黃祚驊，鄒嘉偉，周文娟，劉駿晴，阮詩琪，倪林*，鄒雙全*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002；3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州 350002)

香樟(Cinnamomumlongepaniculatum)屬樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物，主要分布于中國長江以南地區(qū)，為中國特有樹種[1]。香樟植株的根、莖、葉均含有不同含量的1，8-桉葉油素、α-萜品醇及香檜烯等精油成分。香樟資源較為豐富，已成為香料、醫(yī)藥、日用和化工產(chǎn)品的重要原料來源[2]。目前對香樟的研究主要集中在精油提取、精油成分及生理功能等方面。杜永華[3]等通過系統(tǒng)預(yù)試和專項預(yù)試相結(jié)合的方法分析提取芳香精油后的殘渣化學(xué)成分，結(jié)果表明其含有有機(jī)酸、酚、黃酮、甙類、甾體、三萜、內(nèi)酯、香豆素等成分，具有抑菌[4-5]、抗炎[6]、抗油脂氧化[7-8]、抗肝癌[9-10]等生理活性。國內(nèi)外研究顯示香樟葉對多種真菌病害具有抑制作用[11]。陶翠等[12]研究表明，香樟葉油枯萃取相對須毛癬菌、犬小孢子菌和石膏小孢子菌3種真菌具有一定的殺菌作用。李苗等[13]從油樟葉片中分離的油樟真菌 YZP-01以及常見植物病原真菌繩狀籃狀菌(Talaromycesfuniculosus)、擬輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)四種致病菌株進(jìn)行了拮抗試驗，發(fā)現(xiàn)了該菌株具有廣譜且良好的拮抗病原菌活性。因此香樟萃取相具備開發(fā)為植物病原菌殺菌劑的潛力。瓜果腐霉病菌是鞭毛菌亞門的植物病原真菌，可危害瓜類、茄科、煙草、玉米、棉花、甜菜等多種重要經(jīng)濟(jì)作物，引起幼苗猝倒、根莖和瓜果腐爛等病害癥狀，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[14]。茄鏈格孢菌是重要的植物病原真菌之一[15]，屬于半知菌鏈格孢屬，該屬真菌能引起許多重要作物病害，如番茄、辣椒、馬鈴薯等茄科農(nóng)作物，直接危害作物果實[16]，引起農(nóng)作物減產(chǎn)，給種植戶造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以香樟枝葉提取精油后的提取液為材料，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附、95%乙醇洗脫、有機(jī)溶液萃取等一系列操作得到香樟餾分，對不同部位餾分進(jìn)行抑菌活性研究，為進(jìn)一步綜合利用香樟資源，減少排放的香樟提取液對環(huán)境的破壞，使其變廢為寶，為植物真菌病害的綠色防治提供科學(xué)依據(jù)，為香樟葉的深度利用提供參考。

1 實驗方法

1.1 試劑與儀器

實驗儀器有：TQ系列多功能提取罐(廈門百盛捷自動化設(shè)備有限公司)；QWZL-300直線往復(fù)式切藥機(jī)(臺州春江制藥機(jī)械有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)；高低溫循環(huán)裝置(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)；SC-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；GR85DF 型高壓滅菌鍋(美國致微儀器有限公司)；CPA225D 型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；KQ500DE 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器公司)；Buchi Rotavapor Essential 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)。有機(jī)溶劑有甲醇、石油醚、乙醇、乙酸乙酯等(西隴化工有限公司)。

1.2 材料與菌種

香樟樣品于2019年7月采摘于福建連城，樹齡3 a。樣品經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)鄒雙全教授鑒定為樟科樟屬香樟。樣品存放于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院制藥工程專業(yè)實驗中心。

供試菌種為茄病鐮刀病菌(Fusarium solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、茄鏈格孢病菌(Alternaria solani)，由福建農(nóng)林大學(xué)教育部生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點實驗室提供。

1.3 提取分離

陰干粉碎香樟枝葉121.71 kg，經(jīng)100 ℃飲用水回流提取3 h，回收提取液，經(jīng)大孔樹脂吸附后用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮得1.8 kg浸膏。取1.4 kg浸膏經(jīng)甲醇溶解后，與4.4 kg硅藻土拌樣；依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醇萃取，減壓回收溶劑，分別得到石油醚萃取相64.96 g、乙酸乙酯萃取相404.48 g、乙醇萃取相528.95 g備用。

