鄭元青，何風(fēng)艷，張鵬，龔云*（.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 4000；.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 00050）

千斤拔始載于《植物名實(shí)圖考》，其性味甘、溫，具有祛風(fēng)濕、益脾腎，強(qiáng)筋骨之功效，主要用于治療風(fēng)濕骨痛、腰肌勞損、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)和白帶多等婦科疾病[1-2]。2015年版《中國(guó)藥典》四部收載其植物來(lái)源包含蔓性千斤拔Moghaniaphilippinessis（Merr.et Rolfe）Li、大葉千斤拔Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze 和繡毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li的干燥根[3]，其中繡毛千斤拔在國(guó)內(nèi)分布較少，且未形成大宗商品[4]。在2009年版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中收載了千斤拔（蔓性千斤拔）FlenmingiaphilippinessisMerr.et Rolfe 的干燥根和大葉千斤拔F.macrophylla（Willd.）Prain 的干燥根和莖[5]，是中藥材千斤拔的主要來(lái)源。按照一品一標(biāo)的原則，本文對(duì)大葉千斤拔的性狀、鑒別、檢查、含量等質(zhì)量情況進(jìn)行深入研究。

婦科千金片/膠囊是千金藥業(yè)自主開(kāi)發(fā)并獨(dú)家生產(chǎn)的純中藥制劑，占有婦科炎癥類(lèi)口服中成藥20%的市場(chǎng)份額，其中千斤拔為其君藥。黃酮類(lèi)化合物是千斤拔中所含的主要成分類(lèi)型[6-9]，代表性成分為染料木苷（genistin）和染料木素（genistein），兩者均具有較強(qiáng)的抗氧化、類(lèi)激素、抗菌、抗癌和保護(hù)心血管等主要作用[10-17]。千斤拔作為中成藥婦科千金片、婦科千金膠囊、金雞膠囊等的君藥，在治療婦科疾病和風(fēng)濕病方面正是這類(lèi)化學(xué)成分起著類(lèi)激素作用和抗炎、抗氧化作用。因此，本文在湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，以婦科千金片/膠囊中的君藥大葉千斤拔為研究對(duì)象，新增以染料木苷為對(duì)照品的薄層色譜（TLC）及高效液相色譜（HPLC）定性和定量檢測(cè)方法，補(bǔ)充安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)，從建立性狀、顯微鑒別、薄層色譜、水分、總灰分、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留、重金屬及有害物質(zhì)、黃曲霉毒素、浸出物、特征圖譜和含量測(cè)定各項(xiàng)研究方法，為大葉千斤拔的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)提供基礎(chǔ)，為保障千斤拔藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695 高效液相色譜儀（Waters），Agilent 1260-6410B LC-MS 聯(lián)用系統(tǒng)（Agilent），Mettler AE240、Mettler XS105DU 電子天平（梅特勒-托利多），KQ-300DA 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz），TGL-16G 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；CAMAG Linomat V 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、CAMAGReprostar 3 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士瑪卡）。BX43 型生物顯微鏡（日本 Olympus 公司）；DHG-9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）；SX2-4-10 型電阻爐（長(zhǎng)沙市華光電爐廠）；iCAPRQ 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)熱電公司）；AFS830a 原子熒光光譜儀（中國(guó)吉天公司）。

1.2 試藥

染料木苷對(duì)照品（批號(hào)：111709-201702，含量以99.9%計(jì)）及蔓性千斤拔對(duì)照藥材（批號(hào)：121502-200802）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙酸（分析純）、聚酰胺薄膜（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、冰醋酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）；水為ddH2O。

藥材均經(jīng)千金藥業(yè)QC 主管丁小明鑒定，其中大葉千斤拔[Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze]15 批，蔓性千斤拔[Moghania philippinessisMerr.et Rolfe Li]1 批，繡毛千斤拔[Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.）Li]1批，山豆根（Sophoratonkinensis Gagnep）1 批，藥用部位均為根（見(jiàn)表1）。

表1 樣品來(lái)源Tab 1 Sample source

2 方法與結(jié)果

2.1 大葉千斤拔根的性狀

根據(jù)樣品實(shí)際情況并參照各地方標(biāo)準(zhǔn)描述，根有多數(shù)分支，根頭部常呈結(jié)節(jié)狀膨大，長(zhǎng)5～10 cm，直徑0.5～8.0 cm；表面灰棕色或紅棕色，有細(xì)縱紋及橫長(zhǎng)皮孔樣斑痕；質(zhì)硬，不易折斷；切面皮部薄，棕紅色；木部淡紅色，具放射狀紋理；微具豆腥氣，味微甘澀。

