孔玄慶，喻 快，羅澤偉，歐曉明,*，李建明，蔣 煜，郭 軍，金晨鐘

(1.湖南化工研究院 國家農(nóng)藥創(chuàng)制工程研究中心/湖南省農(nóng)用化學(xué)品重點實驗室,湖南 長沙 410014；2.湖南化研院檢測技術(shù)有限公司,湖南 長沙 410014；3.湖南人文科技學(xué)院/農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000)

農(nóng)藥作為重要的戰(zhàn)略支農(nóng)物資，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著不可或缺的作用。然而，農(nóng)田特別是稻田施用的農(nóng)藥不可避免地通過漂移、雨水沖刷、地表徑流等多種途徑進入水體中,發(fā)生一系列的環(huán)境化學(xué)行為，危及水生生物的安全并通過食物鏈可危害人類的健康[1-2]。因此,開展農(nóng)藥對水生生物的毒性效應(yīng)研究，對評價農(nóng)藥對水生生物的危害以及安全合理使用準則的制定具有重要的意義。

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)是一種廣泛存在于我國水體中的淡水單細胞藻類，因其具有對毒物敏感、個體小、實驗室易培養(yǎng)、繁殖能力強等特點而在國際上被廣泛用于污染物毒性評價[2-4]。雙唑草腈(pyraclonil)，化學(xué)名稱為1-(3-氯-4,5,6,7-四氫吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-炔基)氨基]吡唑-4-腈，是德國拜耳公司于1992年研發(fā)的一種具吡唑并吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的新型除草劑，主要用于稻田防除稗草、牛毛氈、鴨舌草、田皂角、紫水莧菜等多種一年生和多年生雜草，且對作物安全[5-6]。目前國內(nèi)有關(guān)雙唑草腈的研究主要集中于合成和應(yīng)用技術(shù)[5-7]，而其對水生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)研究報道頗少[8]?；诖?，本文在前期工作基礎(chǔ)上[8]，以斜生柵藻為試驗對象，開展了其對雙唑草腈脅迫的響應(yīng)研究，旨在為雙唑草腈對水生生物生態(tài)風(fēng)險評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑與藥品 主要儀器：LC-20A型高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器和化學(xué)工作站，UV-1750型紫外可見分光光度計，AUY220型電子天平，XSP-2C-1型生物顯微鏡，MIKRO 220R型離心機等。

試劑與藥品：甲醇(色譜純)、丙酮(分析純)和吐溫-80；超純水，由實驗室通過Milipore制備：水生4號培養(yǎng)基[9-10]，實驗室配制；雙唑草腈原藥，質(zhì)量百分數(shù)純度為97.5%。

1.2 供試生物 斜生柵藻引種于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，在溫度21～24℃、光照強度4 440～8 880 lx、連續(xù)光照的環(huán)境條件下振蕩培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙唑草腈在藻液中的穩(wěn)定性 為獲得更準確可靠的試驗結(jié)果，參照Hu等[7]建立的方法采用液相色譜法測定了藻液中的雙唑草腈濃度變化。分析色譜條件為：色譜柱Inert SustainC18，4.6×150mm(i.d)不銹鋼柱，5μm；柱溫40℃ ；流動相為甲醇+水=55+45(V/V)；流速為1.00mL/min；進樣量為20μL；波長為236nm。在上述色譜條件下，雙唑草腈的保留時間為7.80min，采用外標法定量。設(shè)置1.00×10-2、5.00×10-2mg a.i./L濃度下2組添加回收試驗，每個濃度重復(fù)5次，平均添加回收率為97.67%～98.45%，RSD為1.62%～1.82%，說明該方法符合檢測分析的基本要求，最低檢出量(LOD)為1.00×10-9g，最低檢出濃度(LOQ)為1.00×10-2mg a.i./L。

1.3.2 雙唑草腈對斜生柵藻的急性毒性 參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價實驗準則》[9]和OECD[10]推薦的生長抑制法。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，設(shè)定試驗濃度分別為1.00×10-2、1.20×10-2、1.44×10-2、1.73×10-2、2.07×10-2、2.49×10-2mg a.i./L。在無菌條件下將雙唑草腈先用水生4號培養(yǎng)基溶液溶解、超聲、定容，分別得到兩倍上述濃度藥液50mL，再分別加入50mL濃度為 2.00×104cell/mL的藻液，振蕩混合均勻后于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖蕩3～5次，每個濃度設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)空白對照組。于0、24、48、72h時取樣在顯微鏡下采用血球計數(shù)板測定各處理藻細胞數(shù)，并觀察其中毒癥狀，分別計算出藻細胞生物量半效應(yīng)濃度(EyC50)和藻細胞生長率半效應(yīng)濃度(ErC50)。

