高文杰, 白 玉, 劉虎威

(北京大學化學與分子工程學院, 北京分子科學國家實驗室, 北京 100871)

作為生物體最重要、最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,蛋白質(zhì)糖基化在細胞間相互作用、信號轉(zhuǎn)導、免疫應答等多種生物過程中發(fā)揮了重要作用。異常的蛋白質(zhì)糖基化與許多疾病有關(guān),例如神經(jīng)退行性疾病和癌癥等[1-3]。截至目前,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的腫瘤標志物大部分是糖蛋白,例如糖抗原199(CA19-9)、前列腺特異性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)等[4-6]。此外,許多糖基化的膜蛋白、細胞外蛋白等可以用作藥物治療的靶點,例如表皮生長因子受體-2(Her 2)可作為乳腺癌治療的靶點[7]。因此,蛋白質(zhì)糖基化已經(jīng)成為一個跨化學、生物學和臨床醫(yī)學等諸多學科的交叉研究領(lǐng)域。

通常,糖蛋白質(zhì)組學分析對象主要包含糖蛋白和糖肽。在糖蛋白水平,完整糖蛋白需首先通過不同的分離手段實現(xiàn)富集,然后進行后續(xù)的分析和檢測。未知糖蛋白需經(jīng)過多肽序列測定、糖基化位點的鑒定、聚糖組成和結(jié)構(gòu)表征等。糖肽分析常見的策略是鳥槍法,即將糖蛋白酶切后對糖肽進行富集,進而利用質(zhì)譜檢測,該法已被廣泛用于基于糖蛋白組學的生物標志物的發(fā)現(xiàn)研究。然而,蛋白質(zhì)的糖基化修飾異常復雜,即使同一個糖基化位點,也可能存在不同的糖鏈修飾,即糖鏈的微觀不均一性,這一現(xiàn)象的存在使得基于質(zhì)譜法分析復雜樣品中的糖肽仍然面臨挑戰(zhàn)[8]。此外,在復雜生物樣品中,糖蛋白多為低豐度蛋白,且酶切后的糖肽只占所有酶解多肽的約2%～5%[9]。因此,在質(zhì)譜分析之前對樣品中的糖蛋白和糖肽進行富集分離十分必要。

近年來,研究人員已經(jīng)提出了多種針對糖蛋白和糖肽富集的方法,包括親水相互作用色譜法、凝集素親和色譜法、硼酸親和色譜法、酰肼化學法等[10-13]。將磁性納米材料作為磁性吸附劑用于樣品前處理的技術(shù)稱為磁性固相萃取(magnetic solid phase extraction, MSPE),已經(jīng)成為一種廣泛使用的樣品前處理技術(shù)。相比于其他的樣品前處理技術(shù),如固相萃取、液液萃取等,MSPE具有操作簡便、有機試劑使用少、萃取效率高等優(yōu)點。在磁性固相萃取技術(shù)中,磁性納米吸附劑是影響富集和選擇性的關(guān)鍵。通過在磁性納米材料表面進行修飾或者將其與其他材料進行結(jié)合,可以提高材料的物理和化學穩(wěn)定性。近年來,功能化的磁性納米復合材料在糖蛋白和糖肽的富集領(lǐng)域應用較為廣泛。

本文對近十年來基于各種功能化的磁性納米材料的糖蛋白和糖肽富集的相關(guān)研究工作進行綜述,便于相關(guān)人員更好地了解該方面的研究進展。此外,我們還對磁性納米材料在糖蛋白和糖肽富集中的前景進行了展望。

1 基于親水相互作用的磁性納米材料

糖蛋白和糖肽上的糖鏈中存在大量羥基,使得糖蛋白和糖肽相比于非糖蛋白和非糖肽具有更強的親水性,這為親水相互作用色譜法用于糖蛋白和糖肽富集奠定了基礎。親水相互作用色譜的富集機理為待測分子在親水固定相形成的富水層與高有機流動相之間發(fā)生分配,進而實現(xiàn)分離。此外,氫鍵和靜電相互作用在親水相互作用色譜中也發(fā)揮了作用。在基于親水相互作用的磁性納米材料用于糖蛋白和糖肽富集的方法中,常用作功能化的親水介質(zhì)主要包含不同類型的糖分子、親水多孔有機框架和兩性離子等。