圖1 大葉千斤拔根Fig 1 Roots of Moghania macrophylla（Willd.）O.Kuntze

2.2 根橫切面顯微特征

大葉千斤拔根橫切面特征如下：

① 木栓層由數(shù)列木栓細(xì)胞組成。② 皮層具數(shù)列橢圓形薄壁細(xì)胞。③ 韌皮部纖維成束或散在，壁厚，微木化；分泌細(xì)胞單個(gè)散在或數(shù)個(gè)成群存在，內(nèi)含黃棕色或紅棕色物；韌皮射線明顯。④ 形成層明顯。⑤ 木質(zhì)部導(dǎo)管單個(gè)散在或數(shù)個(gè)相連，徑向排列；木纖維成片，壁厚，木化；木射線寬1～5 列細(xì)胞；薄壁細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣方晶、淀粉粒和黃棕色物。具體見(jiàn)圖2。

圖2 根橫切面特征圖Fig 2 Microscopic characteristics of roots

2.3 TLC 鑒別

取樣品粗粉約1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，取濾液，作為供試品。另取染料木苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液1 μL、供試品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以36%乙酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)加熱1 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且大葉千斤拔與偽品山豆根的色譜有明顯區(qū)別，詳見(jiàn)圖3。

圖3 千斤拔薄層色譜圖Fig 3 TLC chromatogram of Moghania macrophylla

2.4 水分

按 2015年版《中國(guó)藥典》四部水分測(cè)定法[3]項(xiàng)下方法測(cè)定樣品水分。結(jié)果表明，15 批樣品水分在 8.02%～9.72%（見(jiàn)表2），故擬訂大葉千斤拔含水分不得過(guò) 12%。

表2 大葉千斤拔各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab 2 Determination of Moghania macrophylla

2.5 總灰分

按 2015年版《中國(guó)藥典》四部總灰分測(cè)定法[3]測(cè)定樣品灰分。結(jié)果表明，15 批樣品總灰分在1.67%～4.68%（見(jiàn)表2），故擬訂大葉總灰分不得過(guò) 6.0%。

2.6 浸出物

按 2015年版《中國(guó)藥典》四部醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法[3]測(cè)定樣品浸出物。結(jié)果表明，15 批樣品浸出物在 8.76%～16.33%（見(jiàn)表2），均值下浮 20%為10.3%，故擬訂大葉千斤拔浸出物不得少于10%。

2.7 重金屬及有害物質(zhì)

按照2015年版《中國(guó)藥典》四部鉛、鎘、砷、汞、銅的測(cè)定法[3]測(cè)定樣品重金屬及有害物質(zhì)。結(jié)果表明，15 批樣品鉛在0.24%～0.94%，鎘在0.023%～0.060%，砷在0.10%～0.14%，汞在0.0024%～0.0052%，銅在3.37%～6.40%。參考2015年版《中國(guó)藥典》一部甘草、白芍、西洋參等品種項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定，擬訂大葉千斤拔重金屬及有害物質(zhì)的限度：鉛不得過(guò)5 mg·kg－1，鎘不得過(guò)1 mg·kg－1，砷不得過(guò)2 mg·kg－1，汞不得過(guò)0.2 mg·kg－1，銅不得過(guò)20 mg·kg－1。

2.8 有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥殘留

按照2015年版《中國(guó)藥典》四部農(nóng)藥殘留量測(cè)定法項(xiàng)下第一法[3]測(cè)定樣品有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)業(yè)殘留。結(jié)果表明，15 批樣品總六六六、總滴滴涕、五氯硝基苯均為0。

2.9 黃曲霉毒素

按照2015年版《中國(guó)藥典》四部黃曲霉毒素測(cè)定法項(xiàng)下的第二法[3]測(cè)定樣品。結(jié)果表明，15批樣品黃曲霉毒素濃度在0～3.79 μg·kg－1。參考2015年版《中國(guó)藥典》一部大棗、肉豆蔻等品種項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定，擬訂大葉千斤拔黃曲霉毒素的限度：每1000 g 含黃曲霉毒素B1不得過(guò)5 μg，黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1總量不得過(guò)10 μg。

2.10 含量測(cè)定

2.10.1 對(duì)照品溶液的制備 取染料木苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL 含染料木苷46 μg 的溶液，即得。

