張謙，李君，胡玉霞，張微，張百超，孫海鵬，君梅，常福厚，3*（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110）

沙棘是一種落葉灌木，其特性是耐旱、抗風(fēng)沙，可以在鹽堿化土地上生存，因此被廣泛用于水土保持，中國西北部大量種植沙棘，用于沙漠綠化。沙棘果實(shí)中維生素C 含量很高，素有維生素C 之王的美稱[1]。沙棘是植物和其果實(shí)的統(tǒng)稱。我國是沙棘資源利用最早的國家，早在元朝就被列為宮廷保健品，1977年沙棘被正式列入《中國藥典》，20世紀(jì)80年代，被原國家衛(wèi)生部列為我國第一批藥食兩用植物品種。

沙棘，具有止咳去痰、活血化瘀之功效，在民間一直作為藥食兩用的植物，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，沙棘中含有的總黃酮對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)；5-羥色胺可以預(yù)防癌癥；各種有機(jī)酸和卵磷脂可以保護(hù)肝臟[2-6]。同時(shí)沙棘果油開發(fā)的具有保健作用的食品如沙棘果油軟膠囊等在市場上均有銷售，然而目前對(duì)沙棘的毒性研究主要集中于對(duì)沙棘急性毒性、長期毒性和遺傳毒性的研究。尚未有研究數(shù)據(jù)來綜合評(píng)價(jià)沙棘對(duì)于心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。

本項(xiàng)目通過清醒比格犬灌胃沙棘考察其對(duì)心血管系統(tǒng)的影響，通過大小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)和戊巴比妥鈉閾下催眠實(shí)驗(yàn)，考察沙棘對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

1 材料

1.1 試藥

沙棘（東營百佳益中藥飲片有限公司，批號(hào)：20180301）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20170810）；布洛芬緩釋膠囊（中美天津史克制藥有限公司，批號(hào)：20171208）；碘伏（文水大有實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20170315）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號(hào)：D16070503）。

1.2 儀器

植入式生理信號(hào)遙測系統(tǒng)（美國Data Sciences International 公司），含D70-PCTR 植入子、接收器、數(shù)據(jù)交換單元、數(shù)據(jù)采集單元和數(shù)據(jù)分析軟件等；動(dòng)物麻醉機(jī)（美國Matrx 公司）；YLS-1C 小動(dòng)物活動(dòng)記錄儀、YLS-31A 大小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀、YLS-27A 大小鼠尾部自動(dòng)標(biāo)號(hào)儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；DS-Y350 型粉碎機(jī)（上海市頂帥工貿(mào)有限公司）；CIC1P1-150FE-L電子秤、BSA4202S 分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；注射器（蘇州偉康醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：170305）；胃管（太平洋醫(yī)材股份有限公司，批號(hào)：15025519）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)比格犬，5～6月齡，雄性3 只，雌性3 只[北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0001]。動(dòng)物初次給藥體質(zhì)量10.45～13.85 kg。比格犬飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心普通設(shè)施，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蒙）2019-0001。環(huán)境控制（溫度18～26℃，日溫差≤3℃，濕度40%～70%，12 h/12 h 明暗交替）。單籠飼養(yǎng)，每籠1 只；犬維持飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司），定時(shí)定量投飼（在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食過夜），自由攝取，自由飲水。

SPF 級(jí)ICR 小鼠80 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質(zhì)量18～22 g；SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雌雄各半，5～6 周齡，體質(zhì)量170～250 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。大、小鼠飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心屏障設(shè)施，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蒙）2019-0001。環(huán)境控制（溫度20～26℃，日溫差≤3℃，相對(duì)濕度41%～64%，12 h/12 h 明暗交替）；飼養(yǎng)密度：每籠5 只，60Co 放射滅菌鼠全價(jià)顆粒飼料購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司，定時(shí)定量投飼（在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食過夜），自由攝取，自由飲水。

2 方法

2.1 手術(shù)及護(hù)理

參照DSI D70-PCTR 手術(shù)指南方法進(jìn)行植入手術(shù)，術(shù)前用異氟烷麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，術(shù)中維持，麻醉后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行充分備皮，主要包括整個(gè)胸腹部和腹外側(cè)及前肢內(nèi)側(cè)，備皮面積要大于手術(shù)區(qū)域；植入過程主要包括植入子主體植入、壓力導(dǎo)管的植入及電極的植入。植入子主體放于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹部左側(cè)；心電電極采用模擬標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)放置，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胸右側(cè)2～3 肋間隙與鎖骨中線相交處為電極負(fù)極，胸左側(cè)12～13 肋骨體與腋中線相交處為電極正極；呼吸電極植入結(jié)束后應(yīng)對(duì)基線阻抗進(jìn)行確認(rèn)，確保呼吸波幅在（60±10）ohms 內(nèi)；壓力導(dǎo)管插入腹股溝腹主動(dòng)脈，為防止壓力導(dǎo)管因犬活動(dòng)拉扯滑出，壓力導(dǎo)管植入后應(yīng)預(yù)留O 型回路并用非吸收線縫合固定。手術(shù)植入及縫合結(jié)束后進(jìn)入護(hù)理周期，術(shù)后給予布洛芬緩釋膠囊3 d，每日1 次，每次1 粒，每日使用碘伏對(duì)傷口消毒1 次，連續(xù)7 d，恢復(fù)期3～4 周，待全部動(dòng)物恢復(fù)后開始給藥。

