霍春月, 程 浩, 付 裕, 常美玲, 王 藝, 闞云超, 李丹丹

(南陽師范學(xué)院, 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南南陽 473061)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是長(zhǎng)度大于200 nt不編碼蛋白質(zhì)的一大類RNA。lncRNA依據(jù)其在基因組上的位置可分為五大類(Jarrouxetal., 2017)：反義lncRNA (Katayamaetal., 2005; Heetal., 2008; Faghihi and Wahlestedt, 2009; Weryetal., 2018)、雙向lncRNA(Hamazakietal., 2017)、增強(qiáng)子相關(guān)lncRNA (Kimetal., 2010; Wangetal., 2011; Dingetal., 2018)、基因間lncRNA(Guttmanetal., 2009; Cabilietal., 2011; Ulitskyetal., 2011; Ulitsky and Bartel, 2013)和假基因lncRNA (Balakirev and Ayala, 2003; Pinketal., 2011; Tutar, 2012)。lncRNA能夠在表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控基因表達(dá)，參與生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、分化等過程(Engreitzetal., 2016b; Kim and Shiekhattar, 2016; Robinsonetal., 2020)，如:改變DNA甲基化、組蛋白修飾狀態(tài)(Akhadeetal., 2017; Dykes and Emanueli, 2017),作為酶的輔因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，與編碼蛋白質(zhì)的mRNA形成雙鏈雜交體干預(yù)mRNA的剪切，參與調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性(Engreitzetal., 2016a)，作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA (competing endogenous RNAs, ceRNA)與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA，作為小分子RNA的前體(Tayetal., 2014)等。最近研究表明，一些lncRNA能夠編碼小肽，表明它們可能兼具肽編碼能力和非編碼RNA功能(Rohrigetal., 2002; Andersonetal., 2015; Nelsonetal., 2016; Legninietal., 2017; Matsumotoetal., 2017; Razookyetal., 2017; Linetal., 2020; Wuetal., 2020; 趙念念等, 2020)。

家蠶Bombyxmori是鱗翅目的模式昆蟲，絲腺作為重要的產(chǎn)絲場(chǎng)所，在其經(jīng)濟(jì)價(jià)值實(shí)現(xiàn)中具有重要作用。蠶絲蛋白由絲素和絲膠兩種成分組成，絲素在后部絲腺合成，編碼絲素蛋白的基因主要有Fib-L,Fib-H和P25；絲膠在中部絲腺分泌，編碼絲膠蛋白的基因主要有Ser1,Ser2和Ser3 3種 (Yamaguchietal., 1989; Inoueetal., 2000; Asakuraetal., 2007)。宋菲等(2014)發(fā)現(xiàn)miR-2739對(duì)絲素重鏈基因Fib-H的表達(dá)具有調(diào)控作用；Huang等(2011)發(fā)現(xiàn)miR-2b與P25基因在表達(dá)上存在著相反的關(guān)系，可能調(diào)控P25基因的表達(dá)。另外Qian等(2018, 2020)發(fā)現(xiàn)miR-2780a和miR-275能夠特異性存在于中部絲腺中，靶向調(diào)控絲膠蛋白基因Ser1和Ser2的表達(dá)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA作為一種重要的調(diào)控因子，在家蠶變態(tài)發(fā)育及抗病毒過程中發(fā)揮重要作用，目前在家蠶中已發(fā)現(xiàn)10 000余條lncRNA序列(Wuetal., 2016; Zhouetal., 2016, 2018; Dykes and Emanueli, 2017; Yinetal., 2020)。來源于家蠶性別決定基因dsx反義鏈上的lncRNA Bmdsx-AS1能夠參與dsx基因的選擇性剪接(Xuetal., 2019)。感染核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus, NPV)后，家蠶中4 450個(gè)lncRNAs出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)2 837個(gè)和下調(diào)表達(dá)1 613個(gè)，表明lncRNA參與了家蠶病毒感染過程(Yinetal., 2020)。另外，lncRNA可作為miRNA的ceRNA發(fā)揮調(diào)控作用，Wu等(2016)從家蠶基因組中獲得11 810個(gè)lncRNA，其中104個(gè)lncRNA具有內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA的潛力，可能作為ceRNA發(fā)揮作用。

