朱雯婷，陳亦清，劉曉敏，洪曄，袁中文，劉圣曜（.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部，廣州5050；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，廣州 50260）

卵巢癌是一種高死亡率的婦科腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女的健康。目前卵巢癌的一線化療藥物主要有紫杉醇（paclitaxel，PTX）和順鉑，這些藥物具有較好的抗腫瘤活性，但是對正常組織有一定的毒副作用，且易產(chǎn)生耐藥[1]。因此，聯(lián)合其他藥物治療卵巢癌可能是一種新的有效手段。

褪黑素（melatonin，Mel）是一種主要由松果體產(chǎn)生的激素，可用于治療多種疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、病毒感染等[2-3]。褪黑素對于乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等具有細(xì)胞毒作用，特別是對激素依賴性腫瘤具有重要作用[4-5]。可能與其作用多種信號通路相關(guān)，例如Akt/mTOR 通路，增加活性氧的產(chǎn)生，線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)等[6-7]。新的研究表明，褪黑素聯(lián)合化療藥物可以增強藥物抗腫瘤效果[8]。但褪黑素是否能增強紫杉醇對卵巢癌的化療效果至今未見報道。因此，探討褪黑素聯(lián)合紫杉醇體內(nèi)外治療卵巢癌的作用有重要的臨床意義。

1 材料

褪黑素（純度＞95%，MB1475）、紫杉醇（MB1178）（大連美侖生物技術(shù)公司）。Bax 抗體（50599-2-lg）、Bcl-2（12789-1-AP）兔抗人單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），Ki-67 兔抗人單克隆抗體（ab16667，Abcam 公司）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗人單克隆抗體（AB-P-R001，杭州賢致生物），辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（CW0103，康為世紀(jì)公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1062M）、Hoechst 33258 染色液（C1017）、BCA 試劑盒（P0012S）（上海碧云天生物科技有限公司）。

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 細(xì)胞（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院）用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 ～8周雌性BALB/c 裸鼠20 只，體質(zhì)量18 ～20 g[珠海百試通生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（粵）2020-0051]。

倒置熒光顯微鏡（TE2000-S）、正置熒光顯微鏡（Ni-u）（日本尼康公司），活細(xì)胞顯微激光掃描成像系統(tǒng)（A1，日本尼康公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Model 680），流式細(xì)胞儀（Thermo Fisher，Life Science）。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖和形態(tài)觀察

用不同濃度的紫杉醇或褪黑素聯(lián)合紫杉醇作用于SKOV3 細(xì)胞，處理48 h 后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并通過噻唑藍（MTT）法檢測細(xì)胞存活率，在490 nm 波長處測定吸光度值。

通過細(xì)胞克隆實驗檢測褪黑素聯(lián)合紫杉醇對SKOV3 細(xì)胞增殖的影響，SKOV3 細(xì)胞接種于6 孔板中，密度為1×103個/孔。實驗分成4 組，分別為空白組，褪黑素（200 μg·mL－1）組，紫杉醇（20 μg·mL－1）組，褪黑素（200 μg·mL－1）聯(lián)合紫杉醇（20 μg·mL－1）處理組，每孔藥液量為2 mL。7 d 后，用結(jié)晶紫對形成的集落進行染色并定量。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測

用流式細(xì)胞儀和Hochest 33258 染色檢測藥物對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響。將1×104個/孔SKOV3 細(xì)胞接種于6 孔板中（Hochest 33258 染色實驗取潔凈蓋玻片置于6 孔板），分別用單獨的褪黑素（200 μg·mL－1）、紫杉醇（20 μg·mL－1）或兩藥聯(lián)合處理48 h。

流式檢測細(xì)胞凋亡實驗參考細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進行如下操作：48 h 后將細(xì)胞消化并離心收集，用PBS 洗滌細(xì)胞兩遍，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻，室溫孵育20 min 后，上機進行檢測。

Hoechst 33258 染色實驗進行如下操作：在6孔板中加入0.5 mL 的固定液固定10 min，用PBS洗3 遍，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液染色5 min，再用PBS 洗3 遍，每次3 min，在載玻片上滴一滴抗熒光淬滅封片液，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，用活細(xì)胞顯微激光掃描成像系統(tǒng)進行觀察。

2.3 蛋白質(zhì)印跡分析

藥物處理后的SKOV3 細(xì)胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解30 min 提取蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。上樣后用SDS-PAGE 膠分離、轉(zhuǎn)膜。使用5%的牛奶進行封閉，用不同一抗4℃孵育過夜（GAPDH，稀釋比例1∶2000，Bax 稀釋比例1∶1000，Bcl-2 稀釋比例1∶1000），TBST洗滌3 次，然后在室溫下孵育HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 的二抗（稀釋比例1∶5000），最后在PVDF 膜上滴加Ecl 發(fā)光液（Millipore，USA）用凝膠成像系統(tǒng)進行顯影。