2.2 供試品的配制

2.2.1 溶媒對(duì)照品配制 取CMC-Na 10 g，多次少量地將其加入至蒸餾水中，邊加邊用玻璃棒攪拌使其完全溶解，最后定容至2000 mL，即得0.5% CMC-Na 溶液，放置7 d 以后，備用。

2.2.2 供試品配制 稱取適量供試品于配藥瓶中，加入終體積約70%的0.5% CMC-Na，用玻璃棒攪拌溶解后定量至終體積，再用KH-500DV 型數(shù)控超聲波清洗器100 Hz 振蕩約10 min，備用。

2.3 數(shù)據(jù)采集

2.3.1 比格犬心電、血壓、體溫指標(biāo)測定 6 只比格犬采用拉丁方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組別設(shè)計(jì)，分為4 組，每組雌雄各3 只，設(shè)溶媒對(duì)照組（0.5% CMCNa），沙棘混懸液低、中、高劑量組（0.08、0.24、0.72 g·kg－1），給藥體積 10 mL·kg－1，設(shè)4 個(gè)給藥周期，各給藥周期間隔7 d。實(shí)驗(yàn)前設(shè)定需要采集的相關(guān)參數(shù)，采用植入式生理信號(hào)遙測系統(tǒng)采集動(dòng)物心電指標(biāo)、血壓指標(biāo)及體溫?cái)?shù)據(jù)，心電指標(biāo)包括心率、PR 間期、QRS 間期、QT 間期、P 波、R 波、ST 段、T 波；血壓指標(biāo)包括收縮壓、舒張壓、平均壓，同時(shí)采集體溫?cái)?shù)據(jù)。記錄給藥前1～2 h 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及給藥后24 h 數(shù)據(jù)。采集間隔為每10 s 系統(tǒng)自動(dòng)記錄一次。統(tǒng)計(jì)時(shí)選取給藥前0.5 h 的時(shí)間點(diǎn)為給藥前基礎(chǔ)值，在給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、18、24 h 取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后5 min 平均值作為該時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)，剔除因動(dòng)物躁動(dòng)等因素引起的大幅度漂移數(shù)據(jù)。

2.3.2 小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 選用5～6 周齡SPF級(jí)ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機(jī)分為4 組，溶媒對(duì)照組（0.5% CMC-Na），沙棘混懸液低、中、高劑量組（0.4、1.2、3.6 g·kg－1），每組10只，各組分別經(jīng)口單次灌胃給藥，給藥體積10 mL·kg－1。于給藥前0.5 h 及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 將小鼠放入記錄儀的活動(dòng)箱中，測定小鼠活動(dòng)情況，記錄10 min 內(nèi)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。

2.3.3 小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 選用5～6 周齡SPF 級(jí)ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機(jī)分為4 組，溶媒對(duì)照組（0.5% CMCNa），沙棘混懸液低、中、高劑量組（0.4、1.2、3.6 g·kg－1），每組10 只。各組分別經(jīng)口單次灌胃給藥，給藥體積10 mg·kg－1。于給藥后6 h 腹腔注射30 mg·kg－1的戊巴比妥鈉，注射體積均為10 mL·kg－1，即刻開始觀察注射戊巴比妥鈉后30 min 內(nèi)每組翻正反射消失達(dá)1 min 以上的動(dòng)物數(shù)，凡30 min 內(nèi)動(dòng)物翻正反射消失達(dá)1 min 以上者，表明發(fā)生了睡眠，翻正反射恢復(fù)即為動(dòng)物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間。記錄每組發(fā)生睡眠的小鼠數(shù)和入睡潛伏期、睡眠時(shí)間。