在前期研究中我們構(gòu)建了家蠶4齡眠和5齡第3天幼蟲絲腺非編碼RNA文庫，發(fā)現(xiàn)了大量lncRNA在這兩個(gè)齡期的絲腺中存在顯著差異表達(dá)，其中在5齡第3天幼蟲絲腺中高表達(dá)的一個(gè)lncRNA BmlncR2036位于絲素基因P25上游，可能參與P25基因的調(diào)控。為進(jìn)一步探索BmlncR2036在家蠶絲腺及變態(tài)發(fā)育中的功能，本研究對(duì)其在家蠶幼蟲不同組織和不同發(fā)育階段絲腺中的表達(dá)譜進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)BmlncR2036作為ceRNA的功能和參與P25基因啟動(dòng)子調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，最后在家蠶個(gè)體中干涉BmlncR2036表達(dá)，對(duì)其參與家蠶絲腺及中腸發(fā)育調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步研究lncRNA功能提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

家蠶品系為大造P50，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所李木旺研究員惠贈(zèng)。

1.2 家蠶飼養(yǎng)及取樣

家蠶飼養(yǎng)在溫度25℃，相對(duì)濕度60%，光周期12L∶12D，用新鮮桑葉飼養(yǎng)。取5齡第3天家蠶幼蟲，解剖后收集體壁、腦、神經(jīng)、精巢、卵巢、絲腺、馬氏管、血淋巴、脂肪體和中腸10種組織，分別置于液氮中速凍保存。取4齡第3天幼蟲、4齡眠和5齡第1-2天幼蟲，解剖后取整個(gè)絲腺速凍于液氮中；取5齡第3-5天幼蟲及5齡熟蠶解剖蟲體，將絲腺分為前絲腺、中絲腺和后絲腺3個(gè)部分，分別置于液氮中速凍保存。

1.3 qPCR檢測(cè)BmlncR2036的表達(dá)譜

在前期構(gòu)建的家蠶4齡眠和5齡第3天絲腺非編碼RNA文庫中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)高表達(dá)的lncRNA BmlncRNA2036位于P25上游9.47 kb的互補(bǔ)鏈上，轉(zhuǎn)錄方向與P25相反(王立方, 2015)。BmlncR2036及P25基因表達(dá)譜檢測(cè)同楊宗霖等(2019)方法：將1.2節(jié)各樣品用TRIzol法提取總RNA，取總RNA 2 μg使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA第1鏈?；趦?nèi)參基因actin, BmlncR2036及P25基因序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)體系: cDNA 0.5 μL, 上下游引物終濃度為0.5 μmol/L, FastStart Universal SYBR Green Mix (Roche) 5 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性30 s, 5℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)。所用引物及miRNA模擬物見表1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3次，每個(gè)樣品技術(shù)重復(fù)3次。

1.4 靶向P25基因和BmlncR2036的miRNA預(yù)測(cè)

使用miRanda(Enrightetal., 2003)和RNAhybrid(Rehmsmeieretal., 2004)軟件預(yù)測(cè)能夠同時(shí)靶向P25基因和BmlncR2036的miRNA。

1.5 熒光素酶檢測(cè)法檢測(cè)miRNA與P25基因的體外互作

P25基因3′UTR熒光素酶報(bào)告基因載體psiCHECK-2[P25]構(gòu)建同楊宗霖等(2019)。以家蠶5齡幼蟲后絲腺RNA為模板，使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)合成cDNA第1鏈，擴(kuò)增P25基因3′UTR 413 bp序列，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA 1 μL, 上下游引物終濃度為0.5 μmol/L, Premix Ex TaqTMHot Start Version (TaKaRa) 10 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 30個(gè)循環(huán)。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Axygen)回收目的條帶，連接pMD19-T Simple載體(TaKaRa)。轉(zhuǎn)化后，菌液PCR檢測(cè)連接效果，送菌液至蘇州泓迅生物科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的菌液提質(zhì)粒，用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后連接到psiCHECK-2熒光素酶報(bào)告基因載體(Promega)上。經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè)、測(cè)序等步驟確定載體是否構(gòu)建成功。測(cè)序正確的菌液重新?lián)u菌，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)提取質(zhì)粒。

