3 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

將苦參治療CHB的97個潛在作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)。通過R 3.6.2計算可得PPI網(wǎng)絡(luò)連接度中位數(shù)為16，選取連接度≥32（2倍中位數(shù)）的靶點進行可視化，共13個（圖2）。前面經(jīng)靶點映射，共獲得苦參治療CHB的關(guān)鍵靶點18個，將其與PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選所得13個靶點取交集，可得到6個核心靶點，分別為IL6、ESR1、PPARG、AR、RELA、CASP3。核心靶點具有與活性成分及其他靶點互作關(guān)系均密切的特點，在苦參針對CHB的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵作用。將6個核心治療靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得其相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)連接度≥2倍中位數(shù)的治療靶點柱狀圖

圖3 核心治療靶點蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 基因富集分析

使用R 3.6.2對97個潛在作用靶點進行GO注釋分析及KEGG通路分析。GO注釋分析包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細 胞 組 成（celluar component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3個部分。GO注釋分析結(jié)果顯示潛在作用靶點主要參與的生物學(xué)過程（p value≤0.05）1282條，前三條為response to steroid hormone、response to xenobiotic stimulus、response to radiation；參與細胞成分（p value≤0.05）59個，以membrane raft、membrane microdomain、membrane region為主；參與分子功能（p value≤0.05）104條，以DNA-binding transcription activator activity、ubiquitin（-like）protein ligase binding、ubiquitin protein ligase binding的作用較為突出。分別選取富集最顯著的前10條進行可視化（圖4（A）、（B）、（C））。KEGG通路分析可知，苦參治療CHB涉及的通路主要有PI3KAkt信號通路、乙型肝炎病毒信號通路，TNF信號通路，細胞凋亡信號通路等（p value≤0.05），涉及病毒感染、炎癥、免疫等方面，提示苦參可能通過調(diào)節(jié)免疫、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、干預(yù)細胞凋亡等途徑來治療CHB。選取富集程度高的前20條通路進行可視化（圖4（D））。

圖4 生物學(xué)過程（A）、細胞成分（B）、分子功能（C）及KEGG通路（D）富集結(jié)果

2.5 分子對接結(jié)果

將“相關(guān)活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中連接度最高的成分槲皮素與6個核心靶點進行對接，即受體為IL6（PDB ID：5FUC）、CASP3（PDB ID：3DEH）、PPARG（PDB ID：3SZ1）、RELA（PDB ID：3QXY）、AR（PDB ID：2HVC）、ESR1（PDB ID：2QA8），配體為槲皮素。結(jié)合自由能可評價受體和配體之間的結(jié)合能力，結(jié)合能小于0時，認為配體和受體可以自由結(jié)合，且結(jié)合自由能越低，二者結(jié)合能力越強。結(jié)果顯示AR、CASP3、RELA、IL6、PPARG可與槲皮素穩(wěn)定結(jié)合，提示槲皮素與上述靶點之間的相互作用可能為苦參治療CHB的重要機制之一，值得進一步實驗驗證。ESR1與槲皮素雖未顯示有結(jié)合力，但作為核心靶點，ESR1可能通過與其他活性成分穩(wěn)定結(jié)合發(fā)揮治療CHB的作用，有待于進一步研究。對接結(jié)果見表3、圖5（A）、（B）、（C）、（D）、（E）。

表3 槲皮素與核心靶點分子對接結(jié)合自由能（kcal/mol）

圖5 AR-quercetin結(jié)合圖（A）、CASP3-quercetin結(jié)合圖（B）、RELA-quercetin結(jié)合圖（C）、IL6-quercetin結(jié)合圖（D）及PPARG-quercetin結(jié)合圖（E）

3 討論

苦參出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，傳統(tǒng)中醫(yī)取其清熱燥濕、殺蟲、利尿之功，主要用于治療濕熱黃疸、瀉痢、皮膚瘙癢等病癥。隨著有關(guān)苦參活性物質(zhì)及其藥理作用的研究不斷推進，發(fā)現(xiàn)苦參的主要活性成分有生物堿、黃酮、三萜皂苷、木脂素、酚酸和少量苯丙素類成分[12]，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的作用。近年來，苦參治療CHB的研究不斷深入，提示苦參在CHB的臨床治療及藥物研發(fā)等方面有較大的應(yīng)用價值。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以中藥成分、疾病靶點為研究對象，系統(tǒng)探索了苦參治療CHB的活性成分、潛在靶點基因和分子機制，預(yù)測苦參治療CHB的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為苦參的后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

