郭 靜 張浩潤(rùn) 王 銳 趙靜靜 付夢(mèng)軍

1 濱州醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003； 2 濰坊眼科醫(yī)院 山東 濰坊 261000

已有很多學(xué)者對(duì)角膜基質(zhì)透鏡移植進(jìn)行了多方面的探索和研究[1-2]，從冰凍狀態(tài)下儀器打磨的同種異體角膜透鏡、角膜基質(zhì)環(huán)植入，到水凝膠材料的人工角膜透鏡植入等，但因制作程序復(fù)雜及材料的穩(wěn)定性差等因素，使得透鏡移植臨床的應(yīng)用很少。近年來，飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(femtosecond small incision lenticule extraction，SMILE)的廣泛開展為角膜基質(zhì)透鏡植入手術(shù)的開展提供了有利條件。將SMILE手術(shù)中取出的角膜基質(zhì)透鏡進(jìn)行保存和再利用，充分發(fā)揮了角膜組織的潛在利用價(jià)值，不但可以增加角膜的厚度，還可以起到加固角膜生物力學(xué)的作用。應(yīng)用角膜基質(zhì)透鏡治療的常見疾病有：遠(yuǎn)視、角膜淺層病變、感染性角膜病引起的角膜厚度變薄或穿孔，圓錐角膜和角膜膨隆等[3-5]。但目前角膜基質(zhì)透鏡移植后在角膜厚度和屈光度的矯正方面變化仍存在不確定性因素，本研究應(yīng)用飛秒激光輔助行兔眼的角膜基質(zhì)透鏡移植觀察3個(gè)月，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6只新西蘭大白兔，購(gòu)自青島人和順實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，體質(zhì)量為2～2.5 kg，月齡為4～5月。所有的動(dòng)物均遵循《ARVO眼科和視覺研究中動(dòng)物的使用聲明》的準(zhǔn)則，本研究得到了濰坊眼科醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的支持。

1.2 手術(shù)方法 術(shù)前給予兔子耳緣靜脈注射丙泊酚麻醉(3 mg/kg，起效后10 min追加初始量的1/3)后置于VisuMax全飛秒激光手術(shù)床上(Carl Zeiss Meditec，Jena，Germany)。所有兔子均采用“S”號(hào)負(fù)壓錐鏡，選擇快速掃描模式：激光頻率為500 kHz，點(diǎn)間距為4.5 μm，線間距2.0 μm，能量設(shè)置為135 nj。每只兔子均用飛秒激光行左眼SMILE手術(shù)，角膜帽厚度為120 μm，角膜帽直徑為7.5 mm，透鏡直徑為6.5 mm，輸入矯正的屈光度為-5.00 D，透鏡基底下加厚度為10 μm，透鏡中央厚度為87 μm，邊切角為90°，邊切口長(zhǎng)度為2 mm。激光掃描完成后，去除負(fù)壓吸引，分離角膜邊切口，依次分離透鏡前、后表面，最后將透鏡從邊切口取出，隨即放入無菌平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)中備用。每只兔子右眼均應(yīng)用飛秒激光FLAP程序制作角膜基質(zhì)囊袋，角膜瓣厚度為120 μm，角膜瓣直徑為7.8 mm，邊切角度為90°，角膜蒂的位置為0°，角膜蒂的角度為300°。激光掃描完成后，分離角膜瓣，將浸泡在無菌BBS液里的透鏡平鋪于囊袋中，調(diào)整居中位，復(fù)位角膜瓣，配戴角膜繃帶鏡，手術(shù)結(jié)束。所有手術(shù)均由同一位技術(shù)熟練的醫(yī)生完成。

1.3 術(shù)后處理和觀察 所有兔子術(shù)畢行裂隙燈顯微鏡檢查，無異常后滴1滴妥布霉素地塞米松滴眼液(典必舒，美國(guó)Alcon公司)。術(shù)后第1天起滴左氧氟沙星滴眼液(可樂必妥，日本參天制藥)4次/天，用藥1周；氯替潑諾混懸滴眼液(露達(dá)舒，Bausch & Lomb Incorporated)4次/天，每周減量1次，用藥1個(gè)月。

