陳景，楊磊，左亞杰，張琴，彭詞艷（.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑部，長沙 40007；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 400）

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）又稱為慢性腦缺血，它是指由各種原因引發(fā)的長期腦血流灌注不足。CCH 可導(dǎo)致腦關(guān)鍵部位（尤其是海馬CA1 區(qū)）缺血缺氧，誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元損害，進(jìn)而引起認(rèn)知障礙[1]。因此，CCH被認(rèn)為是造成血管性癡呆（vascular dementia，VaD）的一個主要誘因[2]。VaD 是繼阿爾茨海默癥之后最常見的一種癡呆類型，目前尚無有效的治療藥物[3]。借助CCH 模型，大量研究對VaD 的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行了探討，但其詳細(xì)機(jī)制仍未完全闡明。因此，通過CCH 模型研究VaD 的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療藥物仍是一個亟待解決的問題。

黃芩苷是從黃芩干燥根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯示出多種藥理活性[4]。動物研究顯示黃芩苷對局灶性腦缺血損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制主要是通過抗氧化實(shí)現(xiàn)的[5]。然而，黃芩苷能否改善CCH 所致的認(rèn)知損傷，以及其所涉及的分子機(jī)制，目前尚未見報道。因此，本研究擬觀察黃芩苷對CCH 所致認(rèn)知障礙的作用，并探討其機(jī)制，從而為VaD 的臨床治療提供可靠依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SD 雄性大鼠90 只，體質(zhì)量180～200 g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，質(zhì)量合格證號：43004700042552]。大鼠自由飲水?dāng)z食，隨機(jī)分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±2）℃，光照遵循明暗交替12/12 h 的節(jié)律。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循國際衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)關(guān)于動物使用倫理學(xué)方面的原則。

1.2 試藥及儀器

黃芩苷（批號：021608102，Sigma 公司，純度≥95%）。水合氯醛（批號：20170302，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），烏拉坦（批號：51-79-6，上海山浦化工有限公司）。神經(jīng)元核（NeuN）抗體（批號：ab177487）、突觸素（SYP）抗體（批號：ab32127）（Abcam 公司），磷酸化核因子E2相關(guān)因子2（p-Nrf2）抗體（批號：LM-2013R，上海聯(lián)邁生物工程有限公司），血紅素加氧酶-1（HO-1）抗體（批號：10701-1-AP，Proteintech），內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號：cw0100，Cwbiotech 公司）。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄分析系統(tǒng)（MT-200，成都泰盟科技有限公司），電生理在體場電位記錄分析系統(tǒng)（RM6240BD，成都儀器廠），凝膠電泳儀（DYY-8C，北京六一儀器廠）。其余試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 CCH 模型建立

采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù)建立大鼠CCH模型。術(shù)前大鼠禁食12 h，禁食后大鼠腹腔注射350 mg·kg－1水合氯醛麻醉，小心分離雙側(cè)頸總動脈，剝離迷走神經(jīng)。用手術(shù)線分別在雙側(cè)頸總動脈的遠(yuǎn)心端與近心端進(jìn)行雙結(jié)扎，將兩個結(jié)扎點(diǎn)之間血管剪斷。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎和剪斷血管，其他操作同上。整個實(shí)驗(yàn)過程中保持大鼠體溫在36～38℃。手術(shù)過程中，大鼠的雙側(cè)頸總動脈血管被剪斷，故最終納入觀察的大鼠均默認(rèn)為缺血成功。

2.2 動物分組及給藥

18 只大鼠在雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎造模后死亡。剩余大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組，即假手術(shù)組、模型組、缺血＋黃芩苷低劑量組（50 mg·kg－1）、缺血＋黃芩苷中劑量組（100 mg·kg－1）、缺血＋黃芩苷高劑量組（200 mg·kg－1）、假手術(shù)＋黃芩苷組（100 mg·kg－1），每組12 只。黃芩苷溶液用生理鹽水配制，于造模1 周后開始灌胃給藥，給藥劑量參考文獻(xiàn)方法[6]，每日一次，持續(xù)給藥2 周。

