李洪洋 南雪梅 孫 鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

奶牛乳房炎是一種高發(fā)性多因素疾病，生理狀態(tài)、營養(yǎng)水平、環(huán)境條件、管理制度等方面的差異均有可能引起奶牛乳房炎的發(fā)生，導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)受到影響，致使牧場經(jīng)濟(jì)效益大幅降低[1]。病源微生物是引起奶?；既榉垦椎闹饕蛑?，常見的致病菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌，涵蓋革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌兩大類[2-3]，它們分布于空氣、水體以及奶?？山佑|物體表面，極易導(dǎo)致奶牛罹患乳房炎。致病菌由乳頭導(dǎo)管入侵并進(jìn)入乳腺組織，隨后引發(fā)感染和炎癥反應(yīng)[4]。由于前期治療乳房炎的有效藥物較少，使得抗生素憑借顯著的抗菌效果受到廣泛應(yīng)用。但隨著抗生素的大量使用，由其導(dǎo)致了耐藥性、藥物殘留以及由此引發(fā)的食品安全等問題，因此，亟需尋求更為安全有效且成本低廉的天然活性物質(zhì)以替代抗生素。

褪黑素(melatonin，MT)是一種主要由松果體合成分泌的吲哚類激素[5]，其在皮膚[6]、骨髓[7]、視網(wǎng)膜[8]、線粒體[9]亦可少量合成，在體內(nèi)分布廣泛，成為重要的“同步信號(hào)”，可有效調(diào)控機(jī)體的生物節(jié)律[10]。隨著相關(guān)研究的深入，發(fā)現(xiàn)MT可發(fā)揮抗氧化[11]和免疫[12]等生物學(xué)效應(yīng)。研究證實(shí)，MT及其多級(jí)代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)大的抗氧化功能，是一種有效的自由基捕獲劑[13]。除自身強(qiáng)有力的抵抗自由基的活性外，MT還能夠通過促進(jìn)抗氧化物酶的生成和增效抗氧化物酶的活性，從而發(fā)揮抗氧化效應(yīng)[14]。研究表明，MT對免疫細(xì)胞具有增殖及增效作用，MT在谷胱甘肽和谷胱甘肽還原酶缺乏的情況下，可參與維持中性粒細(xì)胞的活性和功能[15]。MT與T細(xì)胞的關(guān)系也十分密切，現(xiàn)已證實(shí)T細(xì)胞內(nèi)含有合成MT所需的4種酶類，并可在特定情況下高水平分泌。同時(shí)，MT對T細(xì)胞的激活和分化也存在調(diào)控功能，尤其是輔助性T細(xì)胞17(Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和記憶T細(xì)胞[16]。近年來，除MT清除體內(nèi)自由基、促進(jìn)免疫應(yīng)答的功能外，其抗炎效應(yīng)亦受到廣泛關(guān)注[17]。因此，本試驗(yàn)旨在通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)炎癥反應(yīng)模型，探究MT對LPS引起的BMECs炎癥反應(yīng)的緩解作用及潛在機(jī)制，為應(yīng)用MT防治奶牛乳房炎提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BMECs獲贈(zèng)于北京畜牧獸醫(yī)研究所智慧畜牧業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，液氮保存；LPS[大腸桿菌(E.coli)O55∶B5]購自美國Sigma公司；MT購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM+GlutaMAX培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)液、D-Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS，不含鈣、鎂)、0.05%胰蛋白酶(trypsin)-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液和Pen Strep雙抗混合液購自美國Thermo Fisher公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自北京酷來博科技有限公司，Western blot相關(guān)試驗(yàn)材料購自上海碧云天公司；一抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和核因子-κB同源蛋白(P65)購自美國Immuno Way公司，Toll樣受體4(TLR4)購自美國Santa Cruz公司，核因子-κB抑制蛋白(IκB-α)購自美國CST公司；二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BMECs的培養(yǎng)

