李 春，趙高峰，薛文華，滕軍放

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是指由于腦動(dòng)脈血管粥樣硬化及血栓形成引起急性腦組織血液供應(yīng)障礙，而相應(yīng)供血區(qū)腦組織缺血缺氧導(dǎo)致腦組織腫脹、壞死及功能障礙等[1-2]。ACI具有發(fā)病率高、致死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[3]。腦細(xì)胞缺血缺氧常伴隨神經(jīng)系統(tǒng)障礙、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等一系列的病理生理變化[4-5]。

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)是一種來(lái)源于深海魚油、螺旋藻和微藻類的Ω-3不飽和脂肪酸。研究[6-8]表明EPA具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、軟化血管、減輕炎癥、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等作用，在心臟、腎臟疾病,糖尿病,免疫系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要的輔助作用。最近研究[9-10]提示EPA還可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但EPA能否減小ACI患者的梗死體積、減輕神經(jīng)功能障礙、調(diào)節(jié)其氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)仍不清楚。本研究擬利用大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型探究EPA對(duì)ACI所致的神經(jīng)功能障礙及氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料EPA、水合氯醛購(gòu)自上海阿拉丁公司，TTC染液、多聚甲醛均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測(cè)試劑盒及鼠抗人GAPDH抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。64只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，購(gòu)自北京維通利華技術(shù)有限公司，均飼養(yǎng)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，大鼠的飼養(yǎng)、使用均符合標(biāo)準(zhǔn)。環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 MCAO模型建立根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，采用改良線栓法構(gòu)建可逆的大鼠左側(cè)MCAO模型(n=52)。大鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛(3.5 mg/kg)麻醉后仰臥位固定，去除頸部皮毛消毒后于正中縱向切口，鈍性分離暴露頸總、內(nèi)、外動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾暫時(shí)阻塞頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈以阻止血流。松開動(dòng)脈夾，從頸外動(dòng)脈殘端插入線栓，深度16～20 mm，遇阻力停止。采用多普勒血流儀檢測(cè)，大鼠顱內(nèi)血流值低至基線值30%以下，表示模型制備成功。假手術(shù)組(n=12)大鼠進(jìn)行相同的操作，但僅暴露血管，不栓塞。

1.3 動(dòng)物分組與給藥建模過(guò)程中4只造模失敗，將建模成功的48只大鼠隨機(jī)分為模型組及低、中、高劑量(150、300、600 mg/kg)EPA組，每組12只。EPA低、中、高劑量組每天給藥1次,連續(xù)給藥14 d。模型組和假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)評(píng)估對(duì)造模后第1、3、7、14天的各組大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高，代表神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，最高分為18分。

1.5 TCC染色測(cè)量大鼠腦梗死體積每組6只于造模后第1天，余6只于第14天行mNSS評(píng)估后處死。采用水合氯醛麻醉大鼠并處死，快速取出大腦置于-80 ℃冰箱，于鼠腦槽中制備2 mm厚的冠狀腦切片，加入預(yù)先配制的40 g/L TTC染液并在37 ℃恒溫箱中進(jìn)行孵育，40 g/L多聚甲醛溶液過(guò)夜固定。正常腦組織為紅色，梗死灶為白色。采用Image J 1.41 圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。腦梗死體積=梗死面積×厚度/全腦體積×100%。

1.6 ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織中氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)因子表達(dá)情況取第14天大鼠腦組織，制備腦組織勻漿，采用ELISA法檢測(cè)氧化應(yīng)激因子SOD、CAT、MDA和炎癥因子hs-CRP、TNF-α及IL-6的水平。

1.7 Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平取第14天大鼠腦組織勻漿，裂解后提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠法電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白封閉2 h后加鼠抗人VEGF抗體(1∶600稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。加二抗，搖床室溫孵育2 h。PVDF洗膜3次，每次20 min，加入ECL顯色劑。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，分析目的條帶/內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠mNSS評(píng)分的差異，采用2×4析因設(shè)計(jì)的方差分析比較各組大鼠腦梗死體積的差異，采用單因素方差分析比較各組大鼠氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)因子水平及VEGF蛋白表達(dá)水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠第3、7、14天的mNSS評(píng)分增高(P<0.05)，表明其神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重；低、中、高劑量EPA組第7、14天mNSS評(píng)分均低于模型組(P<0.05)。

A：模型組；B、C、D：分別為低、中、高劑量EPA組；E：假手術(shù)組

2.2 各組大鼠腦梗死體積的比較假手術(shù)組未見(jiàn)腦組織梗死區(qū)域；模型組大鼠第14天腦梗死體積增大，而與模型組比較，低、中、高劑量EPA組的腦梗死體積縮小(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(表1)。

