徐佳璐，顧艷麗，劉佳，呂曉潔，李瑞娟（內蒙古醫(yī)科大學藥學院，呼和浩特 010110）

PF-3758309（PF-309）是一種以吡唑為母核選擇性作用于p21 活化激酶（p21-activated kinases，PAKs）的絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑，可以競爭性地結合PAKs 的ATP 位點，阻斷信號傳導，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，促進腫瘤細胞的凋亡，從而發(fā)揮靶向作用[1]。PF-309在臨床研究中用于晚期轉移性實體瘤的治療，對不同類型的腫瘤細胞株均表現(xiàn)出廣泛的抑制作用[2]，但PF-309 口服生物利用度較低，水溶性不高以及藥物穩(wěn)定性較差等特點限制了其臨床藥效[3]。脂質體是新型的納米藥物遞送系統(tǒng)，以卵磷脂為主要膜材，脂質雙分子層與生物膜成分相似，組織相容性良好，脂質體包載下不僅能提高難溶藥物的溶解度，增強藥物的治療效果，還能提高藥物的生物相容性，從而減少給藥劑量，降低藥物的毒副作用[4-5]。利用脂質體的包埋技術使得藥物的釋放具有一定的緩釋作用，可以提高被包埋藥物的穩(wěn)定性，適合靜脈注射使用。脂質體作為藥物載體具有淋巴趨向性，抗癌藥物包封于脂質體中，能使藥物選擇性地殺傷癌細胞，增加藥物對淋巴的定向性，改變藥物在組織中的分布。本課題制備PF-309 脂質體（Lip@PF-309），并以包封率為考察指標，通過正交實驗篩選最優(yōu)制備工藝條件并對其進行體外質量評價，為PF-309 新劑型研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 vialsampler 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；ZD-85 雙功能氣浴恒溫振蕩器（常州金壇良友儀器有限公司）；S2-100V2 型納米粒度分析儀（HORIBA日本公司）；SB25-12 DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；N-1300D 旋轉蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；S4800 掃描電鏡（國儀量子公司）；BFX5-320 型低速自動平衡離心機（白洋離心機廠）；UpHW-II-90T 超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FDU-2110型冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）；VOS-310C 真空定溫干燥箱（東京理化器械株式會社）；Thermo Heraeus Pico 17R 冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

PF-309（質量分數(shù)99.20%，批號：AK474043，安耐吉化學）；大豆卵磷脂、膽固醇（羅恩試劑有限公司）；水為超純水；甲醇、三乙胺為色譜純；其他試劑均為國產分析純；葡聚糖凝膠G-50（北京偶合科技有限公司）；D-（＋）葡萄糖（分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司）；蔗糖（分析純，天津市科盟化工工貿有限公司）；甘露醇（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乳糖（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 Lip@PF-309 的制備

采用薄膜分散法制備脂質體。按處方量精密稱定PF-309 2.5 mg、膽固醇12.5 mg、大豆卵磷脂25 mg，溶于5 mL 無水乙醇-三氯甲烷（3∶7）混合有機溶劑中，超聲使藥物與膜材完全溶解，45 ℃水浴條件下常壓旋轉蒸發(fā)20 min 后緩慢減壓至0.1 MPa，至有機溶劑完全蒸出，在蒸發(fā)得到的均勻類脂膜中加入5 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），60 ℃水浴條件下水合1.5 h，使膜完全脫落得到脂質體混懸液，冰水浴中超聲均化20 min，至均一體系，再經0.45 μm 微孔濾膜過濾10 次整粒，即得Lip@PF-309，4℃下保存。

2.2 包封率的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為 Hypersll GOLD C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%三乙胺水溶液（70∶30）；流速為1.0 mL·min－1；紫外檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL；柱溫為28℃。結果表明，在此色譜條件下，PF-309 游離藥物與空白脂質體分離性良好，輔料對藥物的測定無干擾。