BMECs復(fù)蘇后，使用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12，含10% FBS和1%雙抗)于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)，傳3～8代后用于后續(xù)試驗(yàn)[18]。

1.2.2 LPS炎性模型構(gòu)建

1.2.2.1 LPS處理液的配制

將10 mg LPS溶解于10 mL HBSS(含1%雙抗)配制1 mg/mL的LPS儲(chǔ)存液，分裝后-20 ℃儲(chǔ)存。使用時(shí)取1 mL儲(chǔ)存液溶于9 mL的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)配制100 μg/mL處理母液，再通過稀釋添加不同體積無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)進(jìn)一步配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/mL的LPS處理液，現(xiàn)用現(xiàn)配[10]。

1.2.2.2 LPS誘導(dǎo)BMECs炎癥反應(yīng)模型

將BMECs按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基200 μL，邊緣孔各加入200 μL HBSS，培養(yǎng)24 h后，更換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)培養(yǎng)12 h。隨后每列分別更換為不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/mL)的LPS處理液100 μL，繼續(xù)分別培養(yǎng)6和12 h，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)。預(yù)試驗(yàn)中，與0 μg/mL組相比，細(xì)胞活性和炎性因子水平出現(xiàn)顯著差異視為炎癥誘導(dǎo)成立[19]。

1.2.2.3 MTT檢測法

按照MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書，避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)處理4 h；取出后每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng)，搖床10 min后，用酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，美國Molecular Devices公司)在570 nm處測定吸光度。

1.2.2.4 炎性細(xì)胞因子含量檢測

按ELISA測定試劑盒說明書進(jìn)行TNF-α、IL-6、IL-1β含量檢測，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.3 MT對BMECs活性的影響

1.2.3.1 MT處理液的配制

稱取0.023 2 g MT溶解于1 mL乙醇中[10]，再將溶解于乙醇的MT樣品溶解于99 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)，配制濃度為1 mmol/L的MT儲(chǔ)存液，以10 mL為單位分裝后-20 ℃儲(chǔ)存。使用時(shí)10 mL儲(chǔ)存液1∶9稀釋于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)配制處理母液，再用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%雙抗)進(jìn)一步配制濃度分別為1、5、10、50和100 μmol/L的MT處理液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3.2 MT對BMECs活性的影響

將BMECs按1×104個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基200 μL，邊緣孔各加入200 μL HBSS，培養(yǎng)24 h后，更換DMEM/F12培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS，含1%雙抗)培養(yǎng)12 h。隨后每列分別更換為不同濃度(0、1、5、10、50和100 μmol/L)的MT處理液100 μL，繼續(xù)分別培養(yǎng)48 h。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，利用MTT法測定細(xì)胞活性。

1.2.4 MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs炎癥反應(yīng)的影響

試驗(yàn)共分為7組，對照組(C組)BMECs不進(jìn)行LPS誘導(dǎo)和MT處理，LPS組BMECs進(jìn)行LPS誘導(dǎo)12 h，LPS+MT組BMECs進(jìn)行LPS誘導(dǎo)12 h后再經(jīng)不同濃度(1、5、10、50和100 μmol/L)MT處理48 h。每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.2.5 炎性細(xì)胞因子含量檢測

按ELISA測定試劑盒說明書對各組的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)含量檢測，使用酶標(biāo)儀于450 nm處測定其吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)

使用HBSS清洗各組BMECs樣本。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中添加細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞后，將懸液移至新的做好標(biāo)記的1.5 mL離心管中放在冰上進(jìn)行充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，將樣品的上清液移入離心管中。測定蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度一致為4.0 μg/μL。隨后制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，待膠體凝后將膠板組裝于電泳槽中，倒?jié)M電泳緩沖液依次加樣20 μg/孔。隨后120 V、15 min和200 V、45 min進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后采用三明治濕轉(zhuǎn)法，用提前配制好的轉(zhuǎn)膜液進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。隨后，對膜進(jìn)行封閉和一抗、二抗孵育，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(Tanon，5200)中顯色后，使用Image J分析軟件V1.8.0分析條帶的灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 365進(jìn)行整理，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，MTT法和Western blot檢測的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)，ELISA法的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)BMECs炎癥細(xì)胞模型