1.1 糖分子功能化的磁性納米材料

糖分子之間的相互作用在生物體中十分常見,例如細胞膜表面配體和受體糖蛋白的相互作用。受到這一啟發(fā),不同糖分子功能化的磁性納米材料,例如,葡萄糖、羧甲基-β-環(huán)糊精、麥芽糖、殼聚糖等,已經(jīng)被廣泛用于糖蛋白和糖肽的富集[14-18]。Li等[19]利用磁納米顆粒表面的Fe3+/Fe2+可以與磷酸基團螯合的原理,將磷酸葡萄糖修飾到介孔硅包被的磁納米顆粒上。利用該材料良好的親水性和尺寸排阻能力,從健康志愿者和胃癌病人唾液中分別富集到39條和25條內(nèi)源性糖肽,在糖肽組學生物標志物發(fā)現(xiàn)方面顯示了巨大的潛力。

據(jù)報道,在磁性納米材料上接枝更多的親水官能團可以使其在應對高度復雜的生物樣品時有更好的表現(xiàn)[20]。為了增加親水分子的修飾密度,提高材料對糖肽的吸附容量,研究人員常使用樹枝狀分子或聚合分子來增加親水分子的結(jié)合位點。Bi等[21]在磁納米顆粒表面綴合了高親水和多功能基團的聚乙烯亞胺(PEI)分子,然后再結(jié)合麥芽糖官能團,制備了超親水的磁性聚合物刷,圖1為該材料合成及富集示意圖。該材料具有較大的吸附容量(200 mg/g),親水聚合物刷的存在降低了材料對非糖肽的吸附。Zhan等[22]使用PEI作為接枝分子,通過靜電自組裝將透明質(zhì)酸固定到磁性氧化石墨烯上。該材料的吸附容量達到了300 mg/g,選擇性也達到了免疫球蛋白G(IgG)∶牛血清白蛋白(BSA)=1∶1 000(物質(zhì)的量之比)的水平。

圖1 Fe3O4-PEI-pMaltose納米顆粒的制備及N-連接糖肽選擇性富集的示意圖[21]Fig. 1 Schematic illustration of the fabrication of Fe3O4-PEI-pMaltose NPs and the selective enrichment process for the N-linked glycopeptides[21]PEI: polyethyleneimine; NPs: nanoparticles; THF: tetrahydrofuran; NHS: N-hydroxysuccinimide.

1.2 親水多孔有機框架材料功能化的磁性納米材料

多孔有機框架材料,例如金屬有機框架材料(MOFs)和共價有機框架材料(COFs),由于其高孔隙率、大比表面積和結(jié)構(gòu)多樣性的特點,近來引起了研究者的廣泛關(guān)注。在樣品前處理應用中,已經(jīng)有大量研究利用親水多孔有機框架材料對磁性納米材料進行功能化,進而用于糖蛋白和糖肽的富集等[23-29]。

有機框架材料常通過外延生長或自組裝的方法修飾到磁性納米材料上,因此形成的多是核殼結(jié)構(gòu)的復合材料。Zheng等[30]通過層層自組裝的方法制備了羰基功能化的磁性鋯金屬有機框架材料?；谠摬牧系挠H水性和鋯的金屬親和色譜,作者將其用于不同尺寸外泌體中糖蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組的分析。實驗結(jié)果顯示,不同大小外泌體中包裹的蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化水平有顯著差異。

Wu等[31]合成了含3個羧基的親水單體并將其用于制備磁性親水共價有機框架材料。該材料因其優(yōu)異的親水性、大量的納米孔結(jié)構(gòu)和快速的磁響應,成功用于唾液中內(nèi)源性糖肽的富集。除了糖基化修飾,磷酸化修飾也是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,因此能夠同時實現(xiàn)兩種翻譯后修飾多肽的富集成為一些研究者的目標。Zheng等[32]制備了一種雙功能鎵離子固定磁性柱[5]芳烴超分子有機框架材料，用于同時富集糖肽和磷酸化多肽。該材料表面豐富的磺酸基使其具有強的親水性,可以用于糖肽的富集;而磷酸化多肽可以通過與Ga3+之間的螯合作用實現(xiàn)分離富集。利用該材料可從小鼠肝臟中富集到1 006條糖肽(665個糖蛋白)和1 332條磷酸化多肽(908個磷酸化蛋白)。

1.3 兩性離子功能化的磁性納米材料

兩性離子是一類帶有正電和負電基團、整體維持電中性的分子。兩性離子具有強的水化能力,通過靜電誘導水合作用,在兩性離子表面形成一層致密的水層。由于優(yōu)良的親水性和生物相容性,兩性離子功能化磁性納米材料常被用于糖肽的富集[33-36]。Ji等[37]使用簡單的一步蒸餾沉淀法制備了兩性離子[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氫氧化銨聚合物(PMSA)包被的磁性納米顆粒(Fe3O4@PMSA),并將其用于富集血清中的糖肽,可從1 μL血清中富集到158個糖蛋白中419條糖肽。

