曹楠楠, 林雅慧, 司徒博, 羅文凡

1廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部(廣東廣州 510120)； 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 2檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科， 3感染內(nèi)科(廣東廣州 510515)

念珠菌廣泛存在于自然界和人類的生活環(huán)境中。在人體中，念珠菌存在于皮膚、口腔、陰道和腸道等處，參與人體微生態(tài)的構(gòu)成并保持穩(wěn)定[1-3]。同時(shí)念珠菌也是條件致病性真菌。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或某些部位的微生態(tài)環(huán)境失調(diào)時(shí)，人體內(nèi)定植的念珠菌侵襲性生長，可引起念珠菌病并造成嚴(yán)重后果[4]。臨床上以白念珠菌為最常見的致病性念珠菌。非白念珠菌致病菌種多達(dá)16種，其中以熱帶念珠菌，光滑念珠菌，近平滑念珠菌和克柔念珠菌較為常見[5]。致病性念珠菌的菌種和藥敏結(jié)果各異，治療藥物的選擇、和預(yù)后也各不相同[5]。比如克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥，光滑念珠菌對唑類常用抗真菌藥物敏感度下降。因此念珠菌菌種的正確鑒定非常重要。在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中，念珠菌的鑒定方法常包括念珠菌表型鑒定、真菌蛋白基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析以及對真菌核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)測序鑒定[6-8]。在本研究中，我們比較了臨床常用的這3種方法鑒定念珠菌的性能，為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室選擇合適的念珠菌鑒定方法提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 念珠菌菌株來源于2018年12月至2019年4月間臨床送檢的真菌培養(yǎng)樣本，共計(jì)63株。高壓無菌濾紙取蘸取沙保培養(yǎng)基或顯色平板上單菌落，一式三份置入EP管內(nèi)，放入-40℃冰箱保存。菌株來源的標(biāo)本類型主要包括白帶(8例)，肺泡灌洗液(2例)，糞便(5例),肛門拭子(1例)，甲屑(1例)，口腔拭子(3例)，皮膚刮取物(2例)，皮屑(1例)，傷口拭子(1例)，深部痰(9例)，痰(18例)，胃液(1例)，咽拭子(1例)，引流物(3例)，中段尿(5例)。

1.1.2 試劑和儀器 試劑： 真菌培養(yǎng)沙保氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基來自梅里埃(上海)生物制品有限公司；真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒來自安圖生物工程有限公司；酵母菌鑒定卡來自梅里埃(上海)生物制品有限公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)液、真菌裂解預(yù)處理液、質(zhì)譜專用靶板、質(zhì)控品、接種環(huán)來自梅里埃(上海)生物制品有限公司；真菌rDNA ITS通用引物ITS1和ITS4、5xTBE buffer、溴化乙錠溶液Ethidium bromide、DNA Marker D、dNTP、 DNA聚合酶來自生工生物工程公司。

儀器： Effendorf 恒溫培養(yǎng)箱，Heal Force生物安全柜，Vitek MS全自動質(zhì)譜分析儀，DK-8D電熱恒溫水槽，Eppendorf Centrifuge 5417R，Eppendorf PCR擴(kuò)增儀，DYY-6C電泳儀，BIORAD凝膠成像儀，真菌rDNA ITS測序?yàn)橥馑晚?xiàng)目，委托公司為生工生物工程股份有限公司廣州部。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)蘇念珠菌菌株 將-40℃冰箱保存的61株念珠菌取出，在酒精燈旁，用無菌鑷子取出EP管內(nèi)蘸取菌落的濾紙，放置在沙保培養(yǎng)基上復(fù)溫，四區(qū)劃線，最后將接種好的平板置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～72 h。

1.2.2 真菌生化表型檢測鑒定念珠菌 在本研究中我們采用安圖生物真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒和梅里埃酵母菌鑒定卡完成念珠菌的鑒定。安圖生物真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒只能鑒定白念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，熱帶念珠菌。安圖生物真菌鑒定藥敏試劑盒無法鑒定的念珠菌繼續(xù)采用梅里埃酵母菌鑒定卡完成。