表1 各組大鼠腦梗死體積的比較 %

2.3 各組大鼠腦組織中氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)因子水平的比較第14天，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT水平降低，MDA水平升高；與模型組相比，中、高劑量EPA組SOD、CAT水平升高，MDA水平降低(P<0.05)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中hs-CRP、TNF-α及IL-6水平均升高；與模型組相比，中、高劑量EPA組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性(表2)。

表2 各組大鼠腦組織中氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)因子水平及VEGF蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 各組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。第14天，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平降低；與模型組相比，低、中、高劑量EPA組VEGF蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。

1～5：分別為假手術(shù)組,模型組及低、中、高劑量EPA組

3 討論

腦卒中是全球第三大死亡因素，絕大多數(shù)腦卒中為ACI，具有發(fā)病迅速、死亡率高、預(yù)后差等特點(diǎn)；腦細(xì)胞缺血缺氧后伴隨一系列病理生理學(xué)變化，如氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、脂肪因子異常等，故ACI的發(fā)生、發(fā)展與腦部血液循環(huán)障礙密切相關(guān)[13-14]。EPA為Ω-3不飽和脂肪酸的一種。近期研究[8]發(fā)現(xiàn)，EPA可通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善線粒體功能等機(jī)制減輕心肌缺血損傷，治療冠心病等，且在心臟、腎臟及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究觀察了不同劑量EPA對(duì)左側(cè)MCAO模型大鼠神經(jīng)功能障礙及氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)的影響。目前臨床已上市藥物中多烯酸乙酯軟膠囊的主要成分為二十碳五烯酸乙酯，臨床劑量為30～90 mg/kg。根據(jù)體表面積折算法，推算大鼠的臨床等效劑量為150～600 mg/kg，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)置EPA的低、中、高劑量分別為150、300、600 mg/kg。本研究結(jié)果顯示，低、中、高劑量EPA連續(xù)給藥14 d均可顯著縮小模型大鼠的腦梗死體積，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。ACI病灶中心區(qū)以神經(jīng)元壞死為主，周圍則是缺血半暗帶(存在大量活神經(jīng)元)[15]。推測(cè)EPA可能通過(guò)減少缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡，激活神經(jīng)細(xì)胞，從而減小腦梗死體積。此外，缺血性腦梗死局部血流量顯著降低，伴隨腦細(xì)胞萎縮與死亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，低、中、高劑量EPA組連續(xù)給藥7、14 d后mNSS評(píng)分降低，表明EPA可在一定的劑量范圍內(nèi)減輕模型大鼠神經(jīng)功能障礙，改善其神經(jīng)功能。由于ACI是腦動(dòng)脈閉塞或栓塞導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧的一種急性腦血管病，病理生理過(guò)程包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)消失、能量代謝障礙、血管再生等，故EPA可能從多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

ACI一般伴有大量氧自由基形成，導(dǎo)致連鎖反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成損傷[17]。氧化應(yīng)激是缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)功能損傷的重要環(huán)節(jié)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，其表達(dá)水平反映氧化損傷的程度。而SOD和CAT是氧自由基清除劑，其活性水平與組織中氧自由基的積累密切相關(guān)。SOD、CAT及MDA是氧化應(yīng)激的經(jīng)典指標(biāo)[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT水平比假手術(shù)組降低，而MDA水平升高，與以往研究[19-20]結(jié)果一致。而連續(xù)給予EPA治療14 d后，SOD、CAT水平升高，MDA水平降低，表明EPA可減輕ACI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)貫穿動(dòng)脈粥樣硬化及腦梗死病程，多種細(xì)胞因子與其密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)激活可致TNF-α、CRP、IL-6等具有神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子大量分泌[21]。在腦缺血早期，TNF-α合成大量增多，可顯著增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，為誘發(fā)腦梗死的重要因素。此外，TNF-α可誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，誘導(dǎo)白細(xì)胞活化、趨化、黏附、滲出進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；CRP是巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生的一種急性反應(yīng)蛋白；IL-6是一種多功能促炎因子，可誘導(dǎo)炎癥急性期反應(yīng)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組腦組織中hs-CRP、TNF-α及IL-6水平高于假手術(shù)組；而中、高劑量EPA給藥14 d后均可降低模型大鼠腦組織中hs-CRP、TNF-α及IL-6水平，表明EPA可抑制炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)損傷。

腦梗死缺血后神經(jīng)修復(fù)的基礎(chǔ)與關(guān)鍵是血管新生，可為神經(jīng)再生提供重要的營(yíng)養(yǎng)支撐。VEGF是血管新生的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活和誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解促進(jìn)新血管形成[23-24]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腦組織中VEGF表達(dá)水平降低，與李磊等[20]研究結(jié)果相似；而EPA各治療組大鼠腦組織中VEGF表達(dá)升高，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，表明EPA可促進(jìn)局灶性腦梗死大鼠腦血管新生。

綜上所述，EPA可降低ACI大鼠的腦梗死體積，改善神經(jīng)功能，有效緩解氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)腦血管新生有關(guān)。