所有的兔子在術(shù)前、術(shù)后1天、術(shù)后1周、術(shù)后1月、術(shù)后2個(gè)月、術(shù)后3個(gè)月行裂隙燈顯微鏡檢查、電腦驗(yàn)光、眼前段照相 (Topcon,Tokyo，Japan)、Pentacam(Oculus Optikger?te GmbH，Wetzlar，Germany)、前節(jié)OCT(AS-OCT，Visante，Carl Zeiss Meditec AG，Jena，Germany)和角膜共焦激光顯微(Heidelberg Engineering GmbH，Heidelberg，Germany)檢查。電腦驗(yàn)光、Pentacam的每次測(cè)量均由同一技術(shù)人員重復(fù)測(cè)量3次以上，中央角膜厚度、等效球鏡、平均角膜曲率均取其多次測(cè)量的平均值作為每次測(cè)量的結(jié)果。術(shù)后3個(gè)月檢查完畢后，采用空氣栓塞法(50 mL空氣耳緣靜脈注射)處死兔子，隨即行眼球摘除術(shù)，分離兔角膜，用40 g/L多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，行光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般情況 術(shù)后1天角膜上皮可見干燥斑，角膜輕度水腫，透鏡居中，透鏡輪廓清晰，無皺褶及移位。術(shù)后1周基質(zhì)水腫較前減輕，角膜上皮光滑，透鏡居中。術(shù)后1月水腫完全消退，角膜透明，透鏡平復(fù)在位。術(shù)后2、3月復(fù)診，角膜透明，角膜基質(zhì)透鏡植入輪廓欠清(圖1)。

A、B見角膜透明；C、D見術(shù)后1天角膜上皮可見干燥斑，角膜輕度水腫，透鏡居中，透鏡輪廓清晰，無皺褶及移位；E、F見術(shù)后1周角膜基質(zhì)水腫較前減輕，角膜上皮光滑，透鏡居中；G、H見術(shù)后1月水腫完全消退，角膜透明，透鏡平復(fù)在位；I、J為術(shù)后2個(gè)月，K、L為術(shù)后3個(gè)月，均見角膜透明，角膜基質(zhì)透鏡植入輪廓欠清。

2.2 中央角膜厚度 透鏡植入術(shù)前中央角膜厚度為(357.17±12.97)μm，術(shù)后1周、1月、3月分別為(433.67±12.19)μm、(423.50±13.49)μm、(417.33±12.08)μm，較術(shù)前分別增加了(76.50±16.22)μm、(66.33±4.08)μm、(60.17±11.07)μm。整體比較術(shù)前術(shù)后，P<0.001，術(shù)后1周、1月、3月分別于術(shù)前相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兩兩對(duì)比差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 透鏡植入手術(shù)前后各時(shí)間點(diǎn)CCT、等效球鏡、角膜前后表面Km值變化

2.3 等效球鏡和平均角膜曲率 等效球鏡的計(jì)算公式為球鏡度加上柱鏡度的1/2。術(shù)前等效球鏡為(0.57±1.13)D，術(shù)后1周、1月、3月的等效球鏡分別為(-1.98±1.18)D、(-2.65±0.47)D、(-1.84±0.68)D，術(shù)后1周、術(shù)后1月、2月、3月分別與術(shù)前相比球鏡的差值為(-2.52±1.35)D、(-3.22±1.31)D、(-2.42±0.69)D。整體比較術(shù)前術(shù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，術(shù)后1周、1月、3月分別與術(shù)前相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

Km為角膜地形圖上的平均角膜曲率。術(shù)前前表面Km為(47.80±1.02)D，術(shù)后1周、1月、3月分別(53.85±0.99)D、(52.67±1.32)D、(52.53±0.96)D，術(shù)后1周、1月、3月分別與術(shù)前相比前表面Km增加了(6.05±1.09)D、(4.87±1.69)D、(4.73±1.00)D，術(shù)前術(shù)后整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，表1)。