基于miR-2739和miR-279a成熟miRNA序列設(shè)計(jì)引物，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miRNA mimics和陰性對(duì)照(NC)，引物序列見表1。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶測(cè)定方法同楊宗霖等(2019)。人胚胎腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞(由衡陽師范學(xué)院唐青海博士惠贈(zèng))在含有10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(Biological Industry)中培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)，溫度37℃，CO2濃度5%。按每孔2×105個(gè)細(xì)胞鋪24孔板，使用X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(Roche)轉(zhuǎn)染miRNA mimics和P25基因熒光素酶報(bào)告基因載體。miRNA mimics轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/孔，P25基因熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度為100 ng/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組：無任何處理的HEK293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]空載體；共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]與miR-2739 mimics；共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]與NC mimics；共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]與miR-279amimics。每組設(shè)樣品重復(fù)3個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染48 h后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取20 μL細(xì)胞裂解液按照雙熒光素檢測(cè)試劑盒Steady-Glo? Luciferase Assay System(Promega)步驟，檢測(cè)樣品熒光值。P25基因位于Firefly熒光素酶基因下游，因此用獲得的Firefly熒光素酶活性(F)/內(nèi)參Renilla熒光素酶活性(R)，獲得每組3個(gè)樣品及3個(gè)重復(fù)的R/F值，均一化后用Excel軟件進(jìn)行作圖(楊宗霖等, 2019)。

1.6 P25基因啟動(dòng)子活性檢測(cè)

BmlncR2036位于P25基因上游，那么其可能通過影響P25基因啟動(dòng)子活性參與P25基因表達(dá)調(diào)控。取家蠶5齡熟蠶后絲腺，用DNAzol(MRC)提取基因組DNA，參照Nony等(1995)方法，使用表1引物擴(kuò)增P25基因上游1 251 bp序列，構(gòu)建P25基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因載體。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.5節(jié)，目的條帶回收，連接pMD19-T Simple載體，測(cè)序，測(cè)序正確的菌液提質(zhì)粒，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后連接在pGL3-Enhancer載體(Promega)上，構(gòu)建P25基因啟動(dòng)子載體pGL3-Enhancer[P25-promoter]，經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè)、測(cè)序等步驟確定載體是否構(gòu)建成功。測(cè)序正確的菌液重新?lián)u菌，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)提取質(zhì)粒備用。

取家蠶5齡熟蠶后絲腺RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，使用表1引物擴(kuò)增BmlncR2036基因全長(zhǎng)704 bp序列。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.5節(jié)，目的條帶回收，連接pMD19-T Simple載體，測(cè)序，測(cè)序正確的菌液提質(zhì)粒，用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接在pcDNA3.1(+)載體(Promega)上構(gòu)建BmlncR2036過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]，經(jīng)轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè)、測(cè)序等步驟確定載體是否構(gòu)建成功。測(cè)序正確的菌液重新?lián)u菌，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)提取質(zhì)粒備用。

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板同1.5節(jié)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置2組：共轉(zhuǎn)染pGL3-Enhancer [P25-promoter]和pcDNA3.1(+)空載體組；共轉(zhuǎn)染pGL3-Enhancer [P25-promoter]和pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]組。每組設(shè)樣品重復(fù)3個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染48 h后，取100 μL細(xì)胞，按照Steady-Glo? Luciferase Assay System (Promega)步驟檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，檢測(cè)BmlncR2036對(duì)P25基因啟動(dòng)子活性的影響，P25基因啟動(dòng)子連接在螢火蟲熒光素酶基因上游，因此比較獲得的每組3個(gè)樣品及3個(gè)重復(fù)的Firefly熒光素酶活性(F)，均一化后用Excel軟件進(jìn)行比較作圖。