1.4 香樟萃取相抑菌活性檢測

分別稱取2.0 g供試植物石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、乙醇萃取相溶解于分析純DMSO溶液中，超聲輔助溶解制成100 mg/mL的粗提物母液，配置成2.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，以含等濃度的分析純DMSO的培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次，接種培養(yǎng)。采用菌絲生長速率法[17]測定對5種供試植物病原真菌的抑制活性，計算抑菌率。

1.5 香樟提取物毒力測定

采用菌絲生長速率法測定活性部位對目標(biāo)菌種的毒力大小，將提取物用50%乙醇水溶解，超聲輔助溶解配置成提取物母液。設(shè)置不同濃度梯度，最終配置成濃度0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL、8.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基。以含等濃度的50%甲醇水培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次，接種培養(yǎng)。測定抑菌活性并計算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及抑制中濃度(EC50)，用 EXEL 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，運(yùn)用 SPSS 2020 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟粗提物抑菌活性篩選

采用生長速率法測定了香樟3個部位濃度2 mg/mL的提取物對5種植物病原真菌的抑菌活性，測定結(jié)果表明香樟提取物對5種真菌均有抑制活性，其中石油醚部位提取物對植物病原真菌的抑制活性最好，乙酸乙酯部位次之，乙醇部位提取物的抑菌活性明顯低于其他前兩個部位(圖1)。香樟石油醚提取物對油菜菌核菌(S-1)、瓜果腐霉菌(P-3)、茄鏈格孢病菌(A-2)的抑制率分別為78.08%、70.37%、77.10%，具有較好的抑菌活性；香樟乙酸乙酯提取物對5種植物病原真菌的抑菌率均高于30%，對茄鏈格孢病菌(A-2)的抑菌效果最好，為57.94%；香樟乙醇提取物對瓜果腐霉菌(P-3)和茄病鐮刀病菌(F-4)的抑菌效果最好，抑制率為52.38%和35.52%，對其它3種植物病原菌存在一定抑制效果，但效果不如乙酸乙酯部位和石油醚部位的提取物。

圖1 香樟3個部位提取物抑菌率

2.2 香樟乙酸乙酯提取物對病原菌的毒力測定結(jié)果

選取瓜果腐霉菌(P-3)和茄鏈格孢菌(A-2)進(jìn)行毒力測定，擬合相應(yīng)的毒力回歸方程(表1)。香樟乙酸乙酯提取物對茄鏈格孢菌的抑制效果最佳，EC50值為1.806 0 mg/mL；對瓜果腐霉菌的抑制作用較低，EC50值為1.935 0 mg/mL(圖2)。

表1 香樟乙酸乙酯提取物對2種植物病原菌的相對毒力

圖2 不同濃度香樟乙酸乙酯提取物對2種植物病原菌的抑制效果

3 討論與結(jié)論

本研究通過活性追蹤法，研究了香樟3個部位提取物對5種植物病原真菌的抑菌活性，旨在為活體篩選抑菌植物提供依據(jù)。試驗結(jié)果表明香樟提取物對茄病鐮刀病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核菌、瓜果腐霉菌、茄鏈格孢菌具有抑制作用，且不同提取溶劑提取的有效成分對植物抑菌效果不盡相同。香樟石油醚提取物與乙酸乙酯提取物抑制作用效果明顯，抑制活性高于乙醇提取物。在2 mg/mL濃度條件下，石油醚提取物對油菜菌核菌、瓜果腐霉菌、茄鏈格孢病菌的抑制率均在70%以上，具有較好的抑制作用，具備開發(fā)為防治多種植物病害的天然藥物的潛力。結(jié)合回歸分析數(shù)據(jù)，香樟乙酸乙酯對茄鏈格孢菌的抑菌活性最好，EC50值為1.806 0 mg/mL，可作為一種防治茄鏈格孢菌的新型植物源殺菌劑進(jìn)一步研究。

香樟是一種兼具材用、藥用的植物，在我國資源較為豐富。香樟葉提取完精油后的提取液作為廢棄物排放，勢必會對環(huán)境造成一定的污染，所以發(fā)現(xiàn)其潛在抑菌活性成分就顯得尤為重要。植物源殺菌劑研究的基礎(chǔ)是植物源抑菌活性物質(zhì)的分離鑒定。抑菌活性成分的分離鑒定對于解釋其殺菌活性機(jī)理和開發(fā)應(yīng)用為植物源殺菌劑等具有至關(guān)重要的意義[18]。本研究發(fā)現(xiàn)香樟提取物的抑菌活性成分集中于石油醚提取部位，今后可圍繞香樟石油醚提取部位進(jìn)行抑菌先導(dǎo)化合物的開發(fā)，為香樟葉及其他部位資源的研究與開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)新型植物源殺菌劑開發(fā)提供依據(jù)。