半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)作為常見的兩性離子,被廣泛地用于修飾磁性納米材料,修飾后的材料進而用于糖肽的富集[38-41]。Feng等[42]基于金屬有機配位原理通過一步法將半胱氨酸修飾到磁性納米顆粒表面。通過該簡便方法制備的磁性納米材料在富集標準糖蛋白的酶解糖肽時顯示了優(yōu)異的靈敏度(25 amol/μL)和穩(wěn)定性(室溫下放置1個月)。然而,該材料的吸附容量不甚理想,這主要歸因于功能化修飾的官能團密度不夠高。有研究者利用這兩類分子都含有巰基的特點,通過金硫鍵將其固定到金納米顆粒上,進一步提高功能基團的密度[43,44]。Liu等[45]基于金硫鍵將GSH枝接到金納米顆粒固定的磁性MOFs表面,制備了mMOF@Au@GSH。得益于GSH的親水性和UiO-66-NH2的大比表面積,該材料獲得了較大的吸附容量(140 mg/g)。

有研究證實內(nèi)源性糖肽在多種病理和生理過程中發(fā)揮重要作用。復雜生物基質(zhì)中內(nèi)源性糖肽豐度低,干擾物多,這增加了內(nèi)源性糖肽分析的難度。Wang等[46]制備了親水的磁性介孔硅納米材料用于富集人唾液中的內(nèi)源性糖肽。介孔硅的存在可以通過尺寸效應排除掉大的蛋白質(zhì)的干擾,從人唾液中共富集到40個內(nèi)源性糖肽。Luo等[47]通過合成后修飾的方法制備了GSH功能化的磁性共價有機框架材料,將其用于人唾液中內(nèi)源性糖肽的富集,可從10 μL人唾液中富集到143個內(nèi)源性糖肽。

1.4 其他

除了常用的糖分子、親水有機框架和兩性離子,離子液體和一些帶羥基、羧基等的分子(例如檸檬酸、琥珀酸、植酸、聚乙二醇等)也被用于制備磁性納米材料,進而應用于糖蛋白和糖肽的富集[48-55]。Sun等[56]設計并合成了亞氨基乙二酸功能化的磁性介孔硅納米材料。由于大量羧基的存在和介孔材料的大比表面積,該材料具有優(yōu)異的親水性。利用人血清作為復雜實際樣品,可從2 μL血清中富集到140個糖蛋白中的424條糖肽。該課題組還利用巰基和鈦之間的相互作用,合成了巰基琥珀酸修飾的磁性介孔二氧化鈦納米材料[57],成功用于糖肽和磷酸化多肽的同時富集。

除了將親水材料包被在磁性納米材料表面來制備功能化磁性納米材料以外,還可以通過將磁性納米材料生長在具有大比表面積的基底材料上,再進一步功能化修飾。Wang等[58]將親水MOFs生長到磁性石墨烯復合物上,制備了厚度可控的親水磁性納米材料。制備的復合物具有良好的檢出限(0.1 fmol/μL)和尺寸排阻性能(辣根過氧化物酶(HRP)酶解液∶BSA∶HRP=1∶500∶500,質(zhì)量比)，以及較大的吸附容量(150 mg/g)和高的回收率(大于90%)。該材料從膀胱癌患者尿液中富集到406條糖肽,對應于185個糖蛋白。

2 基于凝集素親和色譜的磁性納米材料

凝集素能夠識別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的序列,因此常被用作糖蛋白和糖肽富集的親和探針[59,60]。2010年,Hill課題組[61]開發(fā)了凝集素磁珠陣列(LeMBA)技術(shù)用于糖蛋白生物標志物的發(fā)現(xiàn)研究。該技術(shù)主要工作流程是使用不同凝集素固定的磁珠用于血清中糖蛋白的富集,對富集到的蛋白進行胰酶酶切后,用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對富集的糖蛋白進行鑒定。此后,該課題組對這一技術(shù)進行了改進和完善,并將其用于人血清和唾液中糖蛋白的富集和鑒定[62,63]。作為應用,研究者將該技術(shù)用于食管腺癌糖蛋白生物標志物的研究,并發(fā)現(xiàn)了載脂蛋白B-100、補體成分C9和凝溶膠蛋白這3種蛋白質(zhì)為可能的候選標志物[64]。