術(shù)前后表面Km為(-6.18±0.15)D，術(shù)后1周、1月、3月分別為(-5.78±0.19)D、(-5.73±0.20)D、(-5.50±0.14)D，術(shù)后1周、1月、3月分別與術(shù)前相比后表面Km的差值為(0.40±0.11)D、(0.45±0.14)D、(0.68±0.15)D，術(shù)前術(shù)后整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兩兩相比差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，表1)。

A、B、C、D分別為術(shù)前、透鏡植入術(shù)后1周、術(shù)后1月和術(shù)后3月的兔眼的角膜地形圖。

2.4 眼前節(jié)OCT檢查 術(shù)后1天，角膜基質(zhì)水腫，可以清晰觀察到透鏡的前后界面。透鏡植入術(shù)后1周、1月角膜水腫較前減輕，仍可以觀察到透鏡的前后界面和透鏡的邊緣。透鏡植入術(shù)后2月和3月，角膜透明，可隱約觀察到透鏡的后界面(圖3，圖中紅色箭頭所示部位)。

A.術(shù)前眼前節(jié)OCT圖像；B. 術(shù)后1天圖像，見角膜基質(zhì)輕度水腫，可以清晰觀察到透鏡的前后界面；C、D分別為術(shù)后1周、1月圖像，見角膜水腫較前減輕，仍可以觀察到透鏡的前后界面和透鏡邊緣；E、F分別為術(shù)后2月、3月圖像，見角膜透明，隱約觀察到透鏡的后界面。

2.5 角膜共焦激光顯微鏡檢查 透鏡植入術(shù)后1周透鏡界面可見高反光顆粒，大小不一；術(shù)后1月角膜細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)小神經(jīng)纖維開始長(zhǎng)入；術(shù)后2月角膜細(xì)胞形態(tài)接近正常，神經(jīng)纖維可見粗大分支；術(shù)后3月角膜細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量基本正常，神經(jīng)纖維可見細(xì)小分支(圖4)。

A. 術(shù)前兔眼的角膜共焦激光顯微鏡下的圖像，見角膜細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，神經(jīng)纖維排列整齊；B. 透鏡植入術(shù)后1周角膜圖像，見透鏡界面高反光顆粒，大小不一；C. 術(shù)后1月角膜圖像，見角膜細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)小神經(jīng)纖維開始長(zhǎng)入；D. 術(shù)后2月角膜圖像，見角膜細(xì)胞形態(tài)接近正常，神經(jīng)纖維可見粗大分支；E. 術(shù)后3月角膜圖像，見角膜細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量基本正常，可見細(xì)小神經(jīng)纖維分支。

2.6 HE染色 術(shù)后3個(gè)月，HE染色見角膜結(jié)構(gòu)完整，移植的透鏡在位，可觀察到透鏡的前后界面，纖維排列整齊，平行分布，結(jié)構(gòu)清晰，與周邊組織融合未見縫隙(圖5)。

A. 可觀察到透鏡的前后界面，結(jié)構(gòu)清晰，與周邊組織融合未見縫隙(×40)；B. 透鏡移植的界面可見正常角膜細(xì)胞，形態(tài)規(guī)則(×400)。

3 討論

角膜基質(zhì)透鏡移植可以從組織結(jié)構(gòu)和功能上對(duì)角膜基質(zhì)進(jìn)行重建，可同時(shí)解決角膜基質(zhì)病變和改善屈光狀態(tài)。SMILE手術(shù)的開展為角膜基質(zhì)透鏡植入手術(shù)的開展提供了條件。飛秒激光可精準(zhǔn)地進(jìn)行角膜透鏡切削，使取出的透鏡的大小和厚度都是均勻一致的。由于角膜的基質(zhì)囊袋內(nèi)無血管及淋巴組織，且囊袋內(nèi)為無菌環(huán)境，不接觸淚液及房水，因此，透鏡植入術(shù)后位置居中，術(shù)后短期內(nèi)就可以水腫消退，角膜透明，且發(fā)生角膜移植片排斥及角膜感染的概率微乎其微，使得基質(zhì)透鏡移植可以有效的開展[6-7]。