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

在造模后的第14～19日采用水迷宮實(shí)驗(yàn)評價大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。將大鼠置于水迷宮中進(jìn)行連續(xù)5 d 的定位航行訓(xùn)練讓其尋找平臺，每日4 次，每次間隔約10 min。每次實(shí)驗(yàn)大鼠共游泳60 s 來尋找隱藏的平臺，若大鼠在60 s 內(nèi)找到平臺，記錄該時間為逃逸潛伏期，并讓其在平臺上停留10 s；若大鼠在60 s 未找到平臺，其逃逸潛伏期默認(rèn)為60 s，并人工誘導(dǎo)大鼠至平臺上停留10 s。于第6日將平臺移去進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠60 s 內(nèi)在目標(biāo)象限所待的時間。逃逸潛伏期用以評價大鼠的學(xué)習(xí)能力，目標(biāo)象限所待時間用以評價大鼠的記憶功能。

2.4 新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)

在造模后的第20日采用新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)評價大鼠的非空間學(xué)習(xí)記憶。實(shí)驗(yàn)裝置由一個開口木制敞箱（50 cm×50 cm×90 cm）組成。在實(shí)驗(yàn)前一日，將大鼠放置木箱中探索5 min 以適應(yīng)環(huán)境。第2日為正式實(shí)驗(yàn)，由間隔1 h 的兩個階段組成。第一階段，將一個棕色木制正方體（邊長5 cm）與黑色橡膠圓錐體（底面直徑5 cm，高5 cm）分別放置敞箱的兩個對角。將大鼠從敞箱中間位置放入，讓其自由探索兩個物體。探索行為定義為：大鼠鼻尖接觸物體或鼻尖指向物體且距離小于1 cm。第一階段實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)大鼠累積探索時間達(dá)到20 s 時，將大鼠取出。在第二階段實(shí)驗(yàn)，將黑色橡膠圓錐體（舊事物）換成一個直徑5 cm 的藍(lán)色玻璃球（新事物），記錄5 min 內(nèi)大鼠探索兩個物品各自的時間。數(shù)據(jù)分析采用分辨指數(shù)對各組大鼠進(jìn)行比較。分辨指數(shù)＝（探索新事物的時間－探索舊事物的時間）/（探索新事物的時間＋探索舊事物的時間）。

2.5 電生理長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）記錄

新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)后的第2日，大鼠用1.5 g·kg－1烏拉坦腹腔注射麻醉后進(jìn)行海馬Schaffer側(cè)枝-CA1 區(qū)LTP 的記錄。刺激電極定位：前囟后3.7 mm；旁開3.2 mm；硬膜下2.0 mm；記錄電極定位：前囟后3.3 mm；旁開2.2 mm；硬膜下1.8 mm。選擇誘發(fā)最大興奮性突觸后電位（EPSPs）幅度40%所對應(yīng)的電壓強(qiáng)度作為基礎(chǔ)刺激，刺激間隔30 s，頻率0.3 Hz。記錄基線20 min 后，采用高頻高強(qiáng)刺激誘導(dǎo)LTP，參數(shù)為：連續(xù)4 串脈沖，每串脈沖間隔5 min，每串脈沖持續(xù)1 s，頻率100 Hz；刺激強(qiáng)度為最大EPSPs 幅度80%所對應(yīng)的電壓強(qiáng)度。高頻高強(qiáng)刺激后休息5 min，然后將刺激參數(shù)調(diào)為與基礎(chǔ)刺激一致，繼續(xù)記錄1 h。將高頻高強(qiáng)誘導(dǎo)后的EPSPs 平均值與誘導(dǎo)前基線平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較標(biāo)準(zhǔn)化后各組間誘導(dǎo)后的平均值。

2.6 大鼠海馬CA1 區(qū)NeuN 及SYP 的表達(dá)

大鼠LTP 記錄完成后，立馬斷頭取腦分離出海馬CA1 區(qū)組織備用。將其中6 只大鼠的組織分別提取總蛋白后，取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳，電泳分離完成后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉后，4℃孵育NeuN 抗體、SYP 抗體、p-Nrf2 抗體、HO-1 抗體及內(nèi)參GAPDH 抗體過夜。次日，將條帶洗滌后孵育相應(yīng)二抗1 h。孵育完成后，將條帶進(jìn)行清洗并用ECL 顯影成像。曝光圖像用NIH Image J 對灰度值進(jìn)行分析，GAPDH 抗體所對應(yīng)條帶的灰度值作為內(nèi)參進(jìn)行校正。統(tǒng)計時將假手術(shù)組的灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為1，計算各組的相對灰度值。