1.7 RNAi干涉BmlncR2036

取家蠶5齡熟蠶后絲腺RNA，使用表1帶有T7啟動(dòng)子的引物擴(kuò)增BmlncR2036基因351 bp片段，PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA 1 μL, 上下游引物終濃度為0.5 μmol/L, Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0, TaKaRa) 10 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30個(gè)循環(huán)。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Axygen)純化目的片段，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)轉(zhuǎn)錄合成dsRNA，體系(20 μL)：帶T7啟動(dòng)子的BmlncR2036基因PCR產(chǎn)物0.5～1 μg, 2×T7 Buffer 10 μL, Enzyme Mix 2 μL。37℃反應(yīng)30 min，70℃ 10 min，室溫20 min使反轉(zhuǎn)錄的RNA形成雙鏈。DNase (Thermo Fisher) 37℃ 30 min去除模板DNA。體外轉(zhuǎn)錄dsRNA用等體積的異丙醇進(jìn)行濃縮純化。陰性對(duì)照為EGFP基因，以piggyBac[EGFP]載體為模板擴(kuò)增攜帶有T7啟動(dòng)子的EGFP基因，其dsRNA合成方法同上。

選擇家蠶5齡第3天幼蟲，利用顯微注射針將dsRNA沿背部血淋巴注射入家蠶體內(nèi)，每頭注射5 μg，每個(gè)基因注射3組，每組5頭。48 h后取家蠶個(gè)體，解剖蟲體，除去腸道內(nèi)容物，將蟲體分為絲腺和非絲腺兩部分，液氮研磨，TRIzol法提取RNA，qPCR檢測(cè)dsRNA干涉效果。qPCR檢測(cè)同楊宗霖等(2019)方法：分別取注射BmlncR2036和EGFPdsRNA的絲腺或非絲腺樣品總RNA 2 μg，使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA第1鏈。內(nèi)參基因?yàn)閍ctin。PCR反應(yīng)體系(10 μL): cDNA 0.5 μL, 上下游引物終濃度為0.5 μmol/L, FastStart Universal SYBR Green Mix (Roche) 5 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)。所用引物見表1。qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)置生物學(xué)重復(fù)3次，每樣品技術(shù)重復(fù)3次。未取樣幼蟲飼養(yǎng)至羽化，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)緩慢或形態(tài)異常幼蟲，解剖蟲體，觀察RNAi處理后家蠶絲腺及中腸形態(tài)及內(nèi)容物的變化。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析同楊宗霖等(2019)方法。PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量高低，Ct為循環(huán)閾值，表示每一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt=目的基因的平均Ct值-內(nèi)參基因的平均Ct值，ΔΔCt=ΔCt處理樣本-ΔCt對(duì)照樣本。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)3次，每樣品測(cè)定技術(shù)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立生物學(xué)實(shí)驗(yàn)平均值分析結(jié)果。數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)檢測(cè)不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 BmlncR2036在家蠶幼蟲不同組織及不同發(fā)育階段絲腺中的表達(dá)譜

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明BmlncR2036在家蠶5齡第3天幼蟲和5齡熟蠶的后絲腺中高表達(dá)(圖1: B)，與P25基因在后絲腺高表達(dá)(Zhongetal., 2005; Maetal., 2013)呈現(xiàn)較一致的表達(dá)趨勢(shì)。BmlncR2036在家蠶5齡第3天幼蟲不同組織中的表達(dá)譜表明，BmlncR2036除在精巢和中腸中高表達(dá)外，在其他組織中表達(dá)量較低(圖1: A)，表明lncRNA BmlncR2036可能具有多樣化的功能。