飛秒激光輔助的角膜基質(zhì)透鏡移植術(shù)，因角膜基質(zhì)透鏡和基質(zhì)囊袋均由飛秒激光來完成，精確度高，無需縫合，極大降低了由縫線引起的醫(yī)源性的散光和縫線誘導(dǎo)的排斥反應(yīng)，手術(shù)感染的風(fēng)險(xiǎn)小，組織損傷小，術(shù)后恢復(fù)快。已經(jīng)有前期的研究證明全飛秒角膜透鏡植入的安全性、穩(wěn)定性及有效性[8-12]。Ganesh[11]等的研究中應(yīng)用透鏡移植治療遠(yuǎn)視和無晶體眼，角膜基質(zhì)植入透鏡輪廓清晰，無皺褶、透鏡溶解及移位，取得滿意的臨床效果。Pradhan[10]等將從高度近視患者術(shù)眼中取出的角膜基質(zhì)透鏡植入到另一遠(yuǎn)視患者的角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)，由于角膜前、后表面的變化及角膜的重塑，屈光度僅為矯正的屈光度的一半。因受到臨床病例數(shù)量和疾病種類的限制，透鏡移植可以矯正的屈光度目前尚沒有非?？煽康膮⒖紭?biāo)準(zhǔn)。在兔眼的透鏡移植手術(shù)中，-3.00 D透鏡植入組，兔眼的屈光度由(3.40±0.63)D變化為(-4.10±2.67)D，-6.00 D透鏡植入組中，兔眼的屈光度由(1.20±1.00)D變化為(-9.80±1.44) D，-8.00 D透鏡植入組中，兔眼的屈光度由(1.85±0.68)D變化為(-10.60±1.85)D[13]。在我們的研究中，我們植入的透鏡的屈光度為-5.00 D，術(shù)后3月時(shí)，矯正的屈光度為(-2.42±0.69)D，角膜前表面Km的變化量為(4.73±1.00)D，角膜后表面Km的變化量為(0.68±0.15)D。本研究認(rèn)為，透鏡移植對(duì)屈光度的改變需要有兩個(gè)方面的關(guān)注，一是角膜前、后表面曲率的變化，二是角膜上皮厚度的重塑，就像遠(yuǎn)視術(shù)后的回退和圓錐角膜的發(fā)生是一個(gè)相似的病理變化過程。

以往矯正遠(yuǎn)視的辦法有很多，例如鞏膜延伸術(shù)、角膜周邊切開術(shù)、自動(dòng)板層角膜熱成形術(shù)等，由于這些手術(shù)方式對(duì)眼睛的損傷大，預(yù)測(cè)性差，治療效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，被臨床淘汰，直到出現(xiàn)了PRK及LASIK術(shù)，應(yīng)用準(zhǔn)分子激光在角膜上皮下磨鑲角膜的周邊部，使得中央角膜曲率變陡，中央角膜屈光度增加來達(dá)到治療遠(yuǎn)視的目的。由于被動(dòng)的行成角膜中央的高曲率，其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性也會(huì)有一定程度的下降，存在一定程度的回退現(xiàn)象[14-15]。遠(yuǎn)視的治療一般限制在6.00 D內(nèi)，遠(yuǎn)視術(shù)后角膜中央曲率應(yīng)控制在46.5 D內(nèi)，否則造成醫(yī)院性的角膜膨隆[9]。在本研究中，應(yīng)用飛秒激光在角膜表面制作一個(gè)囊袋，將同體角膜基質(zhì)透鏡從一眼取出，植入到另一眼的角膜基質(zhì)囊袋中，一方面增加角膜中央厚度，另一方面改變角膜中央曲率，增加了角膜中央的屈光度，起到了治療遠(yuǎn)視的效果。周躍華等[9]應(yīng)用角膜透鏡植入治療遠(yuǎn)視，97.3%的患者好于或等于術(shù)前最佳矯正視力，且裸眼視力大幅度提高的同時(shí)，患者的近視力也得到了很好的改善，屈光度1個(gè)月就達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。張晶[8]用全飛秒激光基質(zhì)透鏡治療中高度遠(yuǎn)視1年的觀察，術(shù)后裸眼遠(yuǎn)視力、裸眼近視力、最佳矯正視力較前有明顯提高，術(shù)后3月至1年，未見明顯的遠(yuǎn)視屈光度的回退現(xiàn)象，說明透鏡移植術(shù)后屈光度穩(wěn)定。也有學(xué)者應(yīng)用透鏡移植治療遠(yuǎn)視眼，在1年的隨訪中，證明了他的安全性、有效性和穩(wěn)定性[4,16]。透鏡移植矯正遠(yuǎn)視的原理是增加了角膜的厚度，主動(dòng)增加了角膜中央的屈光力，改變了角膜的曲率，回退的概率小，臨床效果好。但透鏡植入手術(shù)不是簡(jiǎn)單的透鏡的疊加，涉及物理學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)等相關(guān)的變化，還需要更多的研究，更大的樣本量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察。