使用安圖生物真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒鑒定念珠菌。取出培養(yǎng)液及藥敏試劑板，使其平衡至室溫，吸取培養(yǎng)液100 μL至陰性對照孔；挑取單菌落用生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)宵c(diǎn)單位菌懸液，取40 μL加到培養(yǎng)液中混勻制得接種液；將接種液接種至除陰性孔所有藥敏微孔中，每孔100 μL，最后所有微孔滴加1滴礦物油，將藥敏試驗(yàn)板置于35℃培養(yǎng)箱18～24 h觀察結(jié)果。

使用梅里埃微生物生化鑒定儀鑒定上述方法無法鑒定的念珠菌。挑取待測菌的單個(gè)菌落，用3 mL生理鹽水制成2.0麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙骸⒚防锇＝湍妇b定卡YST的吸管側(cè)放入菌懸液中，放入梅里埃全自動微生物生化鑒定儀。

1.2.3 MALDI-TOF MS分析鑒定念珠菌 用1 μL接種環(huán)取培養(yǎng)18～24 h的少量菌落涂靶板點(diǎn)位，先用0.5 μL甲酸均勻點(diǎn)在菌膜上，自然干燥后加1 μL CHCA基質(zhì)，待基質(zhì)完全干燥上機(jī)輸入標(biāo)本信息然后按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行質(zhì)譜檢測并分析結(jié)果。

1.2.4 真菌rDNA ITS測序鑒定念珠菌 DNA提取 本實(shí)驗(yàn)采取煮沸法提取DNA，用高壓滅菌槍頭挑取沙保培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng)48～72 h的單菌落，裝入盛有200 μL滅菌雙蒸水的EP管中，震蕩儀充分混勻，沸水煮25 min，冷卻后12 000 r/min低溫離心10 min，吸取150 μL上清保存。

PCR反應(yīng) 使用說明書推薦的擴(kuò)增體積和擴(kuò)增條件進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。PCR Buffer 1 μL，MgCl24 μL，引物ITS1和 ITS4各0.5 μL，dNTP 4 μL，DNA聚合酶0.25 μL，模板(100～300 ng/μL)4 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL。PCR擴(kuò)增條件(94℃ 2 min；94℃ 30 s；59℃ 30 s；72℃ 90 s；35 cycles；72℃ 7 min)。取擴(kuò)增后的PCR序列產(chǎn)物5 μL和上樣緩沖液1 μL混勻，加入1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣區(qū)，進(jìn)行電泳30 min(100 V)，使用3xGeRed后染然后在紫外凝膠成像儀顯影成像，觀察是否擴(kuò)增出目的條帶，以及PCR擴(kuò)增序列出來的條帶是否單一，亮度明顯。出現(xiàn)明顯條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送檢上海生工生物工程有限公司廣州部進(jìn)行ITS序列測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以真菌ITS測序鑒定結(jié)果為參考方法，比較真菌生化表型鑒定方法與真菌蛋白MALDI-TOF MS分析方法的鑒定結(jié)果差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，采用配對四格表的2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 61株念珠菌均可從凍存的濾紙片上成功復(fù)蘇 凍存的念珠菌在沙氏培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)條件下復(fù)蘇生長良好。見圖1。

2.2 真菌表型鑒定試劑盒-安圖生物真菌鑒定藥敏試劑盒和梅里埃酵母菌鑒定卡可鑒定出全部念珠菌 安圖真菌鑒定藥敏試劑盒鑒定結(jié)果顯示，61株念珠菌臨床菌株中包括 31株白念珠菌，其余30株經(jīng)梅里埃酵母菌鑒定卡鑒定為5株近平滑念珠菌。15株光滑念珠菌，10株熱帶念珠菌。見表1。

圖1 復(fù)蘇念珠菌在沙氏培養(yǎng)基的生長情況

2.3 MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析可鑒定出全部念珠菌 MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果顯示，61株念珠菌臨床菌株包括31株白念珠菌，15株光滑念珠菌，9株熱帶念珠菌，5株近平滑念珠菌，1株奧默柯達(dá)菌。見表1。

