毛 丹，馮 睿，程益清，胡 青，季 申

（上海市食品藥品檢驗(yàn)所 國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

越橘 （Vaccinium myrtillus），是一類生有漿果的多年生落葉或常綠灌木或小灌木樹種[1]，為杜鵑花科越橘屬植物[2-4]。該屬植物全世界約有300多種，我國約有60余種。越橘主要生長于歐洲、俄羅斯、北美和阿爾卑斯山海拔 1500～2000 m處，其中歐洲越橘（Vaccinium myrtillusL.）因富含花色苷，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，作為保健食品原料已被消費(fèi)者廣泛認(rèn)可[5]。越橘提取物是以歐洲越橘的新鮮果實(shí)為原料經(jīng)加工而制成的提取物[6]，其功效顯著、應(yīng)用范圍廣、副作用低，近年已廣泛應(yīng)用于保健食品與藥品中[7]。

越橘提取物主要含花色苷活性成分，另外還含多糖、果膠、單寧等成分[8]?；ㄉ帐怯苫ㄇ嗨嘏c糖結(jié)合而成的一類物質(zhì)的統(tǒng)稱，因其基本骨架結(jié)構(gòu)（圖1）與2-苯色原酮結(jié)構(gòu)十分相似，故花色苷類化合物也統(tǒng)稱為黃酮類化合物。花青素是2-苯基苯并吡喃陽離子的多羥基和甲基衍生物，已有研究表明，越橘提取物中花青素主要為錦葵素、飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素5種[9]。因花青素中存在共軛雙鍵，能吸收可見光而呈現(xiàn)一定的顏色。其化學(xué)結(jié)構(gòu)中黃烊鹽陽離子缺乏電子，游離的花青素極不穩(wěn)定，越橘提取物中花青素主要為糖苷形式，所結(jié)合的糖主要是葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖。本研究測(cè)定了越橘提取物中游離花青素及花色苷的含量，以期達(dá)到工藝及質(zhì)量控制的目的。

圖1 花色苷基本骨架結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫），配有紫外-可見光檢測(cè)器，ChemStation色譜工作站；Sartorius電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；矢車菊素（歐洲藥典對(duì)照品）；越橘提取物樣品（批號(hào)：Q20200903-1，Q20200903-2，Q20200903-3，Q20200903-4，Q20200903-5，Q20200903-6，Q20200903-7，Q20200903-8，Q20200903-9，Q20200903-10，浙江天草生物科技股份有限公司）；甲醇，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 游離花青素的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 安捷倫Zorbax Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲酸-水（8.5:91.5，v/v），流動(dòng)相B：乙腈-甲醇-甲酸-水（22.5:22.5:8.5:41.5，v/v/v/v），按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長535 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按矢車菊素計(jì)應(yīng)不低于5000，見圖2。

表1 梯度洗脫程序

圖2 HPLC圖譜

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素對(duì)照品（精確至0.01 mg），加2 %鹽酸甲醇溶液制成每1 ml含0.25 mg的溶液。精密量取2 ml上述溶液于100 ml量瓶中，加10 %磷酸水溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 稱取試樣125 mg（精確至0.1 mg），置100 ml量瓶中，加2 %鹽酸甲醇溶液25 ml，超聲使溶解，再用10 %磷酸水溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取矢車菊素對(duì)照品溶液（4.75 μg/ml）1，2，5，10 μl，矢車菊素對(duì)照品溶液（47.52 μg/ml）2，5，10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w曲線方程為Y=5.2407X+4.0747，r=1.0000。結(jié)果表明，矢車菊素在4.75～475.24 ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系均良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，4 ℃時(shí)分別于0，4，12，18，28 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.7 %。表明供試品溶液保持其溫度為4 ℃時(shí)在0～28 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取矢車菊素對(duì)照品溶液（4.75 μg/ml）10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD為1.2 %。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品6份，按2.1.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)定矢車菊素的含量，計(jì)算RSD為0.7 %。表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品，一式9份，以3份為一組，分別加入矢車菊素對(duì)照品溶液（濃度為475.24 μg/ml）適量，再按2.1.2.2項(xiàng)方法平行操作，進(jìn)樣分析，測(cè)定各自含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.1.8 定量限與檢出限 將矢車菊素對(duì)照品溶液（4.75 μg/ml）逐級(jí)稀釋，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，直至信噪比為10:1和3:1，對(duì)應(yīng)濃度即分別為定量限和檢出限。游離花青素的定量限（以矢車菊素計(jì)）為5.0 ng；檢出限（以矢車菊素計(jì)）為1.5 ng。

2.1.9 樣品測(cè)定 取樣品，一式2份，按2.1.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，另取2.1.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，采用外標(biāo)法計(jì)算校正因子進(jìn)行測(cè)定，平均測(cè)定結(jié)果見表2

表2 樣品中矢車菊素含量測(cè)定結(jié)果

2.2 花色苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 同2.1.1項(xiàng)下色譜條件。理論板數(shù)按矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì)應(yīng)不低于5000，見圖1。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.01 mg），加2 %鹽酸甲醇溶液制成每1 ml含0.25 mg的溶液。精密量取2 ml上述溶液于10 ml量瓶中，加10 %磷酸水溶液稀釋并定容至刻度，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 同2.1.2.2項(xiàng)下方法。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液（51.03 μg/ml）1，2，5，10 μl，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液（510.32 μg/ml）2，5，10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w曲線方程為Y=2.3399X+8.331，r=1.0000。結(jié)果表明，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在51.03～5103.24 ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系均良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，4 ℃下分別于0，4，12，18，28 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.3 %。表明供試品溶液保持其溫度為4 ℃時(shí)在0～28 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液（51.03 μg/ml）10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.2 %。表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品6份，按2.1.2.2項(xiàng)方法制成供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)定矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量，計(jì)算RSD為0.3 %。表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品，一式9份，以3份為一組，分別加入矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液（濃度為1.2758 mg/ml）適量，再按2.1.2.2項(xiàng)方法平行操作，進(jìn)樣分析，測(cè)定各自含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.8 樣品測(cè)定 取樣品，一式2份，按2.1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另取2.2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，采用外標(biāo)法計(jì)算校正因子進(jìn)行測(cè)定，平均測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 樣品中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 背景