2.10.2 供試品溶液的制備 取樣品，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，稱取粉末約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，補(bǔ)重，搖勻，6000 r·min－1離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.10.3 色譜條件 采用 Agilent Zorbax SBphenyl 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5% 乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%→20%A；20～40 min，20%→30%A；40～60 min，30%→50%A；60～80 min，50%→70%A；80～90 min，70%→90%A），流速1.0 mL·min－1，柱溫 30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。理論板數(shù)按染料木苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.10.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。典型色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 千斤拔高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of Moghania macrophylla

2.10.5 方法學(xué)驗(yàn)證

① 線性關(guān)系考察：取染料木苷對(duì)照品溶液，分別配制成5、10、20、40、64、80 μg·mL－1，進(jìn)樣體積為10 μL，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，線性范圍0.05～0.80 ng，回歸方程Y＝6×106X－2.679×104，相關(guān)系數(shù)0.9999，表明線性關(guān)系良好。

② 精密度試驗(yàn)：取“2.10.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，染料木苷峰面積的RSD為0.5%，表明方法精密度良好。

③ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積，染料木苷峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

④ 重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密稱取同一千斤拔樣品6 份，按“2.10.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得染料木苷平均含量為1.30 mg·g－1，RSD為2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

⑤ 加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知成分含量的千斤拔樣品0.5 g，精密加入0.02 mg·mL－1染料木苷對(duì)照品溶液25 mL，按“2.10.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果染料木苷的平均回收率分別為96.7%，RSD為1.3%，符合要求。

⑥ 耐用性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，采用3種高效液相色譜儀、3 根不同品牌的苯基柱進(jìn)行測(cè)定，染料木苷含量的RSD為1.5%，表明方法的耐用性較好。

2.10.6 樣品測(cè)定 取15 批樣品各適量，參照文獻(xiàn)方法[18]檢測(cè)樣品含量。結(jié)果染料木苷的平均含量為 0.06%，以該值下調(diào) 20%則為 0.048%，故擬訂本品含染料木苷含量不得少于 0.04%。

3 討論

目前，千斤拔藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未收錄至《中國(guó)藥典》，在云南、廣西、湖南等省的地方標(biāo)準(zhǔn)中僅體現(xiàn)為性狀、鑒別、浸出物等檢查項(xiàng)。本文在此基礎(chǔ)上新增含量、重金屬及有害物質(zhì)、黃曲霉、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供數(shù)據(jù)支撐；在現(xiàn)有地方標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別方法多使用千斤拔對(duì)照藥材（蔓性千斤拔）或者羽扇豆醇對(duì)照品，本文新建以染料木苷為對(duì)照的大葉千斤拔的薄層鑒別方法，使其能有效的區(qū)別同為豆科的山豆根（混淆品），增強(qiáng)了方法專(zhuān)屬性。在薄層色譜方法中筆者對(duì)比了G254 薄層板和聚酰胺薄層板，對(duì)照物質(zhì)考察了千斤拔對(duì)照藥材、染料木苷、染料木素，發(fā)現(xiàn)聚酰胺薄層板的斑點(diǎn)更加清晰，分離效果更好；大葉千斤拔與對(duì)照藥材兩者在固定相上區(qū)別較為明顯，主斑點(diǎn)數(shù)及顏色都有差異；染料木素和染料木苷兩個(gè)成分極性相差較大，同時(shí)在薄層板上作為對(duì)照品的效果不理想，而染料木素的分離效果不如染料木苷。最終條件選擇了聚酰胺薄層板，以染料木苷為對(duì)照，以36%乙酸為展開(kāi)劑建立檢測(cè)方法，條件簡(jiǎn)單，易于操作。

考察了不同的提取方式、提取溶劑和提取時(shí)間對(duì)色譜圖的影響。結(jié)果表明染料木苷色譜峰受提取方式的影響較大。6''-O-丙二酰染料木苷對(duì)熱不穩(wěn)定[19]，加熱時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化為染料木苷，因此，本研究選擇超聲提取的方式以避免加熱導(dǎo)致6''-O-丙二酰染料木苷轉(zhuǎn)化。3 種溶劑中70%甲醇的提取效率最優(yōu)，而30 min 與60 min 的提取效果相近，最終選擇70%甲醇超聲提取30 min。

大葉千斤拔的主要成分包括糖類(lèi)、苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)、酚類(lèi)、氨基酸、甾體、皂苷、有機(jī)酸、生物堿、揮發(fā)油、蒽醌類(lèi)化合物等[20]，其中染料木苷成分藥理作用豐富，是含量較高的黃酮類(lèi)成分，且保留時(shí)間靠前，分離度、色譜峰純度等方面均符合含量測(cè)定要求，故選定染料木苷作為大葉千斤拔藥材含量測(cè)定的指標(biāo)。