林 楊，孫 建，顧美英，楚 敏，李 雪，唐琦勇，朱 靜，張志東*

（1.新疆農業(yè)科學院 微生物應用研究所 新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

目前我國約有70%的人群正處于“亞健康”狀態(tài)，表現(xiàn)出睡眠紊亂、焦慮、記憶力下降、食欲不振等癥狀，多由神經(jīng)緊張或精神壓力過大，體內缺乏γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）所導致[1-2]。研究表明，GABA是動物體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質，具有鎮(zhèn)靜安神、調節(jié)血壓、改善睡眠、治療糖尿病及改善肝、腎臟功能[3]等多種生理功效，人體每天攝入30～100 mg純天然的GABA就能起到一定保健作用[4-5]。GABA在食品工業(yè)中的應用始于1986年，以日本茶飲料“Gabaron”為代表。隨著近年來GABA的多種生理功能陸續(xù)被揭開，富含GABA食品的開發(fā)已成為國內外研究熱點。目前，市場中常見產品有美國G'NITE公司的GABA睡眠軟糖、澳洲Swisse公司的GABA膠原蛋白液等。相比之下，我國有關GABA食品研發(fā)起步較晚，國家衛(wèi)生部并于2009年將GABA列入新資源食品原料目錄[6]，因此，加快研發(fā)富含GABA相關食品和飲品，具有重要的研究和應用前景。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品安全級微生物（generally recognized as safe，GRAS）[7]，具有維持腸道平衡、改善乳糖不耐癥及提高機體免疫力等特性[8]，常用于酸奶、奶酪等乳制品的生產加工[9]。其中，部分乳酸菌具有谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活性，能夠產生GABA，將二者結合可生產出富含GABA的乳制品[10]。如謝芳等[11]利用乳酸乳球菌研發(fā)出了具有鎮(zhèn)靜安神作用的GABA水牛乳酸奶；HAGI T等[12]利用乳酸乳球菌乳亞種01-7制備出降血壓的GABA發(fā)酵乳。目前，富含GABA的乳酸菌飲料多以鮮乳[13-14]、麥胚[15]、南瓜[16]、香蕉[17]、蘋果[18]、藜麥[19]、白刺果[20]、椰果[21]等為發(fā)酵基質，經(jīng)產GABA乳酸菌發(fā)酵研制而成的發(fā)酵乳飲料中GABA含量約為0.1～1.2 g/L，普遍較低。

本研究利用分離自吉爾吉斯斯坦地區(qū)特色乳制品中的乳酸菌株戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）Z6，通過一步發(fā)酵工藝得到富含GABA和豐富營養(yǎng)物的乳酸菌發(fā)酵飲料，通過與蜂蜜、碳酸鈣和阿斯巴甜等配方的調配，結合模糊數(shù)學模型對其感官品質進行評定，對其口感、品質和穩(wěn)定性進行了綜合性評價，為富含GABA的功能性乳酸菌飲品的研發(fā)及產業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）Z6，分離篩選自吉爾吉斯斯坦地區(qū)特色乳制品，由新疆微生物資源保藏管理中心提供。

1.1.2 化學試劑

瓊脂、羧甲基纖維素鈉（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）、黃原膠、碳酸鈣、阿斯巴甜（均為食品級）：上海源葉生物科技有限公司；蜂蜜：市售；蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸氫二胺、硫酸錳、硫酸鎂、鹽酸（均為分析純或生化試劑）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸錳0.04 g，硫酸鎂0.2 g，純凈水1 000 mL，0.1 mol/L鹽酸調節(jié)至pH值5.7左右。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；HVE-50自動高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；UVZ2550紫外分光光度計：日本島津儀器公司；PLCD高速冷凍離心機：德國Sigma公司；PHSJ-3F pH計：上海儀電科學儀器有限公司；AR224CN電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；HYW-2112全溫度恒溫調速搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 功能性乳酸菌飲品的加工工藝流程及操作要點

菌種活化→種子培養(yǎng)液制備→發(fā)酵飲料制備→調配→灌裝、封口→功能性乳酸菌飲品

操作要點：

菌種活化：將4 ℃斜面保藏的菌株Z6劃線于MRS瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)1～2 d，得到活化的菌株Z6。