預(yù)試驗(yàn)中，利用MTT法測定細(xì)胞活性和ELISA法測定TNF-α、IL-6和IL-1β含量，確定LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型的處理濃度為10 μg/mL，處理時(shí)間為12 h。

2.2 MT對BMECs活性的影響

不同濃度(1、5、10、50和100 μmol/L)的MT作用于BMECs 48 h后，采用MTT法測定細(xì)胞活性，結(jié)果如圖1所示，不同濃度的MT處理對BMECs活性無顯著影響(P>0.05)，其中1和5 μmol/L MT組BMECs活性較高。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。

2.3 MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs炎性因子含量的影響

如圖2所示，LPS誘導(dǎo)的BMECs中TNF-α、IL-6和IL-1β含量升高，其中，LPS組BMECs中IL-6和IL-1β含量顯著高于對照組(P<0.05)，LPS組BMECs中TNF-α含量與對照組差異不顯著(P>0.05)。BMECs經(jīng)MT處理48 h后，與LPS組相比，10和50 μmol/L MT組BMECs中TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，1、5、10和100 μmol/L MT組BMECs中IL-6含量顯著降低(P<0.05)，10 μmol/L MT組BMECs中IL-1β含量顯著降低(P<0.05)。綜上所述，10 μLPS組的MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs炎性因子含量升高的抑制效果最顯著。

C代表對照組；LPS代表LPS組；LPS+MT代表LPS+MT組；1、5、10、50、100分別代表1、5、10、50、100 μmol/L的MT。下圖同。

2.4 MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表達(dá)量的影響

如圖3所示，與對照組相比，LPS組BMECs中TLR4蛋白表達(dá)量有所升高(P>0.05)；與LPS組相比，不同劑量MT處理的BMECs中TLR4蛋白表達(dá)量均有所下降，其中50和100 μmol/L MT組差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，LPS組BMECs中P65蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，不同劑量MT處理的BMECs中P65蛋白表達(dá)量均有所升高，其中1和50 μmol/L MT組差異顯著(P<0.05)，10 μmol/L MT組差異極顯著(P<0.01)。與對照組相比，LPS組BMECs中P65蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，不同劑量MT處理的BMECs中IκB-α蛋白表達(dá)量均有所升高，其中1、10和50 μmol/L MT組差異顯著(P<0.05)，5 μmol/L MT組差異極顯著(P<0.01)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注*表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注**表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs炎癥反應(yīng)的影響

近年來，相繼發(fā)現(xiàn)MT的抗氧化、免疫和抗炎等生物學(xué)效應(yīng)[11-12,17]，利用MT作為抗炎藥物緩解奶牛乳房炎不失為一種可嘗試的新思路。LPS作為大腸桿菌外膜的組成成分，利用其誘導(dǎo)BMECs建立體外炎癥模型在奶牛乳房炎的防治研究中被廣泛應(yīng)用[18]。因此，本試驗(yàn)旨在探究MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs炎癥反應(yīng)的影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，MT能夠降低LPS誘導(dǎo)的BMECs中炎性細(xì)胞因子含量，抑制TLR4蛋白表達(dá)量，抑制P65蛋白表達(dá)量的降低，升高IκB-α蛋白表達(dá)量，表明本試驗(yàn)中MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs的炎癥反應(yīng)具有緩解作用。