2.2.2 標準曲線的制備 將質量濃度為100μg·mL－1的PF-309 對照品溶液稀釋為5、10、20、30、40、50 μg·mL－1的系列對照品溶液。按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，得標準曲線方程Y＝13.26X＋1.187，r＝1.000，表 明PF-309在5～50 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3 方法學驗證 制備含空白脂質體的低、中、高3 種不同質量濃度PF-309 樣品溶液，計算平均回收率分別為99.8%、100.0%、100.1%（n＝3），RSD均小于2%，結果符合加樣回收率要求。精密吸取質量濃度為100 μg·mL－1的PF-309 對照品溶液在同一日內連續(xù)進樣5 針，記錄峰面積，計算日內RSD；用同一個對照品溶液每日進樣1針，連續(xù)進樣5 d，記錄峰面積，計算日間RSD，結果日間、日內RSD分別為0.71%、0.26%（n＝5），表明精密度良好。精密取同一樣品5 份，測定，測得藥物峰面積RSD為0.45%（n＝5），表明該方法重復性良好。

2.2.4 包封率的測定 采用葡聚糖微型凝膠柱離心法來分離脂質體與游離未包封藥物[6-7]。取Lip@PF-309 混懸液0.5 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇破乳并稀釋定容，按“2.2.1”項下色譜條件檢測總的藥物含量（W0）。另取Lip@PF-309 混懸液0.5 mL 緩慢滴加到微柱頂端，2500 r·min－1離心2.5 min 后，收集洗脫液，然后補充0.5 mL PBS（pH 7.2）于微柱頂端，同樣條件洗脫，連續(xù)洗脫3 次，收集所有洗脫液于10 mL 量瓶中，甲醇破乳并稀釋定容，按“2.2.1”項下色譜條件檢測包封藥物含量（W1）。根據公式計算包封率，包封率（EE%）＝（W1/W0）×100%。

2.3 Lip@PF-309 處方的單因素考察

2.3.1 卵磷脂濃度對包封率的影響 固定其他條件不變，選取卵磷脂質量濃度1、3、5、9、15 mg·mL－1，測定其包封率分別為79.8%、82.3%、85.2%、77.6%、75.9%，結果表明在一定范圍內，藥物的包封率隨卵磷脂濃度的增加而增加，但過高的磷脂濃度會導致磷脂聚集，使藥物難以釋放[8]，故選擇卵磷脂濃度1、3、5 mg·mL－1進行正交實驗。

2.3.2 膽固醇與卵磷脂質量比（膜材比）對包封率的影響 膽固醇對脂質體膜流動性起調節(jié)作用，改善了藥物的包封率與穩(wěn)定性，但過量的膽固醇會與脂溶性藥物（PF-309）在磷脂雙層膜中發(fā)生競爭置換現(xiàn)象，導致包封率降低。固定其他條件不變，膜材比取1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，測定其包封率分別為81.2%、85.3%、83.6%、79.5%、76.8%，故選擇膜材比為1∶1、1∶2、1∶3進行正交實驗。

2.3.3 藥脂比對包封率的影響 固定其他條件不變，藥脂比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30，測定其包封率分別為84.2%、88.7%、86.3%、75.5%、73.2%。結果表明，藥物的包封率隨膽固醇質量增加而增加，當兩者比例逐漸增大時，包封率有所下降，當藥脂比達到1∶20 時，包封率較低，故選擇藥脂比為1∶5、1∶10、1∶15進行正交實驗。

2.4 正交實驗設計優(yōu)化Lip@PF-309 處方

在單因素實驗的基礎上，選擇膜材比（A）、藥脂比（B）、卵磷脂濃度（C）為考察因素，D列為誤差列，采用L9（34）因素水平表進行正交設計實驗，以包封率為評價指標，篩選制備PF-309 脂質體的最佳工藝。正交因素與水平設計見表1，以包封率為考察指標的正交實驗設計與結果見表2，方差分析見表3。根據表中極值（R）直觀分析可知，影響Lip@PF-309 脂質體包封率的因素由大到小依次為B＞A＞C，最佳處方為B2A2C1，即卵磷脂濃度5 mg·mL－1，膜材比1∶2，藥脂比1∶10。

