孫晶瑩 封 青 李 研 霍雪萍 孫麗君

陜西省人民醫(yī)院中心實驗室，陜西西安，710068

白癜風(fēng)是皮膚黑素脫失后白斑為主要表現(xiàn)的皮膚性疾病，目前該疾病發(fā)病機制尚不明確，但該疾病和人體自身免疫力及遺傳因素有一定關(guān)系[1,2]。導(dǎo)致白癜風(fēng)的主要原因是人體黑素細胞遭到破壞，細胞中黑素顆粒不斷減少，進而引起皮膚斑片狀色素脫失。近年來的研究表明，窄譜中波紫外線(narrow bound ultraviolet B light, NB-UVB)在臨床上治療白癜風(fēng)具有較好療效，其可促進黑素細胞黑素的合成和增加酪氨酸酶活性，從而有效緩解白癜風(fēng)癥狀[3-5]，但其具體機制仍不清楚。

本研究使用上海西格瑪公司生產(chǎn)的SS型紫外線光療儀，波長為311～313 nm，該波段的紫外線光毒性小，色素恢復(fù)較一致，色差小，療效好。用此光療儀作用黑素細胞，研究不同劑量的紫外線照射對黑素細胞的細胞活性、黑素含量以及黑素合成相關(guān)基因表達的影響，探討NB-UVB對黑素合成的影響及在白癜風(fēng)復(fù)色中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 人來源的傳代穩(wěn)定的黑素細胞系PIG1，由芝加哥洛約拉大學(xué)Caroline Le Poole教授惠贈。黑素細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基Medium 254及培養(yǎng)基添加劑HMGS-2 均購自Gibco公司; 胎牛血清購于Hyclone 公司; RNA 提取試劑盒購自AG公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript RT reagent kit、熒光PCR酶SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit均購自TaKaRa公司，引物由上海生工合成; Tyr、Tyrp2、GPNMB、MART-1抗體均購于Abcam公司，Syntenin抗體購自proteintech，β-actin、HRP羊抗鼠、HRP羊抗兔購于康為試劑，NC膜購自Pall Corporation公司。

1.1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱購于Heraeus公司; 核酸測定儀Nanodrop2000c和冷凍高速離心機均購于Thermo Scientific公司;倒置熒光顯微鏡購于Olympus公司;熒光PCR儀7500 購于ABI公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購于BIO-RAD，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech，紫外光療儀SS-03B型光療儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司，波長311 nm)。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞的培養(yǎng) 液氮罐中凍存的PIG1細胞37℃復(fù)蘇，待完全融化后1200 rpm離心5 min，在超凈工作臺中棄掉凍存液上清，將細胞重懸于含8%胎牛血清及HMGS-2因子的M254培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，細胞貼壁后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 UVB照射 將PIG1細胞按每皿6×105/mL的量接種于直徑35 mm細胞培養(yǎng)皿上，于37℃，5%細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，1×PBS洗滌1次，加入少量1×PBS，采用紫外線光療儀以不同的時間照射PIG1細胞，照射時間以及對應(yīng)的輻照劑量見表1，照射完畢后棄掉PBS，加入2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)置未照射組用于對照。

表1 不同照射時間對應(yīng)的輻照劑量

1.2.3 MTT法檢測細胞活力的變化 收集對數(shù)生長期細胞，制成細胞懸液，按細胞濃度2×103個/孔接種細胞于96孔板，培養(yǎng)過夜后，分別以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)不同UVB劑量照射處理細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，24 h后每孔加入20 μL MTT溶液，37℃孵育4 h；去除上清后每孔加入100 μL DMSO溶解細胞，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.4 NaOH裂解法測定黑素含量 根據(jù)1.2.3中篩選的紫外線照射劑量，選擇400、800、1200 mJ/cm2劑量進行照射。黑素含量的測定：UVB相應(yīng)劑量處理細胞48 h后，0.25%胰酶消化，離心后去上清，PBS清洗兩次，用PBS重懸后細胞計數(shù)，每個管中加入200 μL濃度為1M NaOH(含100 g/L的DMSO)，80℃水浴鍋作用2 h，利用酶標(biāo)儀檢測A475的吸光值。

1.2.5 RT-PCR方法檢測黑素合成相關(guān)基因的表達 將處于對數(shù)生長期的黑素細胞消化重懸至6孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜，初始細胞數(shù)為3×105個/孔。UVB 1200 mJ/cm2劑量處理細胞，分別于24 h后收集細胞，采用RNA抽提試劑盒提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以上述cDNA為模板，擴增Tyr、Tyrp1、Tyrp2、OA1、MART-1、Pmel17、VAT-1、OCSP、syntenin、CHCHD3、flotillin-1、GPNMB 12個黑素合成相關(guān)基因以及內(nèi)參β-actin基因，計算各個基因的相對表達量。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，序列見表2。

