林陽(yáng)君，莊梅琳

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院，福建泉州 362011）

噬菌體在自然界中是數(shù)量龐大的一個(gè)生物群體，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自然界中噬菌體的總數(shù)可達(dá)1032個(gè)之多[1]。噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，存在于細(xì)菌的各種生存環(huán)境中，它們能感染特定種類的細(xì)菌，并能在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，最終將細(xì)菌殺滅。法國(guó)微生物學(xué)家D'HERELLE F 在1917 年[2]發(fā)現(xiàn)噬菌體后，就將其作為一種天然的抗菌治療方法在全世界推廣，并大范圍應(yīng)用于公共衛(wèi)生領(lǐng)域[3]在1919 年，噬菌體首次被許可用于人類疾病的治療[4]，但二戰(zhàn)后，抗生素的成功應(yīng)用使噬菌體治療的發(fā)展陷入了停滯?？股卦诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的廣泛應(yīng)用，使人類的壽命顯著延長(zhǎng)，細(xì)菌感染也得到了有效控制。但同時(shí)，抗生素的過(guò)度使用也給人類帶來(lái)了細(xì)菌耐藥性、毒副作用和畜產(chǎn)品殘留的問(wèn)題，這些都大大削弱了抗生素的醫(yī)學(xué)價(jià)值。2020年5 月，世界衛(wèi)生組織公布了2020 版的全球抗菌藥物的耐藥性和使用監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（GLASS）報(bào)告[5]，涵蓋了全球66 個(gè)國(guó)家上萬(wàn)個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)顯示，抗生素耐藥的國(guó)家數(shù)量不斷增加，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等在內(nèi)的越來(lái)越多的細(xì)菌感染已產(chǎn)生抗藥性。

衛(wèi)生醫(yī)療系統(tǒng)正面臨來(lái)自抗生素耐藥性的重大威脅，尋求包括噬菌體在內(nèi)的抗生素代替物，又成為了研究的熱點(diǎn)[6-7]。大量的關(guān)于噬菌體治療的隨機(jī)臨床試驗(yàn)初步表明了噬菌體的安全性和效果[8-12]。據(jù)報(bào)道[3,13-15]，目前已有一些純化的噬菌體制劑被安全地用于人類的局部、口服、靜脈和體腔治療。美國(guó)食品藥物管理局（FDA）已批準(zhǔn)食品加工工業(yè)使用噬菌體，作為食用肉類和家禽產(chǎn)品等食品的抗菌添加劑[16]。噬菌體和噬菌體亞成分也被噴灑到人類食品[17]和寵物食品[18]上，或用于控制包裝食品中的食源性細(xì)菌[19]。已有針對(duì)食源性致病菌單核李斯特菌的噬菌體商業(yè)制劑，可用在乳制品工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，從而減少抗生素的使用[20]。這些事實(shí)表明，噬菌體作為處理細(xì)菌污染的生物控制劑，正逐漸被人們所接受。

在本研究中，以大腸桿菌為宿主菌，從生活污水中分離得到的一株烈性大腸桿菌噬菌體，研究其生物學(xué)特性，并對(duì)其殺菌抑菌能力進(jìn)行初步分析，為探索該噬菌體作為大腸桿菌污染的生物控制劑的可行性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 水樣與宿主菌

污水水樣，采樣于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生活區(qū)污水；大腸桿菌（Escherichia coli，CMCC 44102），購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

0.22 μm 無(wú)菌微孔濾膜，德國(guó)Merck Millipore公 司；Amicon Ultra-15 離 心 超 濾 裝 置（15 mL，100 kDa），德國(guó)Merck Millipore 公司；GI54DWS 高溫高壓滅菌鍋，美國(guó)Zealway 公司；320R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich公司；超低溫冰箱，中國(guó)海爾公司，H7650 透射電子顯微鏡，日本Hitachi 公司等。LB 固體培養(yǎng)基、LB 肉湯、瓊脂粉等，均購(gòu)自上海展云化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 污水水樣處理

將取得的污水水樣用定性濾紙進(jìn)行二次抽濾，去除大部分雜質(zhì)與顆粒物。得到樣品濾液約200 mL 收集于無(wú)菌三角瓶中，加入CaCl2至終濃度1 mmol/L，混勻后靜置5 h，以提高水樣中噬菌體的收率[21]。

1.2.2 噬菌體的富集

在水樣中，噬菌體的數(shù)量可能較少而不易發(fā)現(xiàn)。因此，在篩選水樣中是否存在噬菌體時(shí)，需要先進(jìn)行噬菌體的富集培養(yǎng)操作。將“1.2.1”中得到的粗濾液與大腸桿菌的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液混合后，靜置15 min，恒溫?fù)u床120 r/min、36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日將得到的培養(yǎng)液在4 ℃下4 500 r/min 離心20 min，取上層清液，用0.22 μm 的無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾。濾液再加入新鮮的大腸桿菌對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液，并重復(fù)上述操作2 次，最終得到噬菌體的富集濾液。

