任曉蕾，莊巖，劉華石，霍金海（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，哈爾濱 150036）

風(fēng)訶止咳顆粒為本院獨立自主知識產(chǎn)權(quán)的中藥產(chǎn)品，以本院臨床使用多年的治療咳喘的醫(yī)院制劑為基礎(chǔ)，由防風(fēng)、訶子、梔子、山楂、甘草等8 味中藥組成，具有止咳、平喘、化痰、利咽之功效，對痰內(nèi)伏于肺引起的咳嗽、咳吐不利、痰黏難出、呼吸急促、喉間哮鳴、咽痛等癥狀均有顯著療效。為了對制劑質(zhì)量進行控制，本研究建立風(fēng)訶止咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法（TLC）對制劑中訶子、梔子、山楂、甘草進行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定制劑防風(fēng)藥材中升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素的含量，提高原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為開發(fā)治療咽痛咳喘的中藥新藥風(fēng)訶止咳顆粒奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀、Waters 2489 型紫外檢測器（美國沃特世），KQ-300DB 超聲清洗機（昆山超聲儀器有限公司），BP211D 型電子天平（德國Sartorius 公司），HWS26 型水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

甘草對照藥材（批號：120904-201519，中國食品藥品檢定研究院）；訶子（批號：DZYC-K-003）、山楂（批號：DZYC-S-022）對照藥材（成都彼斯特生物科技有限公司）；甘草苷（批號：G-009-161230）、梔子苷（批號：RFS-Z00311802022）、升麻苷（批號：S-004-150421）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：J-002-150420）、升麻素（批號：S-007-150421）、亥茅酚苷（批號：H-027-150915）、花椒毒素（批號：H-035-150729）（對照品，純度＞98%，成都彼斯特生物科技有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇為色譜純（德國默克），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 訶子的薄層鑒別[1-2]

取本品8 g，加無水乙醇30 mL，超聲處理30 min（功率250 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含訶子藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末8 g，同法制成陰性樣品溶液。另取訶子對照藥材1 g，同法制備對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述2 種溶液10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點（見圖1）。

圖1 訶子薄層色譜Fig 1 TLC chromatogram of Terminalia chebula Retz.

2.2 甘草的薄層鑒別[3-5]

取本品10 g，加乙醚60 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去乙醚液，殘渣加甲醇60 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL 使溶解，以正丁醇震搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3 次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加5 mL 甲醇使溶解，置中性氧化鋁柱（100～200 目，15 g，內(nèi)徑為1.5 cm），用40%甲醇150 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含甘草藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每l mL 含2 mg 的溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液、甘草對照藥材、甘草對照品溶液上述4 種溶液各10 μL，對照品溶液5 μL 分別點于同一塊硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點（見圖2）。

圖2 甘草薄層色譜Fig 2 TLC chromatogram of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

2.3 梔子的薄層鑒別

取本品10 g，加50%甲醇25 mL，超聲處理40 min（功率250 W，頻率40 kHz），濾過，取濾液作為供試品溶液。按處方制備不含梔子藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。取梔子對照藥材l g，同法制成對照藥材溶液。另取梔子苷對照品，加乙醇制成每1 mL 含4 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，結(jié)果見圖3。

圖3 梔子薄層色譜Fig 3 TLC chromatogram of Gardenia jasminoides Elli

2.4 山楂的薄層鑒別

取本品10 g，加水60 mL，加熱回流2.5 h，濾過蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按處方制備不含山楂藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末10 g，同法制成陰性樣品溶液。取梔子對照藥材l g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 板，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（5∶2.5∶6）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液，在105℃加熱，至呈紫紅斑點，結(jié)果見圖4。

圖4 山楂薄層色譜Fig 4 TLC chromatogram of Crataegus pinnatifida Bge.