3.1 關(guān)鍵活性成分分析

本研究發(fā)現(xiàn)苦參具有治療CHB作用的活性成分共23個，其中關(guān)鍵活性成分有槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素、菜豆素、8-異戊烯基-山柰酚、苦參堿、苦參素等。既往大量研究表明上述活性成分具有良好抗CHB的功效，其中以槲皮素、木犀草素、苦參堿、苦參素的研究較深入。槲皮素為黃酮類化合物，實驗研究顯示槲皮素通過影響亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄以及調(diào)控熱休克蛋白來干擾病毒的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制，減少HBsAg、HBeAg的分泌，降低HBV DNA的水平[13]；降低促炎細胞因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生，抑制NF-κB的激活，進而減輕炎癥反應(yīng)造成的肝臟損傷[14,15]。木犀草素屬天然黃酮類化合物，體內(nèi)和體外實驗均證實木犀草素可有效抑制HepG2.2.15細胞中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）介導(dǎo)的肝細胞核因子4（HNF 4）的表達及其與HBV PrC/C啟動子的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制HBV的復(fù)制[16]。體外實驗發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制HepG 2.2.15細胞中HBV DNA的復(fù)制及HBsAg的分泌[17]。臨床研究證實，苦參堿可提高HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率及HBV DNA的陰轉(zhuǎn)率，改善肝功能，緩解臨床癥狀，且不良反應(yīng)少見[18]。研究發(fā)現(xiàn)苦參素具有抗炎、保肝降酶、抗病毒、抗肝纖維化、免疫調(diào)節(jié)等作用[19]。FENG等人通過研究苦參素聯(lián)合阿德福韋酯（ADV）治療CHB發(fā)現(xiàn)，與對照組（ADV）相比，觀察組（苦參素聯(lián)合ADV）血清HBV DNA載量明顯減少，透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原水平降低，CD4+T細胞、CD8+T細胞水平升高，IgM、IgG、IgA水平升高，血清內(nèi)毒素水平降低。由此可知，與單用ADV相比，聯(lián)合苦參素可有效減低患者血清中病毒載量，提高機體免疫力，改善肝功能，延緩肝纖維化的進展，改善預(yù)后[20]。此外，一項薈萃分析顯示，苦參素與NAs聯(lián)合使用可有效提高HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率、HBV DNA陰轉(zhuǎn)率及ALT復(fù)常率[21]。因此，槲皮素、木犀草素、苦參堿、苦參素或為治療CHB的重要活性成分，具有極大的研究空間，可能為抗CHB藥物的研發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 核心靶點及相關(guān)通路分析

本研究顯示，苦參有效活性成分參與治療CHB的核心靶點為IL-6、ESR1、AR、RELA、PPARG、CASP3，這6個核心靶點之間存在顯著的相互作用關(guān)系。IL-6屬TNF信號通路的重要因子，介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、炎癥誘導(dǎo)等。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6既可增強淋巴細胞功能，又作為炎癥介質(zhì)參與HBV誘導(dǎo)的肝損傷，對于HBV感染具有雙向調(diào)節(jié)作用[22]。IL-6通過抑制轉(zhuǎn)錄因子如HNF-1α、HNF-4α、STAT3與cccDNA的 結(jié)合，抑 制HBV DNA轉(zhuǎn) 錄[23]。ESR1和AR都 與 性 激 素 相 關(guān)。ESR1編碼雌激素受體α。雌激素受體α在肝臟的表達上調(diào)，與HNF-4α相互作用，可改變其與HBV增強子的結(jié)合，進而抑制HBV DNA的轉(zhuǎn)錄[24]。AR編碼雄激素受體，肝臟的雄激素受體通過直接與病毒核心啟動子附近的雄激素響應(yīng)元件結(jié)合來增強HBV RNA轉(zhuǎn)錄[25]，該活性受HBx的調(diào)節(jié)。RELA編碼RelA蛋白（p65），屬NF-κB/Rel蛋白家族的成員。NF-κB/RelA的激活可誘導(dǎo)多種活性靶基因反式激活，包括炎癥細胞因子，趨化因子和凋亡介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中起到重要的作用[26]。PPARG編碼過氧化物酶體增殖物激活受體γ，可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血PPARG啟動子甲基化增強，該甲基化強度與肝臟炎癥和纖維化呈正相關(guān)，提示PPARG與HBV的相互作用影響CHB的進展[27]。CASP3編碼半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在氧化應(yīng)激的條件下，HBx通過觸發(fā)CASP3介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，降低抗凋亡因子Mcl-1的水平，可能與HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[28]，由此推測，苦參或可延緩HCC的進展。由KEGG富集結(jié)果可知，上述核心靶點主要富集在PI3K-Akt及TNF信號通路，這兩條通路均與CHB的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在體外培養(yǎng)的原代肝細胞模型及HepG2細胞模型中均發(fā)現(xiàn)HBX通過激活PI3K-Akt信號通路抑制HBV DNA的復(fù)制及細胞凋亡[29-30]。TNF-α作為重要的細胞因子，可通過激活TNF信號通路，參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)在早期感染階段，TNFα可抑制HBV進入肝細胞及其在細胞內(nèi)的復(fù)制[31]；還可使HBV的核衣殼失穩(wěn)，降低cccDNA的水平[32]。上述研究結(jié)果表明，苦參的有效活性成分可能通過以上核心靶點來干預(yù)PI3K-Akt及TNF等信號通路，進而起到治療CHB的作用，進一步證實苦參抗CHB的潛在臨床價值，其機制有待于深入研究。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，采用分子對接技術(shù)，應(yīng)用多種生物信息學(xué)工具，對苦參多成分、多靶點、多途徑治療CHB的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進行研究。根據(jù)研究結(jié)果可推測，苦參可能主要通過干預(yù)病毒復(fù)制、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程，起到治療CHB的作用，為后續(xù)實驗研究進一步 驗證其作用機制提供了依據(jù)。