顧 凡，晏 恒，趙存朝，2，劉俐彤，陶 亮，2 ，田 洋，2，3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開(kāi)發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

百香果（Passiflora edulisSims）是西番蓮科西番蓮屬的草質(zhì)藤本植物，又稱(chēng)為雞蛋果、西番蓮、巴西果、情人果等[1]，在我國(guó)廣泛種植于云南、廣西、海南等地。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，百香果中含有大量生物活性成分，如黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)[2]等，具有抗炎[3]、抗氧化[4]、降糖[5]、抗焦慮[6]和抗衰老[7]等功效。百香果汁顏色為金黃色，香味濃郁，含有17種氨基酸、維生素、微量元素等160多種有益成分[8-12]。國(guó)內(nèi)對(duì)百香果果酒研究較多，有直接發(fā)酵釀造的百香果果酒[13-15]，有百香果和其他果蔬復(fù)配釀造的果酒[16-19]，有百香果和辣木提取物[20-21]、蕎麥[22]、靈芝[23]釀造的果酒，但通過(guò)百香果和葡萄混釀的果酒鮮有報(bào)道。

葡萄為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，富含蛋白質(zhì)、糖、有機(jī)酸、維生素及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，成熟后的葡萄糖酸比平均在40左右，具有高糖低酸的特性[24]，特別適合加工果酒，葡萄酒工藝成熟具有極高的生物價(jià)值，深受?chē)?guó)內(nèi)外的喜愛(ài)和熟知，是熱銷(xiāo)的產(chǎn)品。

百香果果汁含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且清香味濃郁，但酸度較高，影響了百香果酒的開(kāi)發(fā)。將葡萄加以混釀，中和口感，緩解百香果汁的酸味，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，解決了人為添加甜味劑造成的感官品質(zhì)下降，同時(shí)形成了獨(dú)特的果香味葡萄酒。百香果作為云南省部分地區(qū)的重點(diǎn)扶貧項(xiàng)目，產(chǎn)量、產(chǎn)值逐年擴(kuò)大，開(kāi)發(fā)葡萄百香果酒產(chǎn)品對(duì)拉動(dòng)云南省經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)、提高百香果利用價(jià)值、減少鮮果積壓浪費(fèi)具有重要意義。本研究立足云南葡萄和百香果的產(chǎn)量、質(zhì)量?jī)?yōu)勢(shì)，通過(guò)復(fù)合菌種發(fā)酵，開(kāi)發(fā)出一款具有葡萄、百香果果味、酸甜適中、口感清爽的風(fēng)味果酒，為生產(chǎn)高品質(zhì)的果酒提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)云南水果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有一定的推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果、葡萄：市售；混合菌種（葡萄酒活性干酵母∶耐高溫活性干酵母=1∶1）：安琪酵母有限責(zé)任公司；纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）：湖南新鴻鷹生物工程有限公司；碳酸鈣（食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WZB數(shù)顯折光儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；PHS-3CW數(shù)顯pH計(jì)：杭州德為儀器有限公司；M277465酒精測(cè)量?jī)x：河北青縣儀器有限公司；SC-60分光光度計(jì)：廣東冰天制冷設(shè)備有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：常州億通分析儀器有限公司；HPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；WT20002電子天平：杭州萬(wàn)特衡器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄百香果酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

原料處理：將成熟百香果和葡萄清洗，葡萄榨汁100目紗布過(guò)濾，百香果去皮取果肉與水按質(zhì)量比1∶1混合打漿。

酶解：添加0.1%的果膠酶和纖維素酶，45 ℃酶解2 h。

過(guò)濾：100目紗布過(guò)濾后與葡萄汁混合均勻。

加料：添加蔗糖調(diào)整混合汁初始糖度，碳酸鈣調(diào)節(jié)適合酵母發(fā)酵的酸度，pH值至3.5左右為宜。

殺菌：調(diào)整混合汁基質(zhì)中SO2含量至50 mg/kg。

活化酵母：混合菌種于10倍溫水中，35 ℃水浴鍋活化0.5 h后添加0.4%至果汁混合液中。

發(fā)酵：在一定溫度條件下的恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵一定時(shí)間。

離心、陳釀：發(fā)酵后的果酒4 000 r/min離心15 min，在15 ℃條件下陳釀10 d。

1.3.2 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)研究果汁比例（葡萄汁與百香果汁體積比）（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、初始糖度（21°Bx、22°Bx、23°Bx、24°Bx、25°Bx）、發(fā)酵溫度（21 ℃、22 ℃、23 ℃、24 ℃、25 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對(duì)葡萄百香果酒感官評(píng)分和酒精度的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)對(duì)葡萄百香果酒工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝及配方。二次通用旋轉(zhuǎn)組合分析因素和水平見(jiàn)表1。