表2 引物序列表

1.2.6 Western blot方法檢測黑素合成相關(guān)蛋白的表達 將處于對數(shù)生長期的黑素細胞消化重懸至6孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜，初始細胞數(shù)為3×105個/孔。UVB 1200 mJ/cm2劑量處理細胞，于48 h后收集細胞，細胞裂解液(含RIPA)提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，加入2×上樣緩沖液混合加熱變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后，將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)至NC膜上，200 mA 2 h濕轉(zhuǎn)，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃搖床振蕩過夜孵育一抗，PBST洗3次，5 min/次，室溫孵育二抗45 min，PBST洗3次，5 min/次，凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的條帶。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射不同劑量對細胞活性的影響 培養(yǎng)黑素細胞，分別以400、800、1200、1600、2000(mJ/cm2)的不同UVB照射劑量處理細胞，24 h后MTT檢測細胞活力的變化。結(jié)果顯示400、800和1200 mJ/cm2三組照射劑量對細胞活力影響不大，可以作為后續(xù)實驗的選擇，而輻射強度>1200 mJ/cm2時，細胞活性明顯下降(圖1)。

圖1 紫外線照射不同劑量對細胞活性的影響

2.2 紫外線照射對黑素合成的影響 分別選擇400、800、1200 mJ/cm2三個不同的紫外照射劑量處理PIGI細胞，48 h后檢測不同處理組的黑素含量，結(jié)果顯示隨著照射劑量的增加，黑素含量增加，與對照組相比，800、1200 mJ/cm2照射劑量的細胞黑素含量明顯升高，表明紫外線照射增加了黑素合成(圖2)。

2.3 紫外線照射對黑素合成相關(guān)基因的影響 選擇UVB劑量1200 mJ/cm2處理黑素細胞，24 h后收細胞，RT-PCR檢測12種黑素合成相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示，紫外線照射后，tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB這五種基因的表達顯著升高，有顯著差異(P<0.05)，見圖3。

(*表示與對照組相比，P<0.05)

圖3 紫外線照射對黑素合成相關(guān)基因表達的影響(*P<0.05) 圖4 紫外線照射對黑素合成相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 紫外線照射對黑素合成相關(guān)蛋白的影響 根據(jù)2.3的RT-PCR檢測結(jié)果， western blot檢測tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，紫外線照射48 h后，tyr、tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

黑素細胞是位于表皮基底層(皮膚的最外層)的特化細胞[6]，其新陳代謝是一個精確調(diào)控的生物學(xué)行為，受到外環(huán)境(紫外線等)和內(nèi)環(huán)境(細胞間相互作用等)的共同影響[7]。黑素的合成在黑素細胞內(nèi)進行，黑素細胞上有光受體，紫外線照射能引起黑素細胞的黑素合成，因此當(dāng)皮膚受到紫外線照射或體內(nèi)激素發(fā)生變化時，局部皮膚黑素細胞產(chǎn)生的黑素量增加，從而在皮膚上發(fā)生色素沉著。

目前已知有12種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是黑素體特異性蛋白，分別是Tyr(tyrosinase)、Tyrp1(tyrosinase-related protein 1)、Tyrp2(tyrosinase-related protein 2)、OA1(ocular albinism type 1 protein)、MART-1、gp100/Pmel17、VAT-1(vesicle amine transport protein 1 homolog)、OCSP(oculospanin)、syntenin、FLJ20420或稱CHCHD3、flotillin-1/2和GPNMB (Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b)[8]。這些黑素體特異蛋白按照其特性及功能大致可以分為三大類：酶組分、結(jié)構(gòu)組分和未知組分。Tyr、Tyrp1和Tyrp2是黑素形成中具有關(guān)鍵作用的酶組分，其在黑素合成中的功能已較為清楚，而在黑素體結(jié)構(gòu)蛋白中，Pmel17是迄今為止唯一被證明參與黑素體中纖維狀結(jié)構(gòu)形成的蛋白[9]。GPNMB也是一種黑素小體特異性結(jié)構(gòu)蛋白，它與Pmel17/gp100在結(jié)構(gòu)上高度相似，在各個時期的黑素小體中都有表達[10,11]。

本研究以這12種黑素體蛋白為檢測對象，明確紫外線照射對這12種黑素體蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫外線照射細胞后，RT-PCR方法檢測到Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB這5種蛋白的基因表達明顯升高，western blot檢測結(jié)果進一步證實了Tyr、Tyrp2、MART-1、syntenin、GPNMB的蛋白表達升高。Tyr、Tyrp2被UVB上調(diào)的結(jié)果已經(jīng)在很多既往研究里面被證實[12]；另外張萍研究發(fā)現(xiàn)GPNMB也可以被UVB上調(diào)[13]；syntenin和MART-1被上調(diào)的現(xiàn)象在我們的研究中首次被報道。同時我們發(fā)現(xiàn)GPNMB和Pmel17雖同為黑素體的結(jié)構(gòu)蛋白且氨基酸序列高度同源，UVB照射極大的促進GPNMB基因的表達，但是對Pmel17基因的影響并不明顯，分析原因可能是由于Pmel17的PKD結(jié)構(gòu)域和 RPT結(jié)構(gòu)域的獨特性導(dǎo)致UVB對兩者產(chǎn)生不同的變化。MART-1蛋白是黑素體成熟所必需的，Syntenin蛋白對黑素合成的影響在我們之前的研究中也已經(jīng)明確[14]，UVB對這兩種蛋白表達的上調(diào)也進一步驗證了其在黑素合成中的重要作用。

紫外線照射可以造成色素沉著，但是過量的紫外線又會損傷黑素細胞，影響細胞活性。本研究發(fā)現(xiàn)輻射強度>1200 mJ/cm2UVB時，細胞活性明顯下降。本研究為UVB治療白癜風(fēng)時照射劑量的選擇及白癜風(fēng)復(fù)色的機制探討提供了依據(jù)。