1.2.3 雙層平板法

以雙層平板法[22]驗(yàn)證噬菌體的富集液中是否存在噬菌體。將噬菌體富集濾液稀釋至適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，取0.1 mL 稀釋液與0.1 mL 的大腸桿菌對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液混合后于36 ℃中保溫15 min。再加入融化好的7 mL 半固體LB 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，隨后迅速倒入提前備好的LB 固體平板上，輕輕晃動(dòng)平板至半固體培養(yǎng)基均勻平鋪于固體平板上。每個(gè)稀釋度平行做3 個(gè)平板。待平板凝固后，36 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。若次日在雙層平板上觀察到噬菌斑，則說(shuō)明水樣中存在大腸桿菌噬菌體。

1.2.4 噬菌體的分離純化

若在雙層平板中觀察到噬菌斑，則用接種針從其上挑取邊緣清晰、透明度高、斑體較大的噬菌斑，接入10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，再加入0.1 mL 大腸桿菌對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液，靜置15 min 后，36 ℃、120 r/min 搖床過(guò)夜培養(yǎng)。次日采用“1.2.3”中的雙層平板法繼續(xù)觀察噬菌斑狀態(tài)，重復(fù)上述步驟直至挑選出大小一致、斑體較大的噬菌斑，即為噬菌體的分離純化。

1.2.5 噬菌體的滴度測(cè)定

噬菌體的滴度，即其效價(jià)，表示每毫升樣品中所有的具有侵染性的噬菌體的個(gè)數(shù)，又稱噬菌斑形成單位數(shù)（Plaque Forming Unit，PFU）。將由“1.2.4”中得到的純化噬菌體原液（以下簡(jiǎn)稱噬原液）稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，0.1 mL 的梯度稀釋液與0.1 mL 的大腸桿菌對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液混合后，采用“1.2.3”中的雙層平板法，在次日通過(guò)計(jì)算平板上的噬菌斑的數(shù)量測(cè)定噬菌體效價(jià)，規(guī)定單個(gè)平板上噬菌斑的數(shù)量在30 ～300 為合理計(jì)數(shù)范圍。

在此研究中，滴度（PFU/mL）按照式（1）計(jì)算：

式（1）中，a、b、c 分別為同個(gè)稀釋梯度的3 個(gè)平行平板上的噬菌斑數(shù)量，n為噬菌體原液的稀釋倍數(shù)。

1.2.6 最佳感染復(fù)數(shù)

感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI），亦稱感染倍數(shù)，其是指在感染時(shí)，噬菌體個(gè)數(shù)與細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的比值，也就是平均每一個(gè)細(xì)菌感染的噬菌體數(shù)量。在培養(yǎng)噬菌體的過(guò)程中，采用不同的噬菌體與宿主菌的比例，即不同的感染復(fù)數(shù)，得到的噬菌體的產(chǎn)率大不相同。因此存在一個(gè)噬菌體的最佳使用量可以獲得最大的裂解效應(yīng)，即為該噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。制備噬菌體原液（1×109PFU/mL）并稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，與大腸桿菌對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液（細(xì)菌細(xì)胞濃度約為1×108CFU/mL）按MOI=1 000、100、10、1、0.1、0.01 和0.001 混合。36 ℃、120 r/min 搖床過(guò)夜培養(yǎng)。次日，收集培養(yǎng)液置于4 ℃下4 500 r/min 離心15 min后，0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾，雙層平板測(cè)定噬菌體滴度，獲得最高滴度的MOI 即為最佳MOI。

1.2.7 噬菌體原液的超濾濃縮

為了在現(xiàn)代電子顯微鏡的高放大倍數(shù)下觀察到噬菌體的病毒顆粒，噬菌體懸液的濃度應(yīng)達(dá)到一定的高濃度（約1×1012PFU/mL）[23]。本研究中采用超濾離心裝置對(duì)噬原液進(jìn)行超濾濃縮，從而獲得高濃度的噬菌體懸液用于電鏡形態(tài)觀察。向經(jīng)過(guò)預(yù)清洗的超濾離心裝置加入10 mL 的噬菌體原液，置于4 ℃低溫冷凍離心機(jī)中，使濾膜面板朝上放置裝置，5 000 g離心15 min。離心后，立即用200 μL 槍頭置于濾膜面板中回收超濾濃縮液，小心左右搖擺著吸取樣本，以確保完全回收。噬菌體超濾液保存在1.5 mL 凍存管中，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.8 噬菌體電子顯微鏡下的形態(tài)觀察