2.4 真菌rDNA ITS測序分析鑒定出全部念珠菌 真菌rDNA ITS測序分析鑒定結(jié)果顯示，61株念珠菌臨床菌株包括31株白念珠菌，15株光滑念珠菌，9株熱帶念珠菌， 3株近平滑念珠菌，2株擬平滑念珠菌，1株奧默柯達(dá)菌。見表1。

2.5 3種方法鑒定念珠菌結(jié)果部分一致 61株念珠菌中有57株3種鑒定方法的結(jié)果一致，一致率達(dá)93.44%(57/61)。見表1。

表1 61株念珠菌臨床株鑒定結(jié)果

4株鑒定結(jié)果不一致的念珠菌。見表1(4/61)：1株來自肛門拭子標(biāo)本的念珠菌，生化表型鑒定為光滑念珠菌，MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析和ITS測序鑒定為白念珠菌。1株來自皮屑的念珠菌，生化表型鑒定為白念珠菌，MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析鑒定為近平滑念珠菌，ITS測序鑒定為擬平滑念珠菌。1株來自糞便的念珠菌，生化表型鑒定為熱帶念珠菌，MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析和ITS測序均鑒定為奧默柯達(dá)菌。1株來自甲屑的念珠菌，生化表型鑒定和MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析均鑒定為近平滑念珠菌，ITS測序鑒定為擬平滑念珠菌。

2.6 生化表型鑒定與MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以rDNA ITS測序鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，真菌生化表型鑒定方法與 MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析的檢測結(jié)果。見表2。

表2 兩種方法的檢測結(jié)果 株

3 討論

念珠菌是真菌中最常見的條件致病菌。念珠菌感染好發(fā)于免疫功能低下者，可侵犯皮膚黏膜淺層或全身的組織器官，臨床表現(xiàn)多樣，輕重不一。研究表明，念珠菌所致感染性休克患者若24 h內(nèi)未開始治療，其病死率高達(dá)97.6%[9]。在治療方面，臨床上不同念珠菌對抗真菌藥物敏感度不同，因此臨床微生物實(shí)驗(yàn)室盡可能在種水平鑒定病原菌，以幫助臨床抗菌藥物選擇，改善患者預(yù)后[10]。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常用的念珠菌鑒定方法包括生化反應(yīng)表型，MALDI-TOF MS分析以及對真菌特定DNA片段進(jìn)行測序。生化表型鑒定是傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，適用范圍廣，對設(shè)備要求不高，廣泛應(yīng)用于基層檢驗(yàn)科。其不足之處在于反應(yīng)時(shí)間長，可鑒定的念珠菌數(shù)量有限，難以滿足罕見少見念珠菌的鑒定需要。MALDI-TOF MS分析通過將待測菌株的蛋白質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中已知真菌的參考蛋白譜進(jìn)行比對后可得出鑒定結(jié)果，耗時(shí)短，通常3～5 min可完成鑒定過程，成本低，高通量。其不足之處在于質(zhì)譜設(shè)備昂貴，標(biāo)本量少的試驗(yàn)室難以配備。真菌特定DNA片段(通常為rDNA ITS)核酸序列分析通過將擴(kuò)增得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，從而獲得真菌的種屬信息鑒定真菌。該方法還可以發(fā)現(xiàn)少見菌及新菌種，目前被認(rèn)為是真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。但真菌核酸序列分析的測序設(shè)備昂貴、對環(huán)境和操作人員要求較高，難以在常規(guī)臨床微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)共納入了61株念珠菌，所有菌株均來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院臨床真菌培養(yǎng)標(biāo)本。結(jié)果顯示，本研究涉及了臨床最為常見4種酵母樣真菌(白念珠菌，熱帶念珠菌，光滑念珠菌，近平滑念珠菌)[10]。中國醫(yī)院侵襲性真菌病監(jiān)測網(wǎng)(China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net, CHIF-NET)一項(xiàng)65所醫(yī)院5年8 829株念珠菌臨床分離株數(shù)據(jù)顯示，這4種最常見的念珠菌感染可占臨床真菌感染的92.9%，依次為白念珠菌(44.9%)、近平滑念珠菌復(fù)合群(20.0%)、熱帶念珠菌(17.2%)、光滑念珠菌復(fù)合群(10.8%)[11]。除此之外，本研究還分離到了1株奧默柯達(dá)菌。奧默柯達(dá)菌為酵母真菌一種，不是臨床常見致病菌，對于多種抗真菌藥物敏感[12]。