表1 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的因素與水平Table1 Factors and levels of second universal rotating combination experiments for grape-passion fruit wine brewing process optimization

1.3.3 測(cè)定方法

葡萄百香果酒感官評(píng)定：邀請(qǐng)10名專(zhuān)業(yè)人士從外觀、滋味、香氣、典型性四個(gè)方面參照GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求，建立百香果葡萄復(fù)合果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，滿(mǎn)分100分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 葡萄百香果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards of grape-passion fruit wine

酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》方法測(cè)定；總酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定；糖度：手持糖度儀測(cè)定；總糖含量：按照二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測(cè)定；pH值：使用pH計(jì)測(cè)定；細(xì)菌菌落數(shù)：按照平板計(jì)數(shù)法測(cè)定；大腸菌群：按照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中MPN計(jì)數(shù)法執(zhí)行；沙門(mén)氏菌：按照GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》方法測(cè)定；金黃色葡萄球菌：按照GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》方法測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2.16對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，Origin 8.5繪圖，SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 果汁配比對(duì)葡萄百香果酒酒精度和感官評(píng)分的影響

由圖1可知，隨著百香果汁比例的增加，葡萄百香果酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在葡萄汁∶百香果汁配比為1∶3（V/V）達(dá)到最高，感官評(píng)分為（92.6±1.6）分。此時(shí)，產(chǎn)品百香果味濃郁、葡萄的后甘味純正，感官品質(zhì)最佳，隨著百香果汁添加比例的增加，百香果的味道掩蓋了葡萄風(fēng)味，果酒偏酸，后味寡淡。不同果汁配比條件下，酒精度呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，且后期趨于平穩(wěn)，可能是因?yàn)榧尤氚傧愎泻邪被?、維生素、微量元素給酵母增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致酒精度升高。綜合比較分析最終選擇葡萄汁與百香果汁配比為1∶3（V/V）。

圖1 果汁配比對(duì)葡萄百香果酒的酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of juice ratio on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.1.2 不同初始糖度對(duì)葡萄百香果酒酒精度及感官評(píng)分的影響

由圖2可知，隨著初始糖度的升高，葡萄百香果酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在初始糖度為23°Bx時(shí)，葡萄百香果酒感官評(píng)分最高為91分。隨著初始糖度的繼續(xù)升高，感官評(píng)分降低，這是由于初始糖度的升高，導(dǎo)致發(fā)酵體系的滲透壓增加，一定程度抑制了酵母發(fā)酵能力，造成其發(fā)酵變慢，產(chǎn)品甜度過(guò)高，果酒口味寡淡，這與曹麗娟等[25]的研究結(jié)果一致。葡萄百香果酒酒精度隨初始糖度的升高的變化趨勢(shì)與感官評(píng)分類(lèi)似，初始糖度為24°Bx時(shí)，酒精度最高為12.5%vol，初始糖度為23°Bx時(shí)，酒精度為12.3%vol，與初始糖度為24°Bx時(shí)相差不大。因此綜合考慮感官評(píng)分和酒精度，確定最佳的初始糖度為23°Bx。

圖2 不同初始糖度對(duì)葡萄百香果酒的酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of different initial sugar contents on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)葡萄百香果酒酒精度及感官評(píng)分的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，葡萄百香果酒感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度23 ℃時(shí)感官評(píng)分達(dá)到最高為（93.2±1.4）分，此溫度條件下葡萄百香果酒符合果酒標(biāo)準(zhǔn)，口感柔順，具備獨(dú)特的果酒風(fēng)味。酒精度隨發(fā)酵溫度變化，也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度24 ℃時(shí)，酒精度達(dá)最高為12.3%vol，可能是由于隨著溫度的升高達(dá)到酵母的最適發(fā)酵溫度，乙醇產(chǎn)量增加。趨勢(shì)下降可能是由于溫度繼續(xù)升高，酵母生長(zhǎng)旺盛，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于自身生長(zhǎng)分化，乙醇產(chǎn)量減少[26]。所以綜合考慮感官評(píng)分和酒精度，最終選擇發(fā)酵溫度為23 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度對(duì)葡萄百香果酒的酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.1.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)葡萄百香果酒酒精度及感官評(píng)分的影響