圖1 qPCR檢測(cè)BmlncR2036在家蠶5齡幼蟲不同組織(A)和不同齡期絲腺(B)中的表達(dá)譜Fig. 1 Expression profiles of BmlncR2036 in different tissues of the 5th instar larvae (A) and silk glandsat different developmental stages (B) of Bombyx mori by qPCR3d 4L: 4齡第3天幼蟲Day-3 4th instar larva; 4th M: 4齡眠4th instar molting larva; 1-5d 5L: 分別為5齡第1-5天幼蟲Day-1-5 5th instar larvae, respectively; AS: 前絲腺Anterior silk gland; MS: 中絲腺M(fèi)iddle silk gland; PS: 后絲腺Posterior silk gland; 5th M: 5齡熟蠶Mature 5th instar larva. 4齡第3天、4齡眠和5齡第1-2天幼蟲取整個(gè)絲腺。The whole silk gland was sampled from the day-3 4th instar larvae, 4th instar molting larvae and day-1-2 5th instar larvae. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Data in the figure are mean±SE.

2.2 靶向P25基因和BmlncR2036的miRNA

預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在靶向P25基因的miRNA中，能與BmlncRNA2036匹配的主要有miR-2739和miR-279a。為進(jìn)一步驗(yàn)證P25基因與兩個(gè)miRNA是否存在互作，我們利用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)體外驗(yàn)證二者的互作。首先構(gòu)建靶標(biāo)基因P25 3′UTR區(qū)熒光素酶報(bào)告基因過表達(dá)載體psiCHECK-2[P25]，P25 3′UTR擴(kuò)增結(jié)果如圖2(A)所示，PCR產(chǎn)物電泳條帶單一(條帶1)，413 bp位置正確。psiCHECK-2[P25]雙酶切結(jié)果為條帶2，能夠酶切出正確的P25 3′UTR條帶，測(cè)序結(jié)果正確。共轉(zhuǎn)染miR-2739和miR-279a模擬物和P25 3′UTR過表達(dá)載體psiCHECK-2[P25]后，細(xì)胞熒光素酶活性與NC相比無顯著變化 (圖2: B)，表明P25不是miR-2739和miR-279a的真實(shí)靶標(biāo)。

圖2 熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)體外驗(yàn)證P25基因與miRNAs的互作Fig. 2 Verification of the interaction between P25 gene and miRNAs by luciferase assay in vitroA: P25 3′UTR PCR擴(kuò)增結(jié)果及psiCHECK-2[P25]酶切結(jié)果PCR amplification result of P25 3′UTR and the double digestion result of psiCHECK-2[P25]; M: DL2000 marker; 1: P25 3′UTR擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of the 3′UTR of P25 gene; 2: 載體psiCHECK-2[P25]雙酶切結(jié)果Double digestion result of psiCHECK-2[P25] vector. B: HEK293細(xì)胞系中熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-2739和miR-279a與靶基因P25的互作Verification of interaction between target gene P25 and miR-2739 and miR-279a by luciferase assay in HEK293 cells; 1: 無任何處理的HEK293細(xì)胞對(duì)照The normal HEK293 cells as the control; 2: 轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]載體Transfected with psiCHECK-2[P25]; 3: 共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]+miR-2739 mimics Cotransfected with psiCHECK-2[P25] and miR-2739 mimics; 4: 共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]+NC mimics Cotransfected with psiCHECK-2[P25] and NC mimics; 5: 共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2[P25]+miR-279a mimics Cotransfected with psiCHECK-2[P25] and miR-279a mimics. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Data in the figure are mean±SE.