本實(shí)驗(yàn)所使用的表型鑒定方法包括安圖真菌藥敏鑒定試劑盒和梅里埃Vitek2 YST酵母菌鑒定卡。其中安圖真菌鑒定試劑盒區(qū)分白念和非白念珠菌，梅里埃YST酵母菌鑒定卡對非白念珠菌進(jìn)一步鑒定。由于表型鑒定方法受菌株生長時(shí)間，菌株純度影響大，因此表型鑒定?？蓪?dǎo)致鑒定錯(cuò)誤[13]。采用表型鑒定的病原菌，當(dāng)其致病性與臨床表現(xiàn)不一致時(shí)，應(yīng)當(dāng)采用真菌rDNA ITS測序?qū)觇b定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)[14]。

在本實(shí)驗(yàn)中MALDI-TOF MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果與測序鑒定結(jié)果有差異的菌株均為質(zhì)譜鑒定為近平滑念珠菌，金標(biāo)準(zhǔn)測序結(jié)果顯示為擬平滑念珠菌。由于目前的真菌病原學(xué)認(rèn)為，近平滑念珠菌、擬平滑念珠菌與似平滑念珠菌均屬于近平滑念珠菌復(fù)合群。這3種念珠菌在2005年以前被認(rèn)為是近平滑念珠菌的3種基因亞型，生化反應(yīng)、表型非常類似，僅核酸序列有差異。在此我們認(rèn)為質(zhì)譜結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)都將其鑒定為近平滑念珠菌復(fù)合群，結(jié)果一致，質(zhì)譜鑒定與金標(biāo)準(zhǔn)符合率100%。有文獻(xiàn)指出，質(zhì)譜基于蛋白質(zhì)差異來提示菌株間的親緣關(guān)系，在真菌研究中證實(shí)與基于真菌rDNA序列的分析結(jié)果具有較好的一致性[15]。并且MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析能夠快速鑒定臨床常見酵母菌，主要基于真菌的蛋白指紋數(shù)據(jù)庫，相信隨著質(zhì)譜技術(shù)分辨率的提高和真菌蛋白數(shù)據(jù)庫的升級，未來質(zhì)譜技術(shù)鑒定念珠菌可達(dá)到亞種水平[16]。

本實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)的表型鑒定念珠菌方法與金標(biāo)準(zhǔn)rDNA ITS測序結(jié)果一致率達(dá)93.44%(57/61),質(zhì)譜鑒定結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)rDNA ITS測序結(jié)果一致率達(dá)96.7%(59/61)。這兩種方法在鑒定效能上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果意味著基層實(shí)驗(yàn)室可將真菌生化表型鑒定方法作為鑒定臨床常見4種念珠菌的常規(guī)方法，滿足臨床需要。當(dāng)臨床真菌菌株生化表型鑒定結(jié)果與臨床表現(xiàn)出現(xiàn)差異時(shí)，應(yīng)直接送檢第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測序鑒定，不必加做質(zhì)譜鑒定。而對于已經(jīng)配備MALDI-TOF MS微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室而言，臨床念珠菌株鑒定應(yīng)首選MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析方法以獲得最大的鑒定效率，并可作為疑難菌種鑒定確診方法。當(dāng)質(zhì)譜鑒定念珠菌株的結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符時(shí)，不應(yīng)再用表型鑒定的方法再次鑒定，而應(yīng)對該念珠菌進(jìn)行rDNA ITS測序以獲得鑒定結(jié)果，從而加快臨床診斷，為臨床藥物選擇提供重要參考，為治療念珠菌感染爭取時(shí)間。