由于凝集素對于糖結(jié)構(gòu)的識別比較單一,沒有普適性,為了盡可能多的富集糖蛋白,常需要使用多種凝集素聯(lián)用的方法。圖2所示為Waniwan等[65]使用伴刀豆蛋白A(ConA)、金橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(AAL)和接骨木凝集素(SNA)3種凝集素包被的磁珠，用于富集非小細胞肺癌細胞株P(guān)C-9和其耐藥細胞株P(guān)C9-IR膜蛋白中的糖肽,分別從兩種細胞株中富集到2 290和2 767條特異性糖肽,且PC9-IR細胞株中的糖肽多是巖藻糖化和唾液酸化的糖肽。

圖2 3種凝集素包被磁珠用于糖肽富集[65]Fig. 2 Glycopeptide enrichment using magnetic particles coated with three kinds of lectins[65] ConA: concanavalin A; AAL: aleuria aurantia lectin; SNA: sambucus nigra agglutinin; MNP: magnetic particle.

3 基于硼酸化學的磁性納米材料

硼酸化學法富集糖蛋白和糖肽的原理如下:在堿性條件下,硼酸與糖鏈的順式二醇反應形成五元或六元環(huán)酯,并且在酸性條件下該反應可發(fā)生逆向移動,實現(xiàn)環(huán)酯斷裂,進而釋放富集的糖蛋白或糖肽[66]。

含有多種官能團的硼酸分子被用于磁性材料的功能化,例如4-巰基苯硼酸、氨基苯硼酸、3-醛基苯硼酸等[67-72]。Yao等[73]利用Fe和巰基間的相互作用,通過簡單的一步法反應在磁性納米顆粒表面修飾了4-巰基苯硼酸。該材料可從1 μL血清中富集到來源于93個糖蛋白的230條肽段。Sun等[74]制備了硼酸修飾的介孔二氧化鈦(TiO2)包被的磁性納米顆粒。介孔TiO2的花式結(jié)構(gòu)提供了更多的修飾位點,與光滑的二氧化硅材料包被的磁性納米材料相比,其在吸附容量上有了明顯提升。此外,4價鈦離子的強吸電子效應,使得硼酸在6.0～9.0的寬pH范圍內(nèi)對糖蛋白有較好的親和作用。

由于硼酸與順式二醇之間是弱親和作用,對于低豐度糖蛋白及糖肽的富集仍具有挑戰(zhàn)性。為了解決這一問題,Liu等[75]率先提出了多價協(xié)同結(jié)合的策略,并利用該策略合成了聚酰胺-胺型樹枝狀大分子(PAMAM)硼酸功能化的磁性納米顆粒。該材料對于糖蛋白的解離常數(shù)達到了10-5～10-6mol/L,比單硼酸親和材料的結(jié)合力提高了3～4個數(shù)量級。隨著結(jié)合能力的顯著提高,該材料不僅能夠有效富集低豐度糖蛋白,材料富集容量和糖蛋白富集速度也得到了提升。基于該策略,研究者開發(fā)并制備了多種多樣的硼酸功能化磁納米材料用于糖蛋白和糖肽的富集[76-78]。Li等[69]使用分支聚乙烯亞胺輔助制備了高硼酸密度的磁性納米顆粒,該材料對于糖肽的解離常數(shù)達到了10-6～10-7mol/L。由于其與糖蛋白的高結(jié)合能力,該材料可以富集濃度低至2×10-15mol/L的痕量蛋白質(zhì)。Xiao等[79]基于多價協(xié)同富集策略,通過優(yōu)化硼酸功能化分子,制備了高硼酸密度的功能化磁性納米材料(見圖3)。該材料可用于酵母、小鼠腦組織、細胞等樣品的大規(guī)模糖蛋白質(zhì)組分析。值得一提的是,得益于多價協(xié)同作用,該材料還可用于完整O-糖肽的富集及鑒定。

圖3 樹狀分子綴合硼酸衍生物(DBA)磁珠與糖肽協(xié)同相互作用的原理圖[79]Fig. 3 Principal of the synergistic interactions between the dendrimer-conjugated boronic acid derivative (DBA) beads and glycopeptide[79]