參考文獻(xiàn)[24]，采用磷鎢酸負(fù)染色法。取20 μL噬菌體濃縮液（約1×1012PFU/mL）滴加于覆有聚醋酸甲基乙烯酯（Formvar）膜的銅網(wǎng)（300 目）上，自然沉淀15 min 左右，濾紙從邊緣吸取多余剩余液體，自然風(fēng)干，用2%磷鎢酸染液（PTA，pH7.0），負(fù)染5 min 后吸去多余液體，自然干燥。在加速電壓為80 kV 的條件下于透射電子顯微鏡中觀察噬菌體形態(tài)，并拍照記錄。

1.2.9 固體培養(yǎng)基上殺菌抑菌能力測(cè)試

參考藥敏試驗(yàn)中的濾紙片法，在LB 平板上，采用傾注法接種大腸桿菌。在已接種且凝固的平板上放入浸泡過(guò)噬原液（約1×109PFU/mL）的無(wú)菌濾紙片，注意紙片間距。置于36 ℃恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。

1.2.10 液體培養(yǎng)基中殺菌抑菌效果評(píng)估

培養(yǎng)獲得新鮮噬原液（約1×109PFU/mL）按最佳MOI 與大腸桿菌對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液混合為實(shí)驗(yàn)組，并建立無(wú)噬菌體的陰性對(duì)照管。靜置15 min 后，36 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)12 h。每隔30 min，取4 mL 混合培養(yǎng)液，以滅菌的LB 液體培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)其600 nm 處OD 值。平行重復(fù)3 次測(cè)得其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體分離純化結(jié)果及滴度效價(jià)

多次取樣并進(jìn)行噬菌體富集操作后，雙層平板法驗(yàn)證水樣中存在大腸桿菌噬菌體，經(jīng)分離純化，得到一株大腸桿菌噬菌體，命名為EW3-f4。噬菌體EW3-f4 的噬菌斑如圖1 所示，斑體透明，邊緣清晰，大小為0.7 ～1.3 mm。其滴度為1.58×109PFU/mL。

圖1 噬菌體EW3-f4 在雙層平板上的噬菌斑

2.2 最佳感染復(fù)數(shù)

以MOI 為橫坐標(biāo)，以噬菌體EW3-f4 相應(yīng)滴度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖，得到圖2 曲線。如圖2 中曲線所示，噬菌體的最佳MOI 值為0.1。

圖2 噬菌體EW3-f4 的最佳MOI

2.3 噬菌體形態(tài)觀察

經(jīng)超濾濃縮的噬菌體原液的滴度達(dá)到了1×1012PFU/mL，用負(fù)染色法在透射電子顯微鏡下觀察到噬菌體EW3-f4 的形態(tài)如圖3 所示。噬菌體EW3-f4有一個(gè)中等長(zhǎng)度的多面體頭部（105 nm×92 nm），其中隱約可見(jiàn)環(huán)狀的核酸，尾部是一個(gè)可收縮的結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度約為103 nm，未觀察到明顯的尾絲結(jié)構(gòu)。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的第九次報(bào)告[25]和文獻(xiàn)[26]，該噬菌體的結(jié)構(gòu)與A2 形態(tài)類的噬菌體的描述相符合，屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）。

圖3 噬菌體EW3-f4 在透射電子顯微鏡下的形態(tài)

2.4 固體培養(yǎng)基上抑菌能力測(cè)試

培養(yǎng)后未經(jīng)稀釋的噬菌體EW3-f4 原液（1×109PFU/mL），在固體培養(yǎng)基上的抑菌效果如圖4 所示，可見(jiàn)明顯、清晰的抑菌圈，抑菌圈a、b、c、d 的直徑分別為11 mm、9 mm、9 mm、10 mm，平均抑菌圈直徑為9.75 mm。

圖4 大腸桿菌噬菌體EW3-f4 在固體培養(yǎng)基上的抑菌效果

2.5 液體培養(yǎng)基中抑菌效果評(píng)估

噬菌體EW3-f4 在液體培養(yǎng)基中對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制情況如圖5 所示。在0 ～3 h 之內(nèi)，含噬菌體的實(shí)驗(yàn)組的OD 值與陰性對(duì)照組的OD 值數(shù)值和趨勢(shì)相近，而從第3 h 開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組的OD 值開(kāi)始下降，在7 h 左右達(dá)到最低值，隨后開(kāi)始逐漸上升，在12 h時(shí)接近但仍然低于對(duì)照組的OD 值。結(jié)合對(duì)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液的觀察，可能是由于液體培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞碎片的增加使溶液的OD 值增加。