角膜基質(zhì)透鏡移植在老花、圓錐角膜及LASIK術(shù)后角膜膨隆的治療中有較好的安全性和有效性[17]。在透鏡移植聯(lián)合角膜交聯(lián)治療圓錐角膜3年的隨訪中，角膜厚度增加，角膜穩(wěn)定，CDVA顯著提升[18]。有學(xué)者應(yīng)用透鏡移植聯(lián)合PTK治療角膜營(yíng)養(yǎng)不良，用于角膜表層透鏡術(shù)，在短期的隨訪觀察中安全有效[3]。兔子的透鏡移植實(shí)驗(yàn)中顯示透鏡移植后角膜厚度顯著增加，其中-3.00 D透鏡移植組角膜厚度從(353±22)μm增加到(397±29)μm，-6.00 D組角膜厚度從(375±16)μm增加到(457±38)μm，-8.00 D組角膜厚度從(367±17)μm增加到(464±27)μm[13]透鏡移植術(shù)后2個(gè)月，將兔眼角膜石蠟切片后觀察見-3.00和-6.00植入組，透鏡的前后表面已經(jīng)不清晰，-8.00 D植入組透鏡的邊緣依然清晰。本研究認(rèn)為移植術(shù)后角膜的修復(fù)與透鏡的厚度有關(guān)。角膜基質(zhì)透鏡移植后移植的透鏡可與受體角膜組織融合，透鏡移植術(shù)后的角膜厚度小于單純疊加的厚度。共焦激光纖維鏡觀察見透鏡移植術(shù)后，透鏡的前后表面可見高反光信號(hào)，考慮與手術(shù)碎屑和膠原反應(yīng)有關(guān)系[13]。透鏡移植術(shù)后早期可見透鏡周圍組織水腫，細(xì)胞活躍。透鏡移植術(shù)后第10天仍有水腫。術(shù)后1月,水腫消退，活化細(xì)胞逐漸形成靜息，觀察神經(jīng)纖維再生[19]。3個(gè)月時(shí)，透鏡體與受體角膜融合，細(xì)胞外基質(zhì)逐漸清除可見較厚的神經(jīng)纖維。透鏡植入3年的結(jié)果顯示其臨床的有效性和穩(wěn)定性。在本研究中，透鏡移植術(shù)后3個(gè)月，角膜透明，前節(jié)OCT隱約觀察到透鏡的后界面，共焦激光顯微鏡見角膜細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量基本正常，可見細(xì)小神經(jīng)纖維分支。

可見透鏡移植有非常多的潛在價(jià)值，因角膜基質(zhì)透鏡組織來源于活體，來源豐富，可改善目前角膜材料短缺及其他手術(shù)引起的并發(fā)癥等問題。應(yīng)用飛秒激光在角膜表面制作一個(gè)角膜小切口，未形成角膜瓣，對(duì)角膜生物力學(xué)影響較小，且神經(jīng)損傷少，能有效的避免術(shù)后干眼的發(fā)生。但角膜基質(zhì)內(nèi)透鏡植入術(shù)作為一種新的手術(shù)方式，仍存在一些問題和不足之處，需要更長(zhǎng)時(shí)間和更多樣本的觀察研究。