種子培養(yǎng)液制備：取上述活化菌株Z6轉接至MRS肉湯培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/200 mL，于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得到菌株Z6種子培養(yǎng)液。

發(fā)酵飲料制備：將上述種子培養(yǎng)液轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4%（V/V），裝液量為200 mL/500 mL，于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，以發(fā)酵液中的GABA含量、乳酸菌活菌數(shù)及pH值趨于穩(wěn)定為發(fā)酵終點，得到乳酸菌發(fā)酵飲料。

飲品調配：將蜂蜜、碳酸鈣、阿斯巴甜按照一定配比添加到乳酸菌發(fā)酵飲料中，輔以瓊脂、黃原膠、CMC-Na復合穩(wěn)定劑進行均勻調配。

灌裝、封口：將調配好的飲品灌裝于經(jīng)60Co-γ于30 kGy條件下輻射滅菌24 h后的瓶中并封口，得到功能性乳酸菌飲品。

1.3.2 功能性乳酸菌飲品配方優(yōu)化

（1）單因素試驗

固定碳酸鈣添加量0.30%，阿斯巴甜添加量0.10%，考察蜂蜜添加量（3%、4%、5%、6%、7%）對感官品質的影響；選定蜂蜜添加量6%，阿斯巴甜添加量0.01%，考察碳酸鈣添加量（0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）對感官品質的影響；選定蜂蜜添加量6%，碳酸鈣添加量0.30%，考察阿斯巴甜添加量（0.005 0%、0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%、0.015 0%）對感官品質的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以蜂蜜添加量（A）、碳酸鈣添加量（B）、阿斯巴甜添加量（C）為變量，以感官評分為考察指標，采用L9（34）正交試驗設計，正交試驗因素與水平見表1。

表1 功能性乳酸菌飲品配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of functional lactic acid bacteria beverage

1.3.3 感官評價

隨機挑選10名食品專業(yè)的老師及學生組成評定小組，采用不記名的方式，對飲料的色澤、氣味、口感和組織狀態(tài)[22]進行單獨打分，統(tǒng)計總分并計算平均分[23]，滿分10分，功能性乳酸菌飲品評定標準見表2。

表2 功能性乳酸菌飲品感官評價標準Table2 Sensory evaluation standards of functional lactic acid bacteria beverage

1.3.4 模糊數(shù)學綜合評價模型的建立[24]

對不同條件下乳酸菌飲品感官指標進行模糊數(shù)學綜合評價，并建立評價集。

評價對象集X，代表9組感官評價的乳酸菌飲品集合，X={X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9}。Xj代表9組乳酸菌飲品的綜合評價，其中j=1，2，3···9。

評價因素集U={U1，U2，U3，U4}，即U={色澤，氣味，口感，組織狀態(tài)}。

評語集V={V1，V2，V3，V4}，代表每個因素的評語集合，即V={優(yōu)，良，中，差}={10，8，5，2}。

權重集K={K1，K2，K3，K4}，由表1可知，K={0.2，0.3，0.3，0.2}。

1.3.5 穩(wěn)定劑配比優(yōu)化

（1）單因素試驗

以離心沉淀率和穩(wěn)定效率為評價指標，固定黃原膠添加量0.10%、CMC-Na添加量0.10%，考察瓊脂添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對穩(wěn)定性的影響；固定瓊脂添加量0.10%、CMC-Na添加量0.10%，考察黃原膠添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對穩(wěn)定性的影響；固定瓊脂添加量0.10%、黃原膠添加量0.10%，考察CMC-Na添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對穩(wěn)定性的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以瓊脂添加量、黃原膠添加量、CMC-Na添加量為變量，以離心沉淀率為評價指標，設計L9（34）正交試驗，穩(wěn)定劑配比優(yōu)化正交試驗因素與水平見表3。

表3 穩(wěn)定劑配比優(yōu)化正交試驗因素與水平Table3 Factors and levels of orthogonal tests for stabilizer ratio optimization

1.3.6 穩(wěn)定性測定

以離心管取待測樣品30 mL，并測定樣品質量M0（g）后，以5 000 r/min離心15 min后取出，除去上清液，測殘余物的質量M（g）。每個樣品進行3次平行測定后取平均值。離心沉淀率計算公式如下[25]：