圖5 大腸桿菌噬菌體EW3-f4 在液體培養(yǎng)基中的抑菌情況

3 討論與結(jié)論

與噬菌體相比，抗生素是一種只能選擇性破壞細(xì)菌某些生理過(guò)程（如蛋白質(zhì)或細(xì)胞壁合成）的化學(xué)物質(zhì)。噬菌體療法則直接針對(duì)致病菌，用特異性強(qiáng)的噬菌體作為治療抗菌劑，會(huì)大大減少對(duì)微生物群體的破壞。關(guān)鍵的是，無(wú)論宿主是否對(duì)多種抗生素具有耐藥性，噬菌體都可以感染并殺死它們。這是因?yàn)榧?xì)菌的抗生素耐藥性和其對(duì)噬菌體敏感性在很大程度上是無(wú)關(guān)的[27]，即使是耐藥菌對(duì)噬菌體的也同樣敏感。事實(shí)上，2017 年臺(tái)灣的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[28]，耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌比對(duì)抗生素敏感的細(xì)菌更容易被噬菌體殺死。

本研究以在生活和實(shí)驗(yàn)室中較為常見(jiàn)的大腸桿菌為宿主菌，從生活污水中分離純化得到一株針對(duì)大腸桿菌的噬菌體，命名為EW3-f4。從環(huán)境中采集的水樣中分離噬菌體時(shí)，可能會(huì)因?yàn)槭删w的數(shù)量較少而不易發(fā)現(xiàn)。因此在噬菌體分離前期，參考文獻(xiàn)[21]方法往污水水樣中加入一定濃度的Ca2+，在一定程度上促進(jìn)噬菌體的吸附和裂解，從而提高噬菌體的收率。經(jīng)過(guò)3 次的富集培養(yǎng)，就可以通過(guò)雙層平板法，用肉眼觀察噬菌斑來(lái)驗(yàn)證噬菌體的存在。在本研究中，大腸桿菌噬菌體EW3-f4 是一株烈性噬菌體，在雙層平板培養(yǎng)基上形成的噬菌斑體透明，邊緣清晰，直徑大小為0.7 ～1.3 mm，其過(guò)夜培養(yǎng)的滴度為1.58×109PFU/mL，最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1，較為容易得到高滴度的培養(yǎng)液且有較高的感染效率。為了對(duì)噬菌體EW3-f4 進(jìn)行形態(tài)觀察，通過(guò)超濾法濃縮噬菌體原液，進(jìn)行透射電鏡觀察。在電鏡照片中可以看到，噬菌體EW3-f4 的形態(tài)屬于復(fù)合對(duì)稱，有多面體的頭部（105 nm×92 nm）和可收縮的尾部（103 nm），屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae family）的A2 形態(tài)類的噬菌體[25-26]。

獲得大腸桿菌噬菌體EW3-f4 的基本信息后，對(duì)其的殺菌抑菌作用進(jìn)行了初步探索。噬菌體EW3-f4原液在固體培養(yǎng)基上可以獲得明顯清晰的抑菌圈，平均直徑為9.75 mm。在液體培養(yǎng)基中，以未加入噬菌體的大腸桿菌培養(yǎng)為對(duì)照，通過(guò)OD 值來(lái)觀察噬菌體EW3-f4 的抑菌效果，結(jié)果表明EW3-f4 從第3 h 開(kāi)始出現(xiàn)明顯的抑菌效果，在7 h 左右，抑菌效果達(dá)到峰值，此處OD 值接近0 h 時(shí)的OD 值，肉眼觀察到此時(shí)培養(yǎng)液接近澄清的狀態(tài)，后期雖然OD 值又逐漸升高，但結(jié)合對(duì)培養(yǎng)液的觀察，可能是由于培養(yǎng)液中大量的細(xì)菌碎片所導(dǎo)致的OD 值增加。綜上所述，噬菌體EW3-f4 在抑菌作用方面的表現(xiàn)，值得針對(duì)其作為大腸桿菌污染的生物控制劑的潛在能力，進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用性研究。

噬菌體的遺傳多樣性、豐富性和普遍性，讓噬菌體療法可以通過(guò)不同的方法進(jìn)行。噬菌體制劑是禁抗、限抗、替抗、無(wú)抗的最有潛力的替補(bǔ)，與疫苗和微生態(tài)制劑一樣，是更具生態(tài)特點(diǎn)的“新藥物”，它打破了人們因抗生素顯著的化學(xué)特性而形成對(duì)“藥物”的思維定勢(shì)。因此，建立和擴(kuò)大噬菌體收集，優(yōu)化快速篩選感染用噬菌體的方法，以及全面了解噬菌體制劑的治療和應(yīng)用實(shí)踐將會(huì)非常重要。