2.5 HPLC 法測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以水為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～15 min，65%A；15～25 min，65%～45%A；25～35 min，45%A；35～40 min，45%A）；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；流速1.0 mg·mL－1；進樣量10 μL。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、花椒毒素，加甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為4000、2800、640、720、80 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品和陰性樣品溶液的制備 取本品粉末1 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱定重量，回流提取40 min，取出，放至室溫，稱重，以甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按處方制備不含防風(fēng)藥材的陰性樣品，取該陰性樣品粉末1 g，同法制成陰性樣品溶液。

2.5.4 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.5.1”項色譜條件下，5 種成分能較好分離，且陰性樣品溶液無干擾，結(jié)果見圖5。

圖5 風(fēng)訶止咳顆粒的高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of 5 batches of Fenghe zhike granules

2.5.5 線性關(guān)系考察 按“2.5.2”項下方法配制混合對照品溶液，升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷、花椒毒素的系列質(zhì)量濃度作為線性溶液，在“2.5.1”項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，進行回歸分析，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 線性關(guān)系Tab 1 Linearity

2.5.6 精密度試驗 取“2.5.3”項下供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，以峰面積計算升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素的RSD值分別為0.48%、1.4%、1.1%、0.90%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗 取本品6 份，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD分別為0.73%、1.6%、1.0%、0.85%、1.8%，結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 測定峰面積，結(jié)果升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素RSD值分別為0.20%、0.46%、1.4%、0.85%、2.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.9 加樣回收試驗 取已知含量樣品6 份，按含量1∶1，分別精密加入升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素對照品溶液，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項條件下測定，計算平均回收率分別為96.8%、97.9%、95.1%、96.5%、95.8%，RSD值分別為2.2%、2.0%、1.3%、2.7%、2.7%。

2.6 樣品含量測定

取3 批樣品精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，計算樣品含量，升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷及花椒毒素平均含量分別為0.88、0.21、0.03、0.09及0.0067 mg·g－1。

3 討論

3.1 制劑中訶子薄層研究

預(yù)試驗按照2020年版《中國藥典》一部訶子項下薄層條件，以甲苯-冰醋酸-水（12∶10∶0.4）為展開劑，分別于日光及紫外365 nm 下檢視，特征斑點不明顯且陰性樣品有干擾；經(jīng)摸索將展開劑調(diào)整為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶2∶1），噴以10%硫酸乙醇溶液，對照藥材主斑點顯色清晰Rf值適中，供試品溶液相應(yīng)位置斑點達到較好分離且陰性樣品無干擾。

3.2 制劑中甘草薄層研究

前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中甘草藥材的薄層鑒別方法較難除去背景干擾，采用正丁醇提取后上中性氧化鋁柱，對照藥材、對照品及供試品色譜相應(yīng)位置顯相同亮黃色特異性斑點且陰性樣品無干擾，分離度好且Rf值適中，方法簡便易操作且，專屬性強，可供其他復(fù)方中甘草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

3.3 制劑中防風(fēng)成分相關(guān)研究

防風(fēng)通過其疏風(fēng)解表之功達清熱利咽之效，宣肺散風(fēng)止咳。升麻苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷具有顯著的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗凝作用，亥茅酚苷也具有一定的鎮(zhèn)痛作用[6-8]。李悅悅等[9-10]通過RRLC-TOF/MS 分析防風(fēng)入血、尿液成分發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)中含量高的升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷入血量很少，反而在血漿和尿液中含量最高的成分是升麻素，推測升麻素為防風(fēng)主要代謝形式，升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷等苷類物質(zhì)主要轉(zhuǎn)化為升麻素（苷元）后才能入血被吸收，因此升麻素在防風(fēng)藥效發(fā)揮中的作用也相當(dāng)重要，對其含量測定具有一定意義?；ń范舅厥欠里L(fēng)香豆素類化合物中的一種，具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗凝、止血、祛痰等作用，在防風(fēng)主要功效的發(fā)揮中也有一定作用，因此對以上5種成分進行含量測定。

本文針對所有藥材建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層及液相色譜針對每味藥材進行質(zhì)量控制，以提高復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。