呂歸紅 陳 宇

1 杭州市富陽(yáng)中醫(yī)骨傷醫(yī)院 浙江 杭州 311400

2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

金銀花首載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，名忍冬，為常用中藥［1］，其味甘，性寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱、增強(qiáng)免疫、降血脂、抗內(nèi)毒素、利膽、保肝、抗腫瘤等藥理作用［3］。大量研究顯示，金銀花具有廣譜抗菌作用[4]，可抑制金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌，被稱為抗菌之王[5]。金銀花的副產(chǎn)物枝葉產(chǎn)量較高，卻一直被視為非藥用部位而長(zhǎng)期未得到利用?！侗静菥V目》：“莖葉及花，功用皆同?！爆F(xiàn)代藥理研究也表明金銀花枝葉與金銀花具有相近的化學(xué)成分和藥理活性。隨著抗生素的廣泛使用以及微生物耐藥現(xiàn)象越趨嚴(yán)重，對(duì)于尋找、合理開發(fā)、使用中草藥替代西藥解決抗菌消炎問(wèn)題和防止二次污染的研究具有非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)金銀花枝葉提取液的體外抑菌和體內(nèi)抗炎作用研究，探討其體外抑菌效果和對(duì)急性炎癥作用的影響，為金銀花枝葉的合理開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步開發(fā)綠色環(huán)保的抗菌中草藥。

1 材料

1.1 動(dòng)物：ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。

1.2 儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（日本THERRMO）；SW-CJ 型生物潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；全自動(dòng)手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；METTLER AE-240 電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；J-15R 冷凍型高效臺(tái)式離心機(jī)[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司]。

1.3 試藥：金黃色葡萄球菌(ATCC23259)、大腸埃希菌(ATCC22953)、銅綠假單胞菌(ATCC23578)由浙江省臨床檢驗(yàn)中心提供；金銀花枝葉提取液由浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心提供，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花枝葉提取液制備：準(zhǔn)確稱取金銀花枝葉100g，加入14倍量70%濃度乙醇溶液，分2次提取，每次1.5h，制備得到提取液，過(guò)濾，回收乙醇，水浴上濃縮至100ml，制成1mg/ml 的溶液，滅菌，密封，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試菌株和含菌平板制備：無(wú)菌條件下，將供試菌種移接入相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，35～37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)44～48h，0～4℃下冷藏備用。分別用接種環(huán)取少許菌體置于裝有9ml 無(wú)菌生理鹽水試管內(nèi)，振蕩搖勻，制成菌懸液，含菌體量103～105 個(gè)/ml，分別用無(wú)菌移液管向相應(yīng)的固體平板上加0.1ml 菌懸液，并涂布均勻。

2.3 抑菌圈直徑測(cè)定：采用藥敏紙片法將6mm 定性濾紙小圓片分裝于潔凈干燥試管內(nèi)，120℃干熱滅菌2h后備用。無(wú)菌操作下將100 片滅菌濾紙片浸于1ml 各濃度金銀花枝葉醇提物中，置冰箱內(nèi)浸泡1h，然后置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)干燥2～3h 后無(wú)菌操作貼在制備好的含菌平板上，以相同濃度濾紙片3片作為1片，每皿均勻分貼不同藥液濾紙片10 片，重復(fù)3 次；置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后取出觀察，以藥敏紙片周圍無(wú)色區(qū)域?yàn)橐志?，測(cè)量直徑，求出3個(gè)平皿的平均值。金銀花枝葉提取液對(duì)三種病原菌均有抑制作用，金黃色葡萄球菌較強(qiáng)敏感性，大腸埃希菌中度敏感，銅綠假單胞菌低度敏感，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)三種細(xì)菌的抑菌結(jié)果（±s，mm)

表1 對(duì)三種細(xì)菌的抑菌結(jié)果（±s，mm)

抑菌圈直徑20.68±0.35 15.98±0.16 11.67±0.18菌 株金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌空白對(duì)照－－－

2.4 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定：采用試管二倍稀釋法，13mm×100mm滅菌具塞試管11支。每管先加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2ml，然后于第1 管中加入滅菌金銀花提取物2ml，混勻后取出2ml 放入第2 管中，依次類推，直到第9管取出2ml 棄去，配成含中藥提取物分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……各濃度液體。第10管不加藥物作為對(duì)照，以觀察培養(yǎng)基是否適合細(xì)菌生長(zhǎng)。第11 管加受試藥液2ml，混勻取出2ml 棄去，不加細(xì)菌，以觀察受試中藥是否污染。將培養(yǎng)6h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌試驗(yàn)菌液用無(wú)菌肉湯稀釋，取0.1ml分別加入1～10管中，混勻后一起放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。記錄各管內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以渾濁度為指標(biāo)檢查有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以不顯示渾濁、細(xì)菌未生長(zhǎng)的藥液稀釋度為MIC。金銀花枝葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌MIC值為0.0308g/ml，而對(duì)銅綠假單胞菌為0.128g/ml，說(shuō)明金銀花枝葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌有較好的抑菌作用，對(duì)銅綠假單胞菌有較低的抑制作用，并隨著濃度的增大抑菌效果增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)各種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）

2.5 金銀花枝葉提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響：取ICR 小鼠40 只，隨機(jī)分成4 組（空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、金銀花枝葉提取液組），每組10 只。灌胃：空白對(duì)照組0.9%生理鹽水20ml/kg，陽(yáng)性藥物組吲哚美辛10mg/kg，金銀花枝葉提取液組1mg/ml 提取液20ml/kg。給藥7 天，末次給藥40min 后，除空白組外按20μl/只均勻涂抹二甲苯于右耳正反兩面，20min 后脫頸處死，用直徑9mm 打孔器在左右耳同一部位沖下耳片，分別稱定重量，計(jì)算耳腫脹及耳腫脹抑制率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)小鼠耳腫脹的影響（±s）

表3 對(duì)小鼠耳腫脹的影響（±s）

注：與模型組比較，bP＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組金銀花枝葉提取液組耳腫脹度1.12±0.58 13.43±3.44 7.11±2.89b 9.40±2.71b抑制率——47.06%30.01%

2.6 金銀花枝葉提取液對(duì)白細(xì)胞（WBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）的影響：按“2.5”項(xiàng)下方法構(gòu)建急性炎癥小鼠模型，30min 后，摘眼球取血，采集的血液按照血常規(guī)方法測(cè)定血液中白細(xì)胞（WBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 對(duì)急性炎癥小鼠WBC、Hb的影響（±s）

表4 對(duì)急性炎癥小鼠WBC、Hb的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型組陽(yáng)性對(duì)照組金銀花枝葉提取液組Hb（g·L-1）142.26±4.49 111.64±5.41a 134.58±8.92b 128.33±7.42b WBC（×109·L-1）6.27±0.76 8.52±0.49a 5.84±0.69b 7.65±0.63b

3 小結(jié)

血液中的白細(xì)胞、血紅蛋白水平在一定程度上可以反映骨髓的造血功能，炎癥發(fā)生時(shí)白細(xì)胞升高、而Hb水平會(huì)有不同程度降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性炎癥小鼠造模成功后白細(xì)胞升高，Hb 有一定程度下降，符合預(yù)期，而當(dāng)給予了金銀花枝葉提取液的炎癥小鼠，其白細(xì)胞水平降低，同時(shí)Hb得到顯著回升；通過(guò)急性炎癥實(shí)驗(yàn)表明金銀花枝葉提取液又能夠顯著抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，由此可見(jiàn)金銀花枝葉提取液對(duì)急性炎癥有一定的治療作用。