2.3 BmlncR2036對(duì)P25啟動(dòng)子活性的影響

P25啟動(dòng)子序列和BmlncR2036擴(kuò)增結(jié)果如圖3(A)所示，PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，位置正確。pGL3-Enhancer [P25-promoter]和pcDNA3.1(+) [BmlncR2036]雙酶切結(jié)果如圖3(B)，能夠酶切出正確的P25啟動(dòng)子條帶和BmlncR2036全長(zhǎng)，測(cè)序結(jié)果正確。在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pGL3-Enhancer [P25-promoter]和pcDNA3.1(+) [BmlncR2036]后，細(xì)胞中BmlncR2036實(shí)現(xiàn)顯著過表達(dá)(圖3: C)。細(xì)胞熒光素酶活性比單獨(dú)轉(zhuǎn)染pGL3-Enhancer [P25-promoter]細(xì)胞的下降了52% (圖3: D)，達(dá)極顯著水平(P<0.01)，表明BmlncR2036對(duì)P25啟動(dòng)子區(qū)存在負(fù)調(diào)控作用。

圖3 BmlncR2036和P25啟動(dòng)子互作結(jié)果Fig. 3 Interaction result of BmlncR2036 and the promoter of P25A: P25啟動(dòng)子和BmlncR2036全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR result of P25 promoter and the full-length of BmlncR2036; M: DL2000 marker; 1: P25 啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of the promoter of P25 gene; 2: BmlncR2036全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of the full-length of BmlncR2036. 箭頭示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Arrows show PCR products. B: 載體pGL3-Enhancer [P25-promoter]和pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]雙酶切鑒定Double digestion of vectors pGL3-Enhancer [P25-promoter] and pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]; M: DL2000 marker; 1: pGL3-Enhancer [P25-promoter]雙酶切產(chǎn)物Double digestion product of pGL3-Enhancer [P25-promoter]; 2: pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]雙酶切產(chǎn)物Double digestion product of pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]. 箭頭分別示酶切獲得的P25啟動(dòng)子序列 1 251 bp和BmlncR2036 704 bp全長(zhǎng)序列Arrows show the digested 1 251 bp P25 promoter sequence and 704 bp BmlncR2036 full-length sequence, respectively. C: HEK293細(xì)胞系中BmlncR2036過表達(dá)結(jié)果Overexpression result of BmlncR2036 in HEK293 cells; D: HEK293細(xì)胞系中熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BmlncR2036對(duì)P25基因啟動(dòng)子活性影響 Verification of the effect of BmlncR2036 on the promoter activity of P25 by detection of the luciferase activity in HEK293 cells; 1: 轉(zhuǎn)染pGL3-Enhancer [P25-promoter]載體和pcDNA3.1(+)空載體Transfected with vector pGL3-Enhancer [P25-promoter] and blank vector pcDNA3.1(+); 2: 轉(zhuǎn)染載體pGL3-Enhancer [P25-promoter]和pcDNA3.1(+)[BmlncR2036] Transfected with vectors pGL3-Enhancer [P25-promoter] and pcDNA3.1(+)[BmlncR2036]. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上雙星號(hào)表示差異極顯著(P<0.01, 單因素方差分析， t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Double asterisk above bars represents extremely significant difference (P<0.01, one-way ANOVA, t-test). 下同The same below.

2.4 RNAi干涉家蠶幼蟲中BmlncR2036表達(dá)

在家蠶5齡第3天幼蟲血淋巴中注射BmlncR2036 dsRNA發(fā)現(xiàn)，48 h后BmlncR2036在非絲腺組織中的表達(dá)量下降了84%，絲腺組織中表達(dá)量無明顯變化(圖4: A)。注射BmlncRNA2036 dsRNA的家蠶個(gè)體發(fā)育遲緩，上簇后體色變暗，后逐漸死亡(圖4: B)，解剖后發(fā)現(xiàn)，中腸有大量?jī)?nèi)容物殘留，馬氏管顏色發(fā)白，但絲腺無明顯異常(圖4: C)，表明BmlncR2036可能在家蠶中腸發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖4 家蠶5齡幼蟲中通過RNAi敲低BmlncR2036表達(dá)后的結(jié)果Fig. 4 Result of knocking down the expression of BmlncR2036 in the 5th instar larvae of Bombyx mori by RNAiA: 注射dsRNA后不同組織中BmlncR2036表達(dá)結(jié)果 Expression result of BmlncR2036 in different tissues after dsRNA injection; B: 注射BmlncR2036 dsRNA后家蠶表型Phenotype of B. mori after dsRNA injection of BmlncR2036; C: 注射BmlncR2036 dsRNA后家蠶解剖結(jié)果Dissection result of B. mori after injection of BmlncR2036 dsRNA. 1: 注射EGFP dsRNA的對(duì)照Injection of EGFP as the control; 2: 注射BmlncR2036 dsRNA Injection of BmlncR2036 dsRNA.