1.3.3 雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響 參照熊麗等[11]和歐曉明等[12]的方法，并稍改進。藻類培養(yǎng)液經(jīng)雙唑草腈暴露處理72h后，用移液管吸取藻細胞液30mL，4 000r/min離心10min，傾出上清液，直接加入5mL 80%(V/V)丙酮水溶液，搖勻，然后在光照培養(yǎng)箱中黑暗抽提12h，4 000r/min離心10min，取上清液于石英比色皿中，以80%丙酮溶液作為參比，用紫外可見分光光度儀分別測定藻細胞液在663nm、645nm和440nm波長下的吸光值，并按照公式(1)、(2)和(3)分別求出藻細胞葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)和類胡蘿卜素(Ck)含量(mg/L)。

Ca=12.7OD663-2.69OD645

(1)

Cb=22.9OD645-4.68OD663

(2)

Ck=4.70OD440-0.27(Ca+Cb)

(3)

1.4 統(tǒng)計方法 所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進行整理和分析，以濃度的對數(shù)值作為自變量(x)，斜生柵藻的抑制率作為因變量(y)，建立劑量-效應(yīng)線性關(guān)系方程、計算EC50和95%置信區(qū)間；使用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析數(shù)據(jù)的顯著性，采用duncan檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙唑草腈在藻液中的穩(wěn)定性 試驗期間各處理組藻細胞溶液中雙唑草腈的實測濃度(表1)?？瞻讓φ战M中未檢測出雙唑草腈，在暴露處理72h時藻細胞培養(yǎng)液中的雙唑草腈濃度為0h時的81.14～96.2%，偏差未超過20%，試驗結(jié)果以0h和72h實測濃度的幾何平均值計[9-10]。

表1 試驗起始和結(jié)束時雙唑草腈在溶液中的濃度變化

2.2 雙唑草腈對斜生柵藻的急性毒性 試驗期間，與空白對照組相比，藻細胞溶液顏色隨雙唑草腈暴露處理時間延長而變淺變黃，高濃度組尤為明顯，說明雙唑草腈對藻細胞的生長具有不同程度的抑制作用，且該抑制作用與藥劑濃度呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性(圖1)。72h時，空白對照組中藻細胞濃度為1.38×106±3.06×104cell/mL。從藻細胞生物量分析，雙唑草腈對藻細胞生物量的抑制作用隨暴露濃度升高和時間延長而增強，當(dāng)暴露時間為72h時，各處理間抑制率差異顯著(p<0.05)，其對藻細胞生物量的抑制作用達到最強，2.49×10-2mg a.i./L處理濃度組的生物量抑制率達到了90.79%(p<0.05)。從藻細胞生長率分析，72h時各處理間抑制率差異顯著(p<0.05)，但雙唑草腈對藻細胞生長率的抑制作用表現(xiàn)出與藻細胞生物量不同的現(xiàn)象，在暴露時間相同時，雙唑草腈對藻細胞生長率的抑制呈現(xiàn)隨濃度增大而增強的變化趨勢，而處理濃度相同時，雙唑草腈對藻細胞生長率的抑制作用隨時間延長并沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性變化。

圖中小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同圖1 雙唑草腈對斜生柵藻生長的抑制動態(tài)

根據(jù)生物量抑制率和生長抑制率數(shù)據(jù)，采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行線性回歸分析，并求得雙唑草腈對藻細胞生物量或生長的EyC50或ErC50值，結(jié)果列于(表2)。除草劑雙唑草腈對斜生柵藻生長的抑制作用隨著時間推移而逐漸增強，表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性，且相同暴露時間時雙唑草腈對斜生柵藻生物量的抑制作用強于對生長率的抑制。暴露時間為24、48和72h時，以生物量為指標，雙唑草腈對斜生柵藻的EyC50值分別為2.07×10-2mg a.i./L、1.50×10-2mg a.i./L和1.38×10-2mg a.i./L，而以生長率為指標，ErC50值分別為2.60×10-2mg a.i./L、2.45×10-2mg a.i./L和2.41×10-2mg a.i./L。