穩(wěn)定效率的測定：取待測樣品于比色皿，在600 nm波長下測定其吸光度值A0；取一定量樣品，于5 000 r/min離心15 min，取其上清液在600 nm波長下測定其吸光度值A。每個樣品進行3次平行測定后取平均值。穩(wěn)定效率計算公式如下[26]：

1.3.7 貯藏期飲品的成分變化

在最佳配方及最佳穩(wěn)定劑配比條件下，制備功能性乳酸菌飲品，在不同貯藏時間（0 d、30 d、60 d、90 d），常溫儲藏溫度（20～25 ℃）條件下進行貯藏，取樣分別測定飲品中活菌數(shù)、pH值、GABA含量，同時測定雜菌總數(shù)、大腸菌群數(shù)量、致病菌以及霉菌、酵母數(shù)量，得到貯藏期間飲品的成分變化。每個樣品進行3次平行測定后取平均值。

1.3.8 分析檢測方法

乳酸菌活菌數(shù)：按照國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中平板計數(shù)法[27]；pH值：采用pH計；總酸度：參照文獻[28]及國標GB/T 5009.239—2016《食品酸度的測定》[29]；游離氨基酸：參照文獻[30]及國標GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[31]；菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌、酵母及致病菌的檢測：按照國標GB/T 4789.21—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗冷凍飲品、飲料檢驗》[32]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、Minitab 17.0、Origin 8.0等數(shù)據(jù)處理軟件進行整理及統(tǒng)計分析作圖。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中活菌數(shù)、GABA含量和pH值的變化

菌株發(fā)酵過程中活菌數(shù)、GABA含量及pH值變化見圖1。由圖1可知，在發(fā)酵前16 h，乳酸菌增長顯著，此時GABA的合成較為緩慢，pH值則呈顯著下降趨勢；發(fā)酵24 h后，乳酸菌進入生長穩(wěn)定期，其活菌數(shù)不再發(fā)生顯著性變化，此時為GABA的主要合成期；而到了48 h，GABA含量不再發(fā)生顯著性變化，同時發(fā)酵液的pH值也趨于穩(wěn)定。因此，選擇發(fā)酵時間為48 h，此時發(fā)酵飲料中的GABA含量為1.98 g/L，乳酸菌含量＞1×1010CFU/mL，pH值為4.0左右，符合作為乳酸菌飲品基質的條件[33]。

圖1 功能性乳酸菌飲品發(fā)酵過程中活菌數(shù)、γ-氨基丁酸含量和pH值的變化Fig.1 Changes of viable bacterial count,γ-aminobutyric acid contents and pH value during fermentation process of functional lactic acid bacteria beverage

2.2 功能性乳酸菌飲品配方優(yōu)化

2.2.2 正交試驗

由10名感官評定人員對9組調配的功能乳酸菌飲品進行感官評價，其結果見表4。

將表4中各樣品因素等級所得票數(shù)與總票數(shù)進行折算，得到模糊矩陣R。例如將樣品1的模糊矩陣R1與權重集K合成得到樣品1的綜合評價集Y1為：

表4 功能性乳酸菌飲料的感官評定結果Table4 Results of sensory evaluation of functional lactic acid bacteria beverage

將綜合評價集Y1和評語集V合成得到樣品1的感官得分W1，即W1=0.41×10+0.15×8+0.24×5+0.2×2=6.90。同理可得到W1、W2……W9。

2.2.1 單因素試驗

蜂蜜添加量、碳酸鈣添加量及阿斯巴甜添加量對感官得分的影響見圖2。

圖2 蜂蜜（A）、碳酸鈣（B）及阿斯巴甜（C）添加量對功能性乳酸菌飲品感官評價的影響Fig.2 Effect of honey (A),calcium carbonate (B) and aspartame (C) addition on sensory evaluation of functional lactic acid bacteria beverage

由圖2A可知，當蜂蜜添加量為5%時，感官評分最高為（8.9±0.1）分。此時飲品的色澤呈均一的深褐色，同時具有濃郁的乳酸香氣；隨著蜂蜜添加量的增加，乳酸香氣逐漸變淡，蜂蜜添加量過多時，蜂蜜甜味過濃，顏色逐漸變淺，呈淺褐色；蜂蜜添加量較低時，無明顯蜂蜜味。經(jīng)綜合考慮，選取蜂蜜添加量為4%、5%、6%進行正交試驗。