越橘提取物是以歐洲越橘（Va c c i n i u m myrtillusL.）的新鮮冷凍果實(shí)為原料經(jīng)提取加工而成的提取物，主要含花色苷活性成分。越橘提取物在歐美日等發(fā)達(dá)國家市場(chǎng)很大，是歐洲藥典（EP）、美國藥典（USP）及英國藥典（BP）中收錄品種。我國醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì)參考EP和USP，并結(jié)合國內(nèi)越橘提取物的特殊情況，制訂了越橘提取物國際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)，用于指導(dǎo)越橘提取物的出口質(zhì)量控制。但越橘并不是傳統(tǒng)的中藥材，中國藥典中未收錄，也無相關(guān)的國家食品原料標(biāo)準(zhǔn)收錄。因此，為保障國家外貿(mào)經(jīng)濟(jì)運(yùn)行的安全和我國人民群眾的食品衛(wèi)生安全，加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)，促進(jìn)與國際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接，建立符合我國國情的越橘提取物國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 越橘提取物制備工藝

越橘提取物中主要活性成分花色苷為水溶性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙醇、水或它們所組成的混合溶液，不溶于石油醚、乙醚等非極性溶劑。提取花色苷的方法主要有熱水提取法、醇提法、超臨界流體萃取等。其純化方法也有多種，如紙層析法、毛細(xì)管電泳法及較為經(jīng)典的柱層析法等。

USP、EP和BP中越橘提取物提取采用醇提或水提，純化可采用離子交換層析法。同時(shí)對(duì)我國越橘提取物的部分生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行了調(diào)研，結(jié)果表明，目前國內(nèi)在越橘提取物工業(yè)化生產(chǎn)中多采用醇提或水提法，而純化方法則多采用大孔樹脂精制方式。本實(shí)驗(yàn)收集的越橘提取物樣品均采用水提取大孔樹脂精制的制備工藝。

3.3 物質(zhì)基礎(chǔ)研究與分析

采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜對(duì)越橘原料和越橘提取物進(jìn)行了物質(zhì)基礎(chǔ)研究，結(jié)果用于指導(dǎo)標(biāo)志性成分項(xiàng)目的建立。分別采用正離子及負(fù)離子模式對(duì)越橘對(duì)照提取物溶液及兩份供試品溶液掃描，結(jié)果其均在正離子模式下色譜峰信息量較多，故最終選擇正離子模式掃描。

根據(jù)越橘對(duì)照提取物品質(zhì)證書中所標(biāo)示的各花色苷或花青素色譜峰的精確分子量、保留時(shí)間及二級(jí)碎片確證，對(duì)比分析越橘原料及越橘提取物供試品溶液，結(jié)果越橘提取物中檢測(cè)到15種花色苷成分及5種游離花青素成分共20種化合物，而越橘原料中則僅檢測(cè)到15種花色苷成分。

越橘中花青素少以游離態(tài)的形式出現(xiàn)，常與葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等通過糖苷鍵形成花色苷。而越橘提取物主要保健功效為抗氧化、保護(hù)視力，起作用的活性成分為花色苷，故將15種花色苷設(shè)定為其標(biāo)志性成分項(xiàng)。另由越橘提取加工制成的越橘提取物在工藝制備或貯存中會(huì)有降解現(xiàn)象，故設(shè)定游離花青素作為理化指標(biāo)項(xiàng)進(jìn)行控制。

3.4 色譜柱和柱溫的選擇

本研究對(duì)比了Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為目標(biāo)物的預(yù)選分離柱，同時(shí)比較了3個(gè)不同柱溫（30，25，20 ℃）。結(jié)果表明，采用色譜柱Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和柱溫30 ℃、色譜柱Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和柱溫25 ℃、色譜柱Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和柱溫30 ℃，花色苷及游離花青素各目標(biāo)峰分離效果差別不大，均能滿足檢測(cè)要求。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)具體情況擇優(yōu)選取色譜柱及柱溫。

3.5 流動(dòng)相的選擇及洗脫方式的確定

本研究參考?xì)W洲藥典（EP 10.0）中越橘提取物的含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相的選擇及洗脫方式，對(duì)于洗脫方式也嘗試了調(diào)整水相及有機(jī)相的不同比例，發(fā)現(xiàn)調(diào)整比例后花色苷及游離花青素各目標(biāo)峰的分離效果均不及原洗脫方式，故最終確定流動(dòng)相為A：甲酸+水（8.5:91.5，v/v），B：乙腈+甲醇+甲酸+水（22.5:22.5:8.5:41.5，v/v/v/v），洗脫方式同2.1.1項(xiàng)。

3.6 進(jìn)樣溶液溫度的選擇

本研究考察了供試品溶液的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)常溫放置1 h的供試品溶液就會(huì)出現(xiàn)花色苷成分含量降低，游離花青素含量增加的現(xiàn)象，故選擇冷藏（4 ℃）供試品溶液，24 h時(shí)內(nèi)各花色苷峰峰面積及游離花青素峰峰面積均基本穩(wěn)定。

本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定越橘提取物中花色苷類成分及游離花青素的含量，該方法簡便可行，精密度良好，準(zhǔn)確度高，可有效控制越橘提取物的質(zhì)量。