表1 正交因素設計水平Tab 1 Factor and level of orthogonal design

表2 正交實驗設計結果Tab 2 Orthogonal design

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

2.5 Lip@PF-309 的驗證及質量評價

按“2.4”項下的最優(yōu)處方，制備3 批Lip@PF-309，測得包封率分別為（92.15±0.21）%、（91.89±0.18）%、（92.22±0.06）%，表示最優(yōu)工藝有良好的重現(xiàn)性。制得的脂質體外觀呈乳白色混懸液，平均粒徑為（112.25±0.08）nm，粒徑的多分散指數(shù)（PDI）為（0.158±0.03）（見圖1），Zeta 電位為（－7.75±0.13）mV。制得的Lip@PF-309 呈球形或類球形，粒徑集中在110～130 nm，分布較為均勻（見圖2）。4℃條件下放置30 d，Lip@PF-309沒有出現(xiàn)沉降現(xiàn)象，包封率無明顯降低，表明穩(wěn)定性良好。

圖1 Lip@PF-309 的粒徑分布圖Fig 1 Particle size of PF-309 liposome

圖2 Lip@PF-309 脂質體掃描電鏡圖Fig 2 Scanning electronic microphotograph of PF-309 liposome

2.6 體外釋放度實驗

取Lip@PF-309 混懸液，以等濃度的PF-309原溶液作對照，分別吸取1 mL 移入已處理好的透析袋（8000～14 000 D）中，置于50 mL（pH 7.2）PBS 緩沖液中，于恒溫（37±1）℃、恒速（85 r·min－1）的搖床中混勻，在0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 不同時段取釋放液1 mL，HPLC 測定含量，計算平均累積釋放百分率，釋放曲線結果見圖3。PF-309 原料藥組6 h 時PF-309 累積釋放率達85.65%，釋放迅速。Lip@PF-309 組24 h 時PF-309 累計釋放率僅為 85.03%，釋放相對于原料藥組較為緩慢，參比制劑（Rt）PF-309 溶液與受試制劑（Tt）Lip@PF-309 兩者溶出曲線的相似因子（f2）值為41，小于50，說明兩者溶出曲線不相似，即緩釋效果較為明顯。

圖3 體外釋放曲線Fig 3 Drug release in vitro

2.7 凍干脂質體的制備

分散在水溶液中的脂質體在長期貯存后一般會出現(xiàn)物理化學不穩(wěn)定性，磷脂的水解氧化和脂質體的聚集是脂質體不穩(wěn)定的主要原因[9]。為了提高Lip@PF-309 的儲備穩(wěn)定性，解決液態(tài)脂質體無法長期貯存的問題，本研究采用真空冷凍干燥技術來制備Lip@PF-309 凍干脂質體，但是脂質體在凍干的過程中，經常會出現(xiàn)脂質體破裂導致包封藥物滲漏以及粒子融合造成粒徑增大的問題，因此在冷凍干燥過程中需加入凍干保護劑。多元醇類和糖類由于結構中均有羥基基團，均能產生“優(yōu)先水化作用”，可在脂質體樣品凍干過程中起保護作用。但由于采用單個凍干保護劑凍干時，凍干脂質體的外觀欠佳，再分散性較差，包封率與凍干前脂質體樣品差距較大等問題[10-11]，故本研究將采用雙凍干保護劑聯(lián)用，來考察凍干脂質體的最佳工藝。

2.7.1 聯(lián)用凍干保護劑種類的篩選 固定凍干保護劑加入總量為10%（w/v），兩種保護劑質量比相等，以凍干制品的外觀、再分散性、包封率等為評價指標，考察保護效果較好的甘露醇與乳糖、蔗糖和葡萄糖分別聯(lián)用對凍干樣品的保護效果。參考文獻[12]，本研究固定預凍時間為－80℃，在前期預實驗的基礎上，冷凍干燥的溫度設置為－80℃，時間24 h。結果顯示甘露醇與蔗糖和葡萄糖分別聯(lián)用時，得到的凍干品外觀均有萎縮且再分散性較差，而甘露醇與乳糖聯(lián)用時得到的凍干脂質體外觀疏松飽滿，再分散性良好，復溶后的包封率接近凍干前樣品，且粒徑無明顯變化。