由圖2B可知，當碳酸鈣的添加量為0.30%時，感官評分最高為（8.8±0.15）分。此時飲品的色澤呈均一的深褐色，口感較好，同時具有濃郁的乳酸香氣；隨著碳酸鈣添加量的增加，乳酸香氣逐漸變淡，碳酸鈣添加量過多時，乳酸味過淡，顏色逐漸變淺，呈深黃色；碳酸鈣添加量較低時，口感較酸。經(jīng)綜合考慮，選取碳酸鈣添加量為0.25%、0.30%、0.35%進行正交試驗。

由圖2C可知，當阿斯巴甜的添加量為0.010 0%時，感官評分最高為（9.1±0.09）分。此時的飲品酸甜可口，同時具有濃郁的乳酸香氣；隨著阿斯巴甜添加量的增加，乳酸味逐漸變淡，阿斯巴甜添加量過多時，口感過甜，并略有苦后味；阿斯巴甜添加量較低時，口感較酸。經(jīng)綜合考慮，選取阿斯巴甜添加量為0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%進行正交試驗。

以模糊數(shù)學評定法對正交試驗各試驗組的樣品進行感官評價，結果見表5，方差分析結果見表6。

表5 功能性乳酸菌飲品配方優(yōu)化正交試驗結果與分析Table5 Results and analysis of orthogonal tests of formula optimization for functional lactic acid bacteria beverage

由表5可知，各因素對飲品感官評分的影響順序為蜂蜜添加量＞阿斯巴甜添加量＞碳酸鈣添加量。最佳配方組合為A3B3C2，即蜂蜜添加量6%，碳酸鈣添加量0.35%，阿斯巴甜添加量0.01%。在此最佳配比下進行3次平行驗證試驗，感官評分為最高8.52分。所得飲品色澤均一、酸甜可口、香氣適宜、口感細膩。由表6可知，蜂蜜添加量對飲品感官評分影響顯著（P＜0.05）；碳酸鈣和阿斯巴甜對飲品感官評分影響不顯著（P＞0.05）。

表6 功能性乳酸菌飲品配方優(yōu)化正交試驗結果方差分析Table6 Variance analysis of orthogonal tests results of formula optimization for functional lactic acid bacteria beverage

2.3 穩(wěn)定劑配比優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

瓊脂添加量（A）、黃原膠添加量（B）、CMC-Na添加量（C）對穩(wěn)定性的影響見圖3。

圖3 瓊脂（A）、黃原膠（B）及CMC-Na（C）添加量對功能性乳酸菌飲品穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of agar (A),xanthan gum (B) and CMC-Na (C) addition on stability of functional lactic acid bacteria beverage

由圖3A可知，隨著瓊脂添加量在0.05%～0.25%范圍內的增加，離心沉淀率呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。當瓊脂添加量為0.05%時，此時的離心沉淀率達到最低，為（2.56±0.10）%。當瓊脂添加量繼續(xù)增加，離心沉淀率也隨之增加。因此，選擇0.05%、0.10%、0.15%3個水平進行正交試驗優(yōu)化。

由圖3B可知，隨著黃原膠添加量在0.05%～0.25%范圍內的增加，離心沉淀率呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢。當黃原膠添加量為0.15%時，此時的離心沉淀率達到最低，為（2.31±0.11）%。當黃原膠添加量繼續(xù)增加，離心沉淀率也隨之增加。因此，選擇0.10%、0.15%、0.20%3個水平進行正交試驗優(yōu)化。

由圖3C可知，隨著CMC-Na的添加量在0.05%～0.25%范圍內的增加，離心沉淀率呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。當黃原膠添加量為0.20%時，此時的離心沉淀率達到最低，為（2.35±0.12）%。當CMC-Na添加量繼續(xù)增加，離心沉淀率也有所增加。因此，選擇0.10%、0.15%、0.20%3個水平進行正交試驗優(yōu)化。

2.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以離心沉淀率為主要評價指標，考察瓊脂、黃原膠和CMC-Na添加量對功能性乳酸菌飲品穩(wěn)定性的影響，正交試驗結果與分析見表7，方差分析結果見表8。