2.7 腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

將剩余的6 只大鼠海馬CA1 區(qū)組織稱重后置于9 倍質(zhì)量的生理鹽水中，冰浴制備勻漿。離心后取上清液，按照試劑盒說明書對GSH-Px、SOD 的活性以及MDA 的含量進(jìn)行測定。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期結(jié)果采用重復(fù)測量雙因素方差分析；多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷改善CCH 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷

大鼠定位航行訓(xùn)練結(jié)果如表1和圖1所示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠在第2～5日的逃逸潛伏期明顯延長（P＜0.01）；給予中、高劑量黃芩苷處理后，缺血大鼠逃逸潛伏期的延長得到了逆轉(zhuǎn)（P＜0.05 或P＜0.01）。在探索實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠在目標(biāo)象限所待時間明顯縮短（P＜0.01），給予中、高劑量黃芩苷能顯著延長缺血大鼠在目標(biāo)象限所待時間（P＜0.01）。

表1 黃芩苷改善CCH 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷(n＝12)Tab 1 Baicalin ameliorated the spatial learning and memory impairment induced by CCH in rats (n＝12)

圖1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)典型游泳軌跡圖Fig 1 Typical swimming paths of different groups in the Morris water maze task

3.2 黃芩苷改善CCH 大鼠非空間學(xué)習(xí)記憶損傷

圖2A 為新事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)的示意圖。圖2B 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠的分辨指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。給予中、高劑量黃芩苷治療能顯著改善腦缺血所引起的分辨指數(shù)降低（均P＜0.01）。

圖2 黃芩苷對CCH 大鼠非空間學(xué)習(xí)記憶損傷的影響（n＝12）Fig 2 Effect of baicalin on the non-spatial learning and memory impairment induced by CCH in rats（n＝12）

3.3 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)LTP 的抑制

圖3A 為大鼠海馬Schaffer 側(cè)枝-CA1 區(qū)LTP誘導(dǎo)前后EPSPs 圖。圖3B 顯示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠的LTP 的誘導(dǎo)明顯受到抑制（P＜0.01）。給予中、高劑量黃芩苷后能部分逆轉(zhuǎn)缺血大鼠LTP 誘導(dǎo)的抑制（P＜0.05）。

圖3 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)LTP 的抑制（n＝12）Fig 3 Baicalin ameliorated the CCH-induced inhibition on LTP at the CA1 area of the hippocampus in rats（n＝12）

3.4 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元及突觸損傷

為進(jìn)一步探討黃芩苷改善慢性腦缺血的分子生物學(xué)途徑，我們選擇黃芩苷中劑量給藥組進(jìn)行后續(xù)機(jī)制分析。如圖4A 及4B 所示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠NeuN 及SYP 的表達(dá)顯著降低（P均＜0.01）。給予100 mg·kg－1黃芩苷后能顯著上調(diào)缺血大鼠NeuN 及SYP 的表達(dá)（P均＜0.05）。

圖4 黃芩苷對CCH 大鼠海馬CA1區(qū)NeuN 及SYP 表達(dá)的影響（n＝6）Fig 4 Effect of baicalin on the expression of NeuN and SYP induced by CCH in hippocampal CA1 area of rats（n＝6）

3.5 黃芩苷改善CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)的氧化應(yīng)激指標(biāo)

如表2所示，與假手術(shù)組大鼠比較，缺血大鼠海馬CA1 區(qū)GSH-Px 及SOD 的活性顯著降低（均P＜0.01），MDA 的含量顯著升高（P＜0.01）；給予100 mg·kg－1黃芩苷后能顯著上調(diào)GSH-Px 和SOD 的活性以及降低MDA 的含量（P均＜0.05）。

表2 黃芩苷對CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響(n＝6)Tab 2 Effect of baicalin on the oxidative stress induced by CCH in hippocampal CA1 area of rats (n＝6)

3.6 黃芩苷促進(jìn)CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)Nrf2/HO-1 信號通路的激活