硼酸富集法在富集糖蛋白時需要在堿性條件下完成與蛋白質(zhì)的結(jié)合,這可能會導致脆弱糖蛋白的降解并影響富集效果,因此合成低pKa值的配體對實現(xiàn)糖蛋白質(zhì)組學深度分析十分必要[80,81]。Zhang等[82]使用低pKa的苯并氧雜硼戊環(huán)(benzoboroxole)作為配體制備了功能化的磁性核殼微球。這一納米復合材料具有非特異性吸附低、富集時間短(10 min)、磁響應性高的特點,并可以實現(xiàn)生理條件下(pH 7.4)牛血清中的糖蛋白的富集。Wu等[83]制備了3-羧基苯并氧雜硼戊環(huán)(CBX)功能化的聚乙烯亞胺修飾的磁性氧化石墨烯納米復合材料。由于CBX的pKa約為6.9,該復合材料可以在生理條件下富集糖蛋白。該材料成功應用于人血漿糖蛋白質(zhì)組分析,富集到堿性敏感的凝血酶蛋白(F2),該蛋白質(zhì)未在以前的硼酸功能化材料富集中檢測到。

4 基于酰肼化學的磁性納米材料

與硼酸親和色譜法類似,酰肼化學法富集糖蛋白和糖肽也是利用糖鏈上的多羥基結(jié)構(gòu),與之不同的是,需將糖鏈上的順式二醇氧化為醛基,醛基進一步與固定相上的酰肼反應形成腙,從而被富集。洗掉未反應的非糖肽或非糖蛋白后,利用N-糖苷酶F(PNGase F)等糖苷酶將糖肽從固定相上酶切并釋放。Zhang等[12]首次使用該方法富集人血清中糖蛋白。后來,該課題組又合成了肼功能化的磁珠,并使用微孔板結(jié)合自動處理系統(tǒng)實現(xiàn)了高通量臨床樣本的篩選[84]。目前,肼功能化磁珠已經(jīng)商品化,并被應用于糖肽定量分析、黑曲霉分泌組和完整細胞的糖基化位點分析、卵巢癌糖蛋白生物標志物等研究[85-88]。然而,肼功能化材料存在修飾密度低的問題。為了提高材料表面肼功能基團的密度,Liu等[89]合成了一種聚甲基丙烯肼(PMAH)功能化的磁性納米復合材料(Fe3O4@PMAH),圖4為其合成過程。與商品化的肼功能化樹脂相比較,該肼功能化磁性材料在富集標準糖蛋白時獲得了5倍的質(zhì)譜信噪比提升。將該材料用于結(jié)腸癌病人血清中糖肽的富集,共鑒定到來自63個糖蛋白的175條特異性糖肽。

圖4 Fe3O4@PMAH核殼磁性納米復合材料的合成過程[89]Fig. 4 Synthetic procedure for the preparation ofFe3O4@PMAH core-shell magnetic nanocomposites[89] PMAH: poly(methacrylic hydrazide); MCNCs: magnetite colloidal nanocrystal clusters; HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate.

肼化學法富集糖蛋白及糖肽具有專一性強和無位點偏向性的優(yōu)點,但也存在著諸多問題,比如需要經(jīng)多步化學反應,增加了反應時間和樣品的復雜程度;肼對糖鏈的水解和脫乙酰作用會造成糖鏈結(jié)構(gòu)的破壞,導致該方法適合糖基化位點的分析,而丟失糖鏈結(jié)構(gòu)信息。

5 結(jié)論與展望

作為一種重要的翻譯后修飾,蛋白質(zhì)糖基化已經(jīng)得到了科研人員的廣泛關(guān)注。由于糖蛋白及糖肽在復雜生物樣品及臨床樣本中的低豐度,樣品分析前進行富集成為必不可少的步驟。功能化修飾磁性納米材料具有簡便、快速和高效的特點,廣泛應用于糖蛋白和糖肽富集,該方法有力推動了糖蛋白質(zhì)組學的發(fā)展。雖然通過生物信息學估計,有超過50%的哺乳動物細胞蛋白是糖蛋白,但是現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫中注釋為糖蛋白的僅有約10%,這表明蛋白質(zhì)糖基化的研究仍然任重道遠。

對于糖蛋白質(zhì)組學分析,選擇性、回收率、覆蓋度、吸附容量和重現(xiàn)性是衡量富集材料的重要參數(shù)。而對于大規(guī)模的生物和臨床樣本來說,高通量分析方法的建立迫在眉睫。隨著材料科學的發(fā)展,新型親水材料的設計合成將為糖蛋白的鑒定和深度分析提供新的解決方案和方法。此外,新的富集策略和分析鑒定技術(shù)的進步和完善,將在基于糖蛋白質(zhì)組學疾病生物標志物的發(fā)現(xiàn)及藥物靶點的研究等方面發(fā)揮重要作用。