由表7可知，各因素對飲品穩(wěn)定性的影響順序為CMC-Na添加量＞黃原膠添加量＞瓊脂添加量。最佳穩(wěn)定劑的配比組合為A2B3C2，即瓊脂添加量0.10%，黃原膠添加量0.20%，CMC-Na添加量0.15%。在此最佳配比下進行3次平行驗證試驗，所得飲品的離心沉淀率為1.92%、穩(wěn)定效率為68.18%。由表8可知，CMC-Na添加量對飲品穩(wěn)定性影響顯著（P＜0.05），瓊脂和黃原膠添加量對飲品穩(wěn)定性影響不顯著（P＞0.05）。

表7 穩(wěn)定劑配比優(yōu)化正交試驗結果與分析Table7 Results and analysis of orthogonal tests for stabilizer ratio optimization

表8 穩(wěn)定劑配比優(yōu)化正交試驗結果方差分析Table8 Variance analysis of orthogonal tests results of stabilizer ratio optimization

綜上所述，功能性乳酸菌飲品的最佳配方為：蜂蜜添加量6%，碳酸鈣添加量0.35%，阿斯巴甜添加量0.01%，穩(wěn)定劑最佳配比為：瓊脂添加量0.10%，黃原膠添加量0.20%，CMC-Na添加量0.15%。

2.4 功能性乳酸菌飲品分析檢測

對功能性乳酸菌飲品成品氨基酸進行分析檢測，結果見見表9。

表9 功能性乳酸菌飲品氨基酸含量分析Table9 Amino acid contents analysis of functional lactic acid bacteria beverage

續(xù)表

由表9可知，飲品中共檢出游離氨基酸18種，除GABA外，還包括7種必需氨基酸；其中谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸及天氡氨酸等功能性氨基酸的含量均≥0.1 g/100 g。

2.5 貯藏期飲品的品質變化

將在上述最佳配方及穩(wěn)定劑條件下制得的飲品成品置于常溫（20～25 ℃）下貯藏，并對其進行監(jiān)測，貯藏期間成品各項指標的監(jiān)測結果見表10。由表10可知，隨著貯藏時間的延長，乳酸菌活菌數(shù)的減少趨勢較為顯著，第30天時減少了約38%，第60天時減少了約80%，而到了第90天，其數(shù)量仍在108CFU/mL以上；pH值則由4.46降低為3.65；而GABA含量則未發(fā)生明顯變化，由此可見GABA含量未受到貯存時間的影響。

表10 貯藏期間成品各項指標的監(jiān)測結果Table10 Monitoring results of various indexes of finished products during storage

2.6 功能性乳酸菌飲品質量指標

感官指標：飲品色澤均一、酸甜可口、香氣適宜、口感細膩，感官評分為8.52分。

理化指標：蛋白質1.960 g/100 g，總酸19.160 g/kg，游離氨基酸（18種）1.82 g/100 g。

微生物指標：乳酸菌活菌數(shù)1.026×1010CFU/mL；雜菌總數(shù)＜10 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；霉菌及酵母＜10 CFU/mL；致病菌未檢出。

3 結論

本研究以色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)為評價因素，結合正交試驗設計，采用模糊數(shù)學模型對GABA乳酸菌飲品進行綜合評判，最終得到飲品最佳配方為：以乳酸菌發(fā)酵飲料為基質，添加蜂蜜6%、碳酸鈣0.35%、阿斯巴甜0.01%。此條件下得到的飲品色澤呈均一深褐色、酸甜可口、乳酸香氣濃郁，感官評分為最高的8.52分；飲品穩(wěn)定劑的最佳配比為：瓊脂0.10%、黃原膠0.20%、CMC-Na 0.15%。在此條件下所得飲品的離心沉淀率為1.92%、穩(wěn)定效率為68.18%，穩(wěn)定性較高。采用上述配方條件制備的乳酸菌飲品中GABA的含量為1.98 g/L，乳酸菌活菌數(shù)達1.026×1010CFU/mL，且其中富含多種其他氨基酸等益生因子，具有一定的保健功能且在常溫下具有較好的貯藏性，為富含GABA的功能性乳酸菌飲品的產業(yè)化生產奠定堅實的基礎。