2.7.2 聯(lián)用凍干保護劑用量的考察 使用甘露醇-乳糖（1∶1）作為聯(lián)用保護劑，考察保護劑的總量分別為1%、5%、10%、15%、20%時對凍干脂質體的保護作用，結果顯示，當保護劑總量為10%時，凍干品的包封率最高。

綜上所述，取2 mL Lip@PF-309 混懸液，外加10%（w/v）甘露醇-乳糖（1∶1），－80℃條件下預凍24 h，冷凍干燥過程－80℃條件下進行24 h，制得Lip@PF-309 凍干脂質體。外觀如圖4所示，凍干品外觀疏松平整，為白色粉末狀，高度無明顯塌陷。凍干脂質體的再分散性良好，加入與凍干前脂質體樣品相同體積的PBS 溶液，振搖后，凍干品即可復溶。凍干前樣品粒徑和包封率分別為112.25 nm 和92.11%，凍干后樣品的粒徑和包封率分別為115.77 nm 和90.35%，可見凍干后脂質體的粒徑略有增大，包封率略有減小，但均無明顯的變化趨勢。

圖4 Lip@PF-309 混懸液（A）及其凍干品（B）Fig 4 Lip@PF-309 suspension（A）and freeze-dried product（B）

2.8 溶血實驗及血漿穩(wěn)定性考察

2.8.1 體外溶血實驗 取新鮮鼠血，收集于肝素鈉采血管中。3000 r·min－1離心5 min，棄去上層血漿，加入約10 倍量生理鹽水搖勻后，4℃、2500 r·min－1離心10 min，棄去上層清液洗滌2～3 次，直至上清液不再呈紅色為止。吸取底層紅細胞0.8 mL，用生理鹽水稀釋至40 mL，搖勻，即得2%紅細胞混懸液[13]。取8 只潔凈離心管，編號依次為A1、A2、A3、B1、B2、B3、陰性對照、陽性對照。A1、A2、A3分別為10、20、40 μg·mL－1的PF-309 對照品溶液；B1、B2、B3分別為PF-309 質量濃度為10、20、40 μg·mL－1的脂質體混懸液；陰性對照為生理鹽水；陽性對照為蒸餾水。每管加入適量的2%紅細胞混懸液，立即置于（37±0.5）℃的恒溫水浴中孵育30 min，離心取上清液，在535 nm 處測定吸光度（A值），計算溶血率。溶血率（%）＝（Ai－A0）/（A1－A0）×100%，Ai為各供試品的吸光度，A0為陰性對照吸光度，A1為陽性對照吸光度，溶血率＞5%則表明發(fā)生溶血。結果見表4，當PF-309 對照品達到20 μg·mL－1時的溶血率＞90%，而將PF-309 包裹在脂質體中，當PF-309高達400 μg·mL－1時，也未出現(xiàn)溶血（溶血率僅為1.88%），表明脂質體的包裹可有效解決PF-309 溶血的不良反應。

表4 PF-309 溶液及PF-309 脂質體的體外溶血活性Tab 4 In vitro hemdytic activity of PF-309 solution and PF-309 liposome