表2 雙唑草腈對斜生柵藻的急性毒性

2.3 雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響 用不同系列濃度的雙唑草腈藥液處理斜生柵藻，經(jīng)暴露72h，取樣測定藻細胞中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量，結(jié)果(圖2)和(表3)?？梢?，雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響因光合色素種類而異。隨著雙唑草腈濃度的升高，藻細胞中葉綠素a、葉綠素b含量及其比值Ca/Cb均表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢，其中對葉綠素a的影響具有顯著差異(p<0.05)，當(dāng)雙唑草腈的濃度為2.49×10-2mg a.i./L時，葉綠素a和葉綠素b受到的抑制作用最大，其抑制率分別為71.78%(p<0.05)和45.60%(p<0.05)，然而雙唑草腈對藻細胞中類胡蘿卜素的影響較小。說明雙唑草腈嚴重影響了斜生柵藻的光合作用，從而抑制了葉綠素a 和葉綠素b的生成，尤其是在葉綠素a值的變化更能很好地體現(xiàn)雙唑草腈的毒性抑制作用。

圖2 雙唑草腈對斜生柵藻光合色素的影響

表3 72h時雙唑草腈對光合色素的抑制動態(tài)

以雙唑草腈實測濃度的幾何平均值濃度對數(shù)為橫坐標(X)及其對葉綠素a、葉綠素b的抑制率為縱坐標(Y)進行線性回歸擬合，結(jié)果表明雙唑草腈與葉綠素a、葉綠素b之間均表現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。雙唑草腈對葉綠素a的抑制率的線性方程為Y=3.93x+6.98，R2=0.979，雙唑草腈對葉綠素a的72h-IC50為1.68×10-2mg a.i./L，95%置信區(qū)間為1.58×10-2～1.81×10-2mg a.i./L；雙唑草腈對葉綠素b的抑制率的線性方程為Y=2.14x+3.50，R2=0.923，雙唑草腈對葉綠素b的72h-IC50為2.33×10-2mg a.i./L，95%置信區(qū)間為1.99×10-2～3.18×10-2mg a.i./L?？梢?，雙唑草腈對葉綠素a的抑制作用要強于對葉綠素b的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥對藻類的毒性效應(yīng)主要由農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)決定，不同農(nóng)藥對藻類的毒性效應(yīng)不同，并在很大程度上表現(xiàn)為濃度相關(guān)性[3,12]。本研究表明不同濃度的雙唑草腈溶液中斜生柵藻生物量和藻細胞生長受到程度不同的抑制作用，且生長速率均低于空白組，同時雙唑草腈高濃度處理組(2.07×10-2、2.49×10-2mg a.i./L)還出現(xiàn)部分藻細胞體積增大、子細胞畸形分裂、人字形和褲型，2.49×10-2mg a.i./L處理中出現(xiàn)藻液脫色變黃等現(xiàn)象，這與前人報道的除草劑對藻類毒性效應(yīng)的研究結(jié)果一致[2,12-16]。本試驗研究證實，以藻細胞生物量和生長率為指標，參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》和OECD農(nóng)藥對藻類的毒性分級標準[9-10]，雙唑草腈對斜生柵藻均表現(xiàn)為高毒。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，必須科學(xué)合理使用雙唑草腈除草劑，注意施藥方法和施藥量的控制，盡量避免其進入水體，減少對水生生態(tài)環(huán)境的污染。

葉綠素是各種浮游藻類中廣泛存在的天然色素，其中葉綠素a存在于所有的浮游藻類中，大約占有機物干重的 1%～2%，是估算浮游植物生物量的重要指標[2,17]，同時葉綠素含量也是客觀反映植物利用光照能力的一種重要指標，往往作為判斷植物光合能力強弱，反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)[2-3,12,16]。本研究證實雙唑草腈對斜生柵藻葉綠素a和葉綠素b具有明顯的抑制作用，其對葉綠素a的抑制作用明顯強于對葉綠素b的抑制作用，且葉綠素a與葉綠素b的比值隨著處理濃度升高而變小。在正常的細胞中，葉綠素a與葉綠素b的比值會維持在一個穩(wěn)定的水平，比值減小對植物的光合作用影響較大[18]，這應(yīng)該與雙唑草腈的作用方式有關(guān)，雙唑草腈作為一種觸殺型雙吡唑類除草劑，其通過植物組織中原卟啉原氧化酶積聚而發(fā)揮藥效[5]。原卟啉原氧化酶與細胞中葉綠素和血紅素的合成有關(guān)，當(dāng)此酶受到抑制后，便會導(dǎo)致葉綠素第一個吸收光的前體物質(zhì)原卟啉原IX的積累[19]，進入細胞質(zhì)后被氧化成原卟啉IX，進一步代謝產(chǎn)生單線態(tài)氧，造成細胞膜等過氧化，破壞細胞結(jié)構(gòu)，影響葉綠素的合成和光合作用受阻[20]，導(dǎo)致藻細胞的生長受到抑制。因此，作者認為葉綠素a不僅可以作為評價藻類生物量的重要指標，還可作為藻類對農(nóng)藥等污染物敏感性強弱的毒性評價指標。