3 討論

我們?cè)谇捌谘芯恐袕募倚Q幼蟲絲腺中鑒定到大量新的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，并對(duì)其在絲腺發(fā)育過程的表達(dá)譜進(jìn)行了研究(王立方, 2015)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)在絲素P25基因上游存在的lncRNA BmlncR2036在家蠶后絲腺中高表達(dá)。BmlncR2036在幼蟲的后絲腺中高表達(dá)(圖1: B)，已知P25基因也在幼蟲尤其是5齡幼蟲后絲腺中富集(Zhongetal., 2005; Maetal., 2013)，表明其可能作為P25的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA發(fā)揮作用。通過分析其作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)miRNA發(fā)現(xiàn)，同時(shí)靶向BmlncR2036和P25基因的miRNAmiR-2739和miR-279a并不能在體外與P25基因產(chǎn)生互作(圖2: B)，表明BmlncR2036可能不是通過作為miR-2739和miR-279a這兩個(gè)miRNA的ceRNA對(duì)P25發(fā)揮作用，即miR-2739和miR-279a可能有其他靶標(biāo)，而P25也有可能存在其他BmlncR2036起ceRNA作用的miRNA分子，具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

分析BmlncR2036對(duì)P25基因啟動(dòng)子活性影響發(fā)現(xiàn)，BmlncR2036對(duì)P25基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄存在負(fù)調(diào)控(圖3: C, D)?；蛏舷掠未嬖跒閿?shù)眾多的lncRNA，包括增強(qiáng)子RNA，啟動(dòng)子相關(guān)lncRNA，上游反義鏈RNA，啟動(dòng)子上游lncRNA，端粒重復(fù)區(qū)lncRNA等(St Laurentetal., 2015)。Wang等(2015)在骨骼肌成肌細(xì)胞中鑒定出一個(gè)位于發(fā)育多能性相關(guān)基因2 (developmental pluripotency-associated 2,Dppa2)上游的發(fā)育多能性相關(guān)基因2上游肌相關(guān)lncRNA (developmental pluripotency-associated 2 upstream binding muscle lncRNA， lncRNA-Dum)，該lncRNA能夠順式募集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1), DNMT3A和DNMT3B等至Dppa2基因的啟動(dòng)子區(qū)，并造成該區(qū)域甲基化沉默，從而抑制Dppa2的表達(dá)，造成骨骼肌成肌細(xì)胞向肌細(xì)胞分化。BmlncR2036是位于P25基因上游的lncRNA，其是否具有類似的機(jī)制，還需進(jìn)一步垂釣?zāi)軌蚺cBmlncR2036結(jié)合的蛋白，判斷其是否通過募集蛋白至P25基因的啟動(dòng)子區(qū)從而參與P25基因的表達(dá)調(diào)控。因此對(duì)BmlncR2036功能的探索還需更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

個(gè)體中RNAi干涉BmlncR2036表達(dá)(圖4: B, C)，發(fā)現(xiàn)家蠶發(fā)育受阻，中腸內(nèi)容物滯留，最后產(chǎn)生死亡現(xiàn)象，表明BmlncR2036可能具有除調(diào)控P25基因外多樣化的功能，其可能參與家蠶中腸的發(fā)育調(diào)控。本研究從ceRNA和調(diào)控啟動(dòng)子活性兩個(gè)角度探索了BmlncR2036參與家蠶發(fā)育的可能機(jī)制，為研究lncRNA的調(diào)控機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但對(duì)BmlncR2036詳細(xì)的功能探索還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。