2.8.2 血漿穩(wěn)定性實驗 脂質體在血液中穩(wěn)定是發(fā)揮藥物遞送作用的關鍵，從體循環(huán)向各組織器官或者體液轉運的過程中，穩(wěn)定的脂質體形態(tài)有助于藥物更好地發(fā)揮藥效[14-15]。取新鮮鼠血置于肝素鈉采血管中，迅速于4000 r·min－1低溫離心10 min，取上層血漿待用[16]。精密吸取空白血漿450 μL 于離心管中，加入藥物質量濃度為200 μg·mL－1的Lip@PF-309 混懸液50 μL（重復5 份），渦旋混勻1 min，得20 μg·mL－1的樣品液，37 ℃水浴條件下分別放置0 min、10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 后取樣。取血漿樣品200 μL 加入離心管，渦旋30 s，加乙酸乙酯3 mL，渦旋，于3000 r·min－1離心10 min，吸取上清液于另一試管中，37℃真空干燥后，加流動相100 μL 復溶，渦旋，離心，用0.22 μm 的有機濾膜過濾后，采用HPLC 方法檢測，記錄色譜圖，計算包封率。結果見表5。

表5 不同時間點Lip@PF-309 在血漿中的包封率及粒徑變化Tab 5 Encapsulation efficiency and particle size change of Lip@PF-309 in the plasma at different time points

由表5結果可知，Lip@PF-309 在血漿中包封率下降的速度較慢，至6 h 時Lip@PF-309 的包封率仍大于60%，這表明Lip@PF-309 注射入血后能夠較長時間地保持脂質體形態(tài)完整，穩(wěn)定的劑型結構可以使藥物在遞送系統(tǒng)的包載下，更好地到達靶部位發(fā)揮作用。

3 討論

本研究旨在構建Lip@PF-309 遞藥系統(tǒng)，利用脂質體的包埋技術，來提高藥物的溶解性、穩(wěn)定性及生物相容性，改善藥物的溶血作用，并對其進行體外質量評價。在實體瘤生長部位，病變導致毛細血管的通透性增加，適當粒徑范圍的脂質體，在病變部位的滲透性和滯留量增加。粒徑作為影響納米載藥系統(tǒng)藥動學與藥物靶向性的主要因素，決定著脂質體在體內的分布與被動靶向性作用[17]。掃描電鏡下觀察Lip@PF-309 外觀圓整、粒徑均一，粒徑＜200 nm，與納米粒度儀測試結果一致，符合靜脈給藥的要求。體外釋放實驗可知，Lip@PF-309 脂質體混懸液相比PF-309溶液，表現(xiàn)出了較好的緩釋效果。首先可能是脂質體作為藥物的儲存形式，能使包埋的內含物緩慢釋放；其次陰離子脂質體表面的負電荷與帶正電荷的藥物分子產生靜電吸附作用，提高了藥物的包封效率，達到緩釋的作用效果[18]；除此之外脂質體表面電荷的性質會影響納米粒子的穩(wěn)定性、生物分布以及細胞親和力，Lip@PF-309 表面帶有少量的負電荷，較中性粒子可以更快更大程度地通過內吞促進細胞攝取，同時少量的負電荷可以降低粒子的聚集性，避免吞噬機制，從而延長脂質體在體內的循環(huán)時間[19]。具有苯環(huán)或共軛結構的化合物對乙酰膽堿酯酶有抑制作用，藥物作用于紅細胞膜的乙酰膽堿酯酶，使其受到高度抑制，使紅細胞破壞加速造成溶血[20]。經體外溶血實驗發(fā)現(xiàn)，PF-309 溶液具有顯著的溶血現(xiàn)象，這也是PF-309 在臨床中引起毒副反應的主要原因之一，本文制備的Lip@PF-309，當脂質體中藥物質量濃度高達400 μg·mL－1時，溶血率僅為1.88%，表明脂質體的包裹可有效解決PF-309 引發(fā)的溶血不良反應，這為新劑型的安全性提供了參考。

本研究采用薄膜分散法制備Lip@PF-309，制備工藝簡單，且制得的脂質體納米粒有較高的包封率和良好的體外緩釋效果，顯著降低了PF-309 的溶血作用，脂質體在血液中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在進入血循環(huán)到達靶部位之前，完整的形態(tài)有助于藥物更好地發(fā)揮藥效，這為Lip@PF-309 的后續(xù)體內藥動學及藥效研究奠定了重要基礎，對PF-309 藥物新劑型的研發(fā)具有一定的參考價值。