3.2 MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs中炎性細(xì)胞因子含量的影響

研究表明，體內(nèi)細(xì)胞因子含量的變化是誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要原因[20]。TNF-α、IL-1β和IL-6作為炎性細(xì)胞因子，在體內(nèi)具有重要的信息傳遞作用[21]。它們與細(xì)胞中含有的特異性受體結(jié)合后，通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，MT進(jìn)行預(yù)處理的Caco-2細(xì)胞再經(jīng)IL-1β炎癥誘導(dǎo)時(shí)，其炎性因子IL-6含量與對照組相比有所降低，表明MT對炎癥反應(yīng)具有預(yù)防作用[22]。由于乳房炎屬于一種防治兼顧的炎癥疾病，因此本試驗(yàn)重點(diǎn)研究其對BMECs炎癥反應(yīng)的治療功效。本試驗(yàn)中測定了MT對LPS誘導(dǎo)12 h后BMECs培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS誘導(dǎo)12 h后BMECs培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高，加入MT后顯著抑制了以上炎性細(xì)胞因子含量的升高，且基于這3種炎性細(xì)胞因子的綜合抑制效果發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L MT的作用效果最佳，表明MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs炎癥反應(yīng)具有緩解作用。與本試驗(yàn)結(jié)果相似，Mishra等[23]利用高濃度乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟組織損傷后，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高，添加MT后得到有效抑制。Naveen等[24]研究發(fā)現(xiàn)，支氣管炎、鼻炎、肺纖維化及哮喘等疾病發(fā)生時(shí)，炎性細(xì)胞因子含量大幅升高，MT通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路抑制了肺部成纖維細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)，因此MT對BMECs中炎性細(xì)胞因子的抑制亦與信號(hào)通路密切相關(guān)。

3.3 MT對LPS誘導(dǎo)的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，TLR4可識(shí)別LPS并通過信號(hào)傳導(dǎo)激活核因子-κB(NF-κB)[25]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與炎癥反應(yīng)和先天性免疫應(yīng)答等細(xì)胞活動(dòng)。正常生理狀態(tài)下，NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)結(jié)合，以無活性的NF-κB/IκB復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。LPS作為一種外源性激活劑，能夠刺激IκB激酶活化，導(dǎo)致IκB發(fā)生磷酸化并被降解，引發(fā)NF-κB/IκB復(fù)合物解聚，從而使NF-κB活化并被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與特定基因的啟動(dòng)位點(diǎn)結(jié)合并調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。研究表明，MT可通過抗氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)清除過量的自由基，抑制細(xì)胞因子，從而調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[26]，MT也能夠直接調(diào)控NF-κB激發(fā)的炎癥信號(hào)通路[27]。因此，MT對于BMECs炎癥反應(yīng)的緩解作用與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，MT能夠影響LPS誘導(dǎo)的BMECs中TLR4、P65和IκB-α蛋白表達(dá)量。MT處理BMECs 48 h后，不同劑量MT均能夠抑制TLR4蛋白表達(dá)量，且50和100 μmol/L MT組差異顯著，表明MT可能通過TLR4調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。不同劑量MT均抑制了LPS引起的P65蛋白表達(dá)量的降低，使其趨于對照組的正常水平，其中10 μmol/L MT組效果最顯著。與LPS組相比，不同劑量MT對IκB-α蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)促進(jìn)效果，其中5 μmol/L MT組差異極顯著，表明MT通過促進(jìn)IκB-α蛋白的表達(dá)，使NF-κB以無活性的復(fù)合物形式存在，從而抑制NF-κB引起的炎癥反應(yīng)。Shao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，MT有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)量，P65和IκB蛋白的磷酸化水平被顯著抑制，P65和IκB蛋白表達(dá)量有所升高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述，MT通過調(diào)控TLR4、P65和IκB-α的蛋白表達(dá)參與NF-κB炎癥通路，緩解LPS誘導(dǎo)的BMECs炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

① MT能夠降低LPS誘導(dǎo)的BMECs中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，且10 μmol/L MT組作用效果最佳。

② MT能夠抑制LPS誘導(dǎo)的BMECs中TLR4蛋白表達(dá)量的升高，并對P65和IκB-α蛋白表達(dá)量具有調(diào)控作用，MT可能通過參與NF-κB炎癥通路緩解LPS誘導(dǎo)的BMECs炎癥反應(yīng)。