2.4 體內(nèi)抗腫瘤作用

在BALB/c 裸鼠右背部皮下注射100 μL SKOV3 細(xì)胞懸液（5×106個）和100 μL 基質(zhì)膠混合液。約10 d 后，當(dāng)腫瘤體積大于100 mm3時，將裸鼠隨機分為4 組，分別接受生理鹽水，褪黑素（25 mg·kg－1），紫杉醇（20 mg·kg－1），褪黑素與紫杉醇聯(lián)合腹腔注射給藥。每兩日給藥一次，并測量腫瘤的體積，腫瘤體積的計算公式＝長×寬2/2，給藥6 次后，處死裸鼠收集腫瘤組織稱重，并拍照。

將石蠟包埋的腫瘤切片脫蠟至水，蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）觀察腫瘤組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)。染色后，在正置熒光顯微鏡隨機取不同的視野拍照。

2.5 免疫組化

腫瘤切片脫蠟至水，用pH 6.0 的檸檬酸緩沖液在90℃熱修復(fù)30 min，冷卻至室溫，參考兔/鼠通用型Streptavidin-HRP 試劑盒（CW2069，康為世紀(jì)）說明書步驟如下：切片用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育10 min，PBS 充分洗滌，羊血清室溫孵育10 min，甩干后用一抗（Ki-67 稀釋比例1∶200）4℃下孵育過夜，PBS 洗3 遍，每次3 min。然后在室溫下與生物素標(biāo)記羊抗兔/鼠二抗工作液孵育10 min，再滴加適量HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育10 min，最后，加適量的二氨基聯(lián)苯胺（Dia minobenzidine，DAB）顯色工作液染色3 min。脫水透明封片在正置熒光顯微鏡，隨機取3 個視野進行拍照。

2.6 TUNEL 熒光法染色

腫瘤石蠟切片脫蠟至水。參考原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）一步法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（KGA7071，凱基生物）說明書步驟如下：用Proteinase K 工作液在37℃反應(yīng)30 min，PBS 漂洗3 次。放入濕盒中，每張切片滴加配制好的TdT 酶反應(yīng)液，37℃處理45 min，再用PBS 漂洗3 次。每個樣本上滴加 50 μL Streptavidin-FITC 標(biāo)記液，37℃避光反應(yīng) 30 min，最后用含DAPI 染色液的抗熒光淬滅封片，在活細(xì)胞顯微激光掃描成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞凋亡。

2.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對SKOV3 細(xì)胞的增殖的抑制作用

褪黑素聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的毒性結(jié)果，如圖1A 所示，用200 μg·mL－1的褪黑素處理SKOV3 細(xì)胞48 h，細(xì)胞形態(tài)正常，而褪黑素與20 μg·mL－1紫杉醇聯(lián)合處理48 h 后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，且細(xì)胞數(shù)量顯著減少。紫杉醇對細(xì)胞的毒性具有濃度依賴性，通過SPSS 軟件非線性回歸擬合計算得出，紫杉醇作用48 h 的IC50為28 μg·mL－1，而用200 μg·mL－1褪黑素聯(lián)合不同濃度的紫杉醇會增加對SKOV3 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，IC50降為13.46 μg·mL－1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖1C）。

細(xì)胞克隆實驗驗證褪黑素聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1B 所示。與紫杉醇單藥處理組相比，褪黑素聯(lián)合紫杉醇處理組能明顯減少人卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的克隆集落數(shù)，計算每組克隆集落數(shù)，如圖1D 所示，褪黑素聯(lián)合紫杉醇組克隆集落數(shù)顯著低于褪黑素單藥組（P＜0.001），紫杉醇單藥組（P＜0.05），說明兩藥聯(lián)合能更好地抑制SKOV3 細(xì)胞增殖。

圖1 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effect of melatonin combined with paclitaxel on proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells

3.2 褪黑素聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡作用

褪黑素和紫杉醇對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見圖2。圖2A 顯示空白未處理組的凋亡率僅為（3.19±0.43）%，褪黑素處理48 h 后，凋亡率為（5.36±0.90）%，紫杉醇組的凋亡率為（14.99±1.41）%，褪黑素和紫杉醇聯(lián)合使用時的細(xì)胞凋亡率約為（26.5±2.12）%，與單藥物組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2C，P＜0.01，P＜0.001）。此外，Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示，在兩藥聯(lián)合藥物處理組中，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的固縮，或呈碎塊狀，說明兩藥聯(lián)合能明顯增加細(xì)胞的凋亡。Bax 和Bcl-2是凋亡途徑中的重要蛋白，如圖2D 所示，褪黑素和紫杉醇聯(lián)合處理組中Bcl-2/Bax 的比例與空白組和單藥處理組相比明顯更低。

圖2 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effect of melatonin combined with paclitaxel on apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells

3.3 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對移植瘤的抑制作用

SKOV3 移植瘤裸鼠模型觀察褪黑素聯(lián)合紫杉醇的體內(nèi)抗腫瘤作用。圖3A 腫瘤的生長曲線的結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合組的腫瘤生長緩慢，顯示出較強的抗腫瘤效果。與單藥組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖3B 是給藥結(jié)束后每組取出的腫瘤組織的代表圖，紫杉醇組的腫瘤體積小于生理鹽水組，而兩藥聯(lián)合組的體積明顯小于紫杉醇組。將各組的腫瘤組織取出來進行稱重，瘤重結(jié)果如圖3C 所示，褪黑素聯(lián)合紫杉醇組的質(zhì)量小于褪黑素組單藥組[（0.148±0.02 g）vs（0.717±0.06）g，P＜0.001]和紫杉醇單藥組[（0.148±0.02 g）vs（0.308±0.07）g，P＜0.01]。圖3D 中腫瘤組織的HE 染色結(jié)果表明，生理鹽水組中的腫瘤細(xì)胞成簇生長，并且結(jié)構(gòu)緊湊且正常，褪黑素和紫杉醇單藥組顯示局部缺血和缺氧壞死，而聯(lián)合治療組的缺血性壞死部分更大。

圖3 褪黑素聯(lián)合紫杉醇在SKOV3 移植瘤模型中的抗腫瘤作用Fig 3 Anti tumor effect of melatonin combined with paclitaxel on SKOV3 xenograft tumor model

3.4 褪黑素聯(lián)合紫杉醇對移植瘤Ki-67 與瘤組織細(xì)胞凋亡的影響

藥物對荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞增殖情況的影響如圖4A 所示。生理鹽水組腫瘤組織Ki-67 的表達水平最高（81.6±6.8）%，紫杉醇治療組Ki-67 表達下降，而褪黑素聯(lián)合紫杉醇組Ki67 陽性細(xì)胞數(shù)（20.3±4.5）%明顯低于褪黑素單藥組（60.3±7.1）%（P＜0.001）和紫杉醇單藥處理組（31.0±2.6）%（P＜0.05）（見圖4B），表明兩藥聯(lián)合對細(xì)胞增殖的抑制作用強于單藥治療組。

圖4 Ki-67 染色檢測褪黑素聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 移植瘤模型細(xì)胞增殖的影響（40×）Fig 4 Effect of melatonin combined with paclitaxel on the proliferation of SKOV3 cells detected by Ki-67 staining（40×）

TUNEL 染色檢測藥物作用后對裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響。如圖5所示，生理鹽水組和褪黑素組幾乎沒有綠色熒光點的存在，而紫杉醇組和褪黑素聯(lián)合紫杉醇治療組綠色熒光明顯增多，且兩藥聯(lián)合組的熒光明顯強于紫杉醇單藥治療組，表明褪黑素的加入可以明顯增強紫杉醇引起的細(xì)胞凋亡。

圖5 TUNEL 染色檢測褪黑素聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌SKOV3 移植瘤模型細(xì)胞凋亡的影響（20×）Fig 5 Effect of melatonin combined with paclitaxel on the proliferation of SKOV3 cells detected by TUNEL staining（20×）

4 討論

褪黑素在多種癌癥具有顯著的抑制作用。褪黑素可抑制腫瘤有氧糖酵解、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞信號通路，并克服了腫瘤的多藥耐藥[9-11]。例如，褪黑素可通過降低組蛋白脫乙?；? 的表達來抑制非小細(xì)胞肺癌的生長并促進細(xì)胞凋亡[12]；通過下調(diào)ZNF746 調(diào)節(jié)的MMP-9/MMP-2 通路來抑制膀胱癌的增殖、遷移和侵襲[13]。

實驗表明在聯(lián)合給藥組中SKOV3 卵巢癌細(xì)胞的增殖被顯著抑制，Ki-67 的陽性率低于單藥組。因此，可以推斷兩種藥物的聯(lián)合可以起到抑制腫瘤增殖的協(xié)同作用。此外，聯(lián)合給藥可顯著誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡。Bcl-2 是一種膜蛋白，主要位于線粒體的外膜上，誘導(dǎo)caspase-3/-9的釋放。該家族中的蛋白表現(xiàn)出促凋亡或抗凋亡活性，其中Bcl-2/Bax 比值可作為確定細(xì)胞凋亡易感性的標(biāo)志物[14]。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素聯(lián)合紫杉醇通過在體外下調(diào)Bcl-2/Bax 比值來誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)TUNEL 染色結(jié)果進一步說明褪黑素增強了紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞的促凋亡作用。

研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素和化療藥物的聯(lián)合不僅能極大地增強藥物對腫瘤細(xì)胞的療效，而且可以降低化療的副作用[15]。例如，化學(xué)療法引起的神經(jīng)性疼痛是癌癥治療中常見的毒副作用，褪黑素作為一種有效抗氧化劑可通過降低氧化應(yīng)激，減少由化療藥物紫杉醇引起的線粒體損傷和神經(jīng)性疼痛[16]。綜上所述，褪黑素一種安全有效的化療增敏劑，與紫杉醇的聯(lián)合療法具有良好的臨床應(yīng)用前景。