2.3.4 大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 檢疫結(jié)束后選取合格的SD 大鼠置于轉(zhuǎn)棒儀滾筒上進(jìn)行訓(xùn)練，轉(zhuǎn)速為12 r·min－1。訓(xùn)練結(jié)束后，選取能在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上維持3 min 以上不掉落的大鼠40只，雌雄各半，分為4 組，溶媒對(duì)照組（0.5% CMC-Na），沙棘混懸液低、中、高劑量組（0.27、0.81、2.43 g·kg－1），每組10 只。分別經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)供試品，給藥體積10 mg·kg－1。于給藥后0.5、1、2、3、4、6、8 h 將大鼠放在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上，記錄每只大鼠從轉(zhuǎn)棒儀滾筒上掉落所用時(shí)間，若10 min 以上不掉落則以10 min 計(jì)。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素ANOVA 或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，組間比較采用Bonferroni 法進(jìn)行。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙棘混懸液對(duì)清醒比格犬心血管系統(tǒng)的影響

比格犬灌胃給予沙棘混懸液后，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行心電圖檢測，結(jié)果顯示動(dòng)物心電各項(xiàng)指標(biāo)都在正常值范圍內(nèi)。與溶媒對(duì)照組同一采集時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值相比，沙棘混懸液各劑量組比格犬的心率、PR 間 期、QRS 間期、QT 間期、P 波、T 波、R 波及ST 段，均未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05）。

3.2 沙棘混懸液對(duì)清醒比格犬血壓的影響

比格犬灌胃給予沙棘混懸液后，對(duì)各組動(dòng)物血壓進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示動(dòng)物收縮壓、舒張壓及平均壓均處于正常范圍，且在測量周期內(nèi)血壓各項(xiàng)指標(biāo)基本維持在相當(dāng)水平，沒有較大波動(dòng)，與溶媒對(duì)照組同一采集時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值相比，沙棘混懸液各劑量組比格犬的收縮壓、舒張壓及平均壓均未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05）。

3.3 沙棘混懸液對(duì)清醒比格犬體溫的影響

比格犬灌胃給予沙棘混懸液后，對(duì)各組動(dòng)物體溫進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示動(dòng)物體溫均處于正常范圍，與溶媒對(duì)照組同一采集時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值相比，沙棘混懸液各劑量組比格犬體溫未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05）。比格犬在夜間的體溫值相對(duì)來說高于白天，與灌胃與否無關(guān)。

3.4 沙棘混懸液對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

ICR 小鼠灌胃給予沙棘混懸液后，測定小鼠活動(dòng)情況，記錄10 min 內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)，與溶媒對(duì)照組同一采集時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值相比，沙棘混懸液各劑量組的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），且從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束，溶媒對(duì)照組和沙棘混懸液各劑量組的活動(dòng)次數(shù)都呈現(xiàn)下降趨勢，結(jié)果如圖1所示。

圖1 沙棘混懸液對(duì)ICR 小鼠自主活動(dòng)的影響（n＝10，±s）Fig 1 Effect of sea buckthorn suspension on the spontaneous activity of ICR mice（n＝10，±s）

3.5 沙棘混懸液對(duì)小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

ICR 小鼠灌胃給予沙棘混懸液后，溶媒對(duì)照組、沙棘混懸液各劑量組的小鼠睡眠潛伏期均小于10 min，睡眠時(shí)間均大于20 min，與溶媒對(duì)照組相比，沙棘混懸液各劑量組的小鼠睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間均無明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖2所示。

圖2 沙棘混懸液對(duì)ICR 小鼠睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間的影響（n＝10，±s）Fig 2 Effect of sea buckthorn suspension on the sleep latency and sleep time of ICR mice（n＝10，±s）

3.6 沙棘混懸液對(duì)大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響

SD 大鼠灌胃給予沙棘混懸液后，在0.5、1、2、3、4、6、8 h 將大鼠放在轉(zhuǎn)棒儀滾筒上，記錄每只大鼠從轉(zhuǎn)棒儀滾筒上掉落所用時(shí)間，溶媒對(duì)照組、沙棘混懸液各劑量組大鼠從轉(zhuǎn)棒儀上掉落的時(shí)間均集中于200～250 s，與溶媒對(duì)照組同一采集時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值相比，沙棘混懸液各劑量組的大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)時(shí)間未出現(xiàn)明顯改變（P＞0.05），結(jié)果如圖3所示。

圖3 沙棘混懸液對(duì)SD 大鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)的影響（n＝10，±s）Fig 3 Effect of sea buckthorn suspension on coordinated exercise of SD rats（n＝10，±s）

4 討論

沙棘在亞洲和歐洲已被用作藥物和營養(yǎng)補(bǔ)品已有數(shù)百年歷史。但是，關(guān)于沙棘及其提取物安全性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)仍然很少。目前已有報(bào)道沙棘的遺傳毒性、致畸性、急性和亞慢性毒性數(shù)據(jù)，為完善其安全性評(píng)價(jià)，本課題組評(píng)估了沙棘對(duì)比格犬心血管系統(tǒng)，對(duì)小鼠和大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