如圖5所示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)p-Nrf2 及HO-1 的表達(dá)顯著升高（均P＜0.05）。給予100 mg·kg－1黃芩苷后能進(jìn)一步促進(jìn)缺血大鼠p-Nrf2 及HO-1 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 黃芩苷對CCH 大鼠海馬CA1 區(qū)Nrf2/HO-1 信號通路的影響（n＝6）Fig 5 Effect of baicalin on the activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway in the hippocampal CA1 of rats after CCH（n＝6）

4 討論

VaD 是一種年齡相關(guān)性的癡呆類型。近年來，隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇，VaD 越來越受到人們的關(guān)注，但關(guān)于VaD 的發(fā)病機(jī)制目前還未研究清楚，其治療也尚無批準(zhǔn)的有效藥物。因此深入VaD 的研究迫在眉睫。通過雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù)建立大鼠CCH 模型是研究VaD 最常用的一種模型[2]。借助此模型，本研究發(fā)現(xiàn)CCH 能導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)顯著的空間及非空間學(xué)習(xí)記憶損傷，給予中、高劑量黃芩苷（100、200 mg·kg－1）可顯著改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷。

LTP 可以從突觸可塑性的角度闡明學(xué)習(xí)記憶形成的細(xì)胞分子機(jī)制[7]；而神經(jīng)元和突觸變化可以從結(jié)構(gòu)可塑性的機(jī)制闡明學(xué)習(xí)記憶的改變[8]。本研究通過在體場電位記錄大鼠海馬CA1 區(qū)LTP，進(jìn)一步證實(shí)中、高劑量黃芩苷可以改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷。并且，黃芩苷改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷可能與抑制海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元及突觸損傷有關(guān)。

事實(shí)上，大量研究顯示黃芩苷可以改善腦缺血損傷[9-10]，并且對多種模型引起的認(rèn)知障礙有改善作用[11-12]。黃芩苷改善缺血損傷的一個重要機(jī)制是緩解缺血引起的氧化應(yīng)激[5，10]。氧化應(yīng)激是由于組織氧化還原的平衡狀態(tài)被破壞，從而引起自由基大量聚集、膜脂質(zhì)破壞、DNA 裂解、蛋白氧化；最終可導(dǎo)致突觸丟失，神經(jīng)元死亡，突觸可塑性減弱。抑制氧化應(yīng)激損傷已被充分證實(shí)可以減少神經(jīng)元的丟失和突觸的破壞，改善認(rèn)知功能[13-14]。GSH-Px活性、SOD 活性降低及MDA 含量通常聯(lián)系起來作為評估氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)。GSH-Px 和SOD 是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶；而MDA 含量可以間接反映出細(xì)胞受自由基損害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)給予黃芩苷后能顯著逆轉(zhuǎn)CCH 引起的GSH-Px 和SOD 活性降低及MDA 含量升高。提示黃芩苷改善CCH 所致的學(xué)習(xí)記憶損傷是通過抗氧化實(shí)現(xiàn)的。

Nrf2 作為核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞防御多種應(yīng)激損傷中起重要作用。氧化應(yīng)激時，Nrf2 可發(fā)生磷酸化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)積聚并進(jìn)一步識別、結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件，從而啟動具有細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的多種抗氧化酶基因（如HO-1）的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)細(xì)胞和組織的作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)CCH 模型大鼠海馬CA1區(qū)p-Nrf2 及HO-1 的蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，提示Nrf2/HO-1 通路激活，這可能是機(jī)體啟動的一種自我保護(hù)機(jī)制，與此前報道相一致[17]。給予黃芩苷后，p-Nrf2 及HO-1 的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，證實(shí)黃芩苷可能是通過促進(jìn)Nrf2/HO-1 通路的激活，緩解氧化應(yīng)激損傷，從而改善CCH 所致的認(rèn)知障礙。這與文獻(xiàn)報道在其他模型下黃芩苷可經(jīng)Nrf2/HO-1 通路調(diào)控氧化應(yīng)激損傷相一致[18]。

綜上所述，本研究通過大鼠CCH 模型，發(fā)現(xiàn)黃芩苷能改善CCH 所致的認(rèn)知障礙，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1 信號通路的激活，抑制CCH 所引起的氧化應(yīng)激，緩解神經(jīng)元及突觸損傷有關(guān)。