由圖4可知，感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，第7天時(shí)達(dá)到最高為（89.4±1.5）分，上升趨勢(shì)是由于酵母菌逐漸發(fā)酵達(dá)到最適時(shí)間，形成最佳的果酒風(fēng)味，下降趨勢(shì)可能是由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)代謝產(chǎn)物CO2增多，溶于果酒導(dǎo)致偏酸，感官評(píng)分下降，這與王登宇等[27]研究結(jié)果一致。酒精度隨時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出先上升后基本不變的趨勢(shì)，第7天酒精度為12.3%vol，上升趨勢(shì)可能由于酵母菌繁殖旺盛，發(fā)酵速率較快，酒精度不斷增加。穩(wěn)定趨勢(shì)可能是由于發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，酵母菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，產(chǎn)酒能力達(dá)到最大值，酒精度不再增加，與菌種先增長(zhǎng)后趨于穩(wěn)定的生長(zhǎng)曲線的趨勢(shì)相呼應(yīng)[28]，這與程宏楨等[26]的研究結(jié)果類(lèi)似。所以綜合果酒的感官評(píng)分和酒精度，選擇發(fā)酵時(shí)間為7 d。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)葡萄百香果酒的酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.2 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

2.2.1 二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗(yàn)

通過(guò)DPS7.05軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并得到以感官評(píng)分為目標(biāo)的二次回歸模型方程：

表3 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of second universal rotating combination experiments for grape-passion fruit wine brewing process optimization

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

由表4可知，F(xiàn)1=2.088 96＜F0.05（5，5）=5.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小。對(duì)回歸模型進(jìn)行擬合檢驗(yàn)F2=7.724 72＞F0.05（9，10）=3.13，達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合良好，預(yù)測(cè)值跟實(shí)際值吻合相當(dāng)好，能反映感官評(píng)分與果汁比例、發(fā)酵溫度、初始糖度的關(guān)系。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)X2，交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均未達(dá)到顯著水平，但二次項(xiàng)系數(shù)具有相關(guān)性，因此在這些微弱的交互項(xiàng)原則上不能刪除。在a=0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)簡(jiǎn)化后的回歸方程：

表4 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table4 Analysis of variance of second universal rotating combination experiment results

通過(guò)二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)建立的回歸方程的偏回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小可以判斷出各個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分的影響大小順序：初始糖度（X3）＞果汁比例（X1）＞發(fā)酵溫度（X2），且均為正效應(yīng)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

以零水平的平均值84.25為臨界值，獲得大于臨界值的28個(gè)方案，各變量取值的頻率分布見(jiàn)表5。

由表5可以看出，在95%的置信區(qū)間感官評(píng)分大于84.25的優(yōu)化方案為：果汁比例1∶3.543～1∶4.109、發(fā)酵溫度22.703～23.297 ℃、初始糖度23.646～24.149°Bx。為了滿(mǎn)足實(shí)際化工業(yè)生產(chǎn)可將優(yōu)化方案設(shè)為果汁比例1∶4（V/V）、發(fā)酵溫度23 ℃、初始糖度24°Bx。對(duì)于此方案驗(yàn)證得到感官評(píng)分為84.35分，酒精度為12.3%vol，與優(yōu)化方案的理論值接近，進(jìn)一步證實(shí)了方案的可靠性。

表5 各變量取值的頻率分布Table5 Frequency distribution of values of each variable

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量

對(duì)最佳發(fā)酵工藝條件下的葡萄百香果酒進(jìn)行衛(wèi)生指標(biāo)檢測(cè)和感官評(píng)價(jià)，成品葡萄百香果酒具有濃郁百香果味及色澤金黃、透明澄清，富有光澤，無(wú)雜質(zhì)酸甜適中、口感清爽。糖含量（3.08±0.38）g/L，總酸含量為（6.65±0.29）g/L，菌落總數(shù)≤30 CFU/mL，大腸菌群≤3 MPN/mL，致病菌未檢出等衛(wèi)生指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，即開(kāi)發(fā)的葡萄百香果酒的符合產(chǎn)品要求、品質(zhì)較佳。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)葡萄百香果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，葡萄百香果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為酵母添加量（葡萄酒活性干酵母∶耐高溫活性干酵母=1∶1）為0.4%、葡萄汁∶百香果汁1∶4（V/V），初始糖度24°Bx、發(fā)酵溫度23 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d，在此條件下，得到的葡萄百香果酒果味濃郁、色澤金黃、酸甜適中、口感清爽，感官評(píng)分為84.35分，其酒精度為（12.3±1.3）%vol，糖含量（3.08±0.38）g/L，總酸含量為（6.65±0.29）g/L，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，是一款品質(zhì)較佳的風(fēng)味果酒。