有研究表明，昆明小鼠對(duì)沙棘油的最大耐受劑量為20 mL·kg－1，在亞慢性毒性研究中，2.5 mL·kg－1和1.5 mL·kg－1劑量的沙棘油對(duì)大鼠和兔子是安全的[7-8]。最近有研究表明，雄性和雌性SD 大鼠在連續(xù)90 d 重復(fù)口服毒性試驗(yàn)中，沙棘油未觀察到不良反應(yīng)的水平為10 mL·kg－1。遺傳毒性研究的結(jié)果表明，在暴露濃度分別為8、40、200、1000 和5000 μg·plate－1的條件下，沙棘油對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸依賴性菌株沒有任何誘變活性；沙棘油對(duì)精子形態(tài)沒有顯著影響，劑量9.36、4.68 和2.34 g·kg－1對(duì)小鼠多色紅細(xì)胞微核率無影響[9]。在致畸性研究中，從妊娠第7日到第16日，用4.68、2.34 和1.17 g·kg－1劑量的沙棘油灌胃妊娠大鼠，未觀察到母體毒性或胚胎毒性[9]。然而，在文獻(xiàn)中也已經(jīng)報(bào)道了沙棘提取物的不利影響。在90 d 內(nèi)，用250 和500 mg·kg－1的沙棘漿果提取物灌胃的大鼠血漿葡萄糖水平增加[10]。同樣，在飼喂2%沙棘葉粉的日本鵪鶉中觀察到淋巴組織的增殖[11-13]。

《中國藥典》建議，沙棘安全劑量約為3～10 g·d－1。在本實(shí)驗(yàn)中，以0.4、1.2 和3.6 g·kg－1劑量（相當(dāng)于人類臨床劑量的10、30、90 倍）的沙棘灌胃小鼠，以0.27、0.81 和2.43 g·kg－1劑量（相當(dāng)于人臨床劑量的6.75、20.25、60.75 倍）的沙棘灌胃大鼠，以0.08、0.24 和0.72 g·kg－1劑量（相當(dāng)于人類臨床劑量的2、6、18 倍）的沙棘灌胃比格犬，在研究期間未觀察到發(fā)病或死亡的跡象，且沒有沙棘相關(guān)毒性或異常的跡象。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究中，在小鼠中給予3.6 g·kg－1劑量的沙棘相當(dāng)于用標(biāo)準(zhǔn)體表面積換算后平均體質(zhì)量為70 kg 的成人使用27.9 g·kg－1劑量的沙棘，在大鼠中給予2.43 g·kg－1的劑量相當(dāng)于用標(biāo)準(zhǔn)體表面積換算后平均體質(zhì)量為70 kg 的成人使用26.9 g·kg－1劑量的沙棘，都超出《中國藥典》建議的安全用量。沙棘最大劑量為2.43 g·kg－1，對(duì)SD 大鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)沒有顯著影響，3.6 g·kg－1沙棘對(duì)ICR 小鼠的戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠和活動(dòng)能力沒有明顯影響。沙棘在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下均未表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。此外，行為學(xué)檢測方法能夠直接準(zhǔn)確地反映出動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的變化情況，然而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、實(shí)驗(yàn)間隔、糞便、氣味以及實(shí)驗(yàn)時(shí)間段等均可能會(huì)影響動(dòng)物的行為方式，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物行為學(xué)檢測方法就顯得尤為重要。

此外，還對(duì)沙棘對(duì)于比格犬的心血管毒性進(jìn)行了評(píng)估。6 只健康比格犬口服4 種劑量水平（0、0.08、0.24 和0.72 g·kg－1）的沙棘，用標(biāo)準(zhǔn)體表面積換算，在狗中給予0.72 g·kg－1劑量的沙棘相當(dāng)于平均體質(zhì)量為70 kg 的成人口服27.0 g·kg－1劑量。在所有劑量下，對(duì)體溫，血壓（收縮壓，舒張壓和平均血壓），心率和心電圖參數(shù)（PR，QRS間期和QT 間期，P，T 波和R 波，ST 段）均無明顯影響。根據(jù)給藥過程中的臨床體征，在一只以0.72 g·kg－1沙棘灌胃的比格犬中發(fā)現(xiàn)了干嘔現(xiàn)象。由于在給藥時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)干嘔是普遍現(xiàn)象，因此該事件并不表明由于暴露于測試藥物而產(chǎn)生了不良后果。另外，本研究實(shí)驗(yàn)表明，該現(xiàn)象也無劑量依賴性的趨勢。根據(jù)這項(xiàng)研究的結(jié)果，比格犬灌胃給予沙棘濃度分別為0.08、0.24 和0.72 g·kg－1，對(duì)其體溫、血壓、心率和心電圖無影響。

綜上所述，在實(shí)驗(yàn)劑量水平內(nèi)，沙棘對(duì)大小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和比格犬心血管系統(tǒng)無影響。