曹小如， 趙雪竹， 譚凡成， 田 野， 時(shí) 颯△

（1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱150001；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150001）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種慢性代謝性疾病，是冠心病、腦卒中和外周血管疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，常伴有動脈炎癥反應(yīng)［1］。根據(jù)AS的“炎癥學(xué)說”，在早期血管病變中，循環(huán)中的單核細(xì)胞募集至病變部位，浸潤至血管壁內(nèi)膜下并分化形成巨噬細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫清除反應(yīng)［2］。隨著斑塊進(jìn)展，病原體相關(guān)分子模式［如脂多糖（li?popolysaccharides，LPS）］或損傷相關(guān)分子模式［如氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）］可通過與巨噬細(xì)胞膜表面模式識別受體結(jié)合，激活斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，加劇AS發(fā)展［3］。近年，代謝活動參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞炎癥功能備受關(guān)注［4］。Bekkering等［5］報(bào)道，與正常對照組相比，有缺血癥狀A(yù)S患者循環(huán)中的單核細(xì)胞糖酵解代謝明顯增加，強(qiáng)調(diào)了糖酵解過程參與AS進(jìn)展的臨床意義。斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞糖酵解代謝增加表現(xiàn)出炎性M1型巨噬細(xì)胞表型，而降低糖酵解可以減輕巨噬細(xì)胞炎癥，進(jìn)而抑制AS進(jìn)展［6-8］。因此，本文綜述炎性巨噬細(xì)胞的糖酵解及其調(diào)控機(jī)制，以及巨噬細(xì)胞糖酵解代謝調(diào)控AS相關(guān)研究，并探討降低炎性巨噬細(xì)胞糖酵解減輕AS的治療策略。

1 細(xì)胞糖酵解代謝增加的意義

1923 年，奧托·沃伯格證實(shí)腫瘤細(xì)胞在有氧條件下仍以較高速率的糖酵解代謝為主，這一現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)［9］。進(jìn)一步研究證實(shí)，由于惡性增殖的腫瘤細(xì)胞對生物大分子和生物能量的需求增加，細(xì)胞糖酵解代謝增加，從而提高自身對缺氧環(huán)境的耐受能力，以及在有氧條件下與正常細(xì)胞競爭生存的能力。高通量糖酵解在短時(shí)間內(nèi)可以比線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生更多ATP［10］。并且，糖酵解中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖分流到磷酸戊糖途徑（pentose phos?phate pathway，PPP）生成核糖、NADPH等促進(jìn)核酸、脂肪酸和固醇等大分子物質(zhì)合成，從而參與細(xì)胞核、膜結(jié)構(gòu)生成和氧化還原反應(yīng)調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞合成代謝［11］。此外，一般認(rèn)為丙酮酸進(jìn)入線粒體生成乙酰輔酶A，作為三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)的主要碳源。而Hui等［12］證實(shí)在缺氧或高能量需求時(shí)，循環(huán)中乳酸是除大腦外所有組織TCA循環(huán)的主要碳源。因此，細(xì)胞糖酵解代謝增加可以快速提供細(xì)胞活化所需的能量和生物大分子物質(zhì)。與腫瘤細(xì)胞類似，糖酵解增加是免疫細(xì)胞快速活化的標(biāo)志性代謝改變［13］。M1型巨噬細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞和Th17細(xì)胞等被炎癥因子激活，細(xì)胞糖酵解代謝增加，能夠快速產(chǎn)生ATP和生物大分子物質(zhì)來執(zhí)行其特定的效應(yīng)功能，如巨噬細(xì)胞的吞噬作用、炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生、樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞和Th17細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17產(chǎn)生［14］。

2 巨噬細(xì)胞糖酵解代謝

細(xì)胞代謝在巨噬細(xì)胞活化過程中發(fā)揮著決定性作用。M1和M2型巨噬細(xì)胞利用不同的代謝方式為其效應(yīng)功能提供能量。M1型巨噬細(xì)胞利用糖酵解代謝為劇烈、短暫的殺菌或促炎反應(yīng)迅速提供能量；而M2型巨噬細(xì)胞利用線粒體氧化磷酸化和脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）長時(shí)間、持續(xù)地生成ATP，為組織修復(fù)提供助力［15］。這些代謝差異最初被認(rèn)為反映細(xì)胞的底物利用，但現(xiàn)在研究認(rèn)為細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)變可以直接改變巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)和炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)向糖酵解，促進(jìn)炎性M1型巨噬細(xì)胞表型［16］。2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2DG）是一種葡萄糖類似物，能夠競爭性地抑制糖酵解，研究證實(shí)2DG通過阻斷M1型巨噬細(xì)胞糖酵解，抑制其炎癥表型包括吞噬功能、炎性細(xì)胞因子分泌及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生［16-17］。而另有研究證實(shí)，乙莫克舍（etomoxir）是一種FAO代謝關(guān)鍵酶肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1α（carni?tine palmitoyl transferase-1α，CPT-1α）抑制劑，可以降低M2型巨噬細(xì)胞的線粒體耗氧率和儲備呼吸能力，從而抑制M2型巨噬細(xì)胞的線粒體氧化磷酸化，并減少其表面標(biāo)志物CD301、CD206和RELMα的表達(dá)［18］。過表達(dá)巨噬細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1β可驅(qū)動線粒體氧化磷酸化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞激活并抑制炎癥因子產(chǎn)生［19］。因此，通過干預(yù)代謝方式調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)和炎癥反應(yīng)有利于炎癥性疾病的治療。

目前調(diào)控炎性巨噬細(xì)胞糖酵解上調(diào)的機(jī)制已基本明確。Rodríguez-Prados等［15］使用基于葡萄糖示蹤物的代謝組學(xué)方法證實(shí)，多種Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）途徑激活均可增加小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞糖酵解代謝。以被廣泛研究的TLR4配體LPS和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）刺激的M1型巨噬細(xì)胞為例，調(diào)控炎性巨噬細(xì)胞糖酵解代謝的機(jī)制主要包括3種途徑：（1）直接改變糖酵解蛋白表達(dá)水平：LPS促進(jìn)6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase，PFK2）亞型表達(dá)發(fā)生變化，從肝臟形式（liver form，LPFK2）轉(zhuǎn)為更活躍的普遍存在形式（ubiquitous form，u-PFK2），而u-PFK2催化6-磷酸果糖生成2，6-二磷酸果糖，后者的濃度增加可激活糖酵解關(guān)鍵酶6-磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase 1，PFK1），增加糖酵解通量［15］。同時(shí)，LPS快速下調(diào)巨噬細(xì)胞碳水化合物激酶樣蛋白（carbohydrate kinase-like protein，CARKL），從而增加PPP通量，維持M1型巨噬細(xì)胞合成代謝［20］。（2）缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）依賴性途徑：Blouin等［21］證明LPS刺激巨噬細(xì)胞HIF-1α蛋白穩(wěn)定表達(dá)，并形成功能性異二聚體復(fù)合物，與糖酵解相關(guān)基因和炎癥基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，激活炎性M1型巨噬細(xì)胞表型。同時(shí)，NF-κB、AKT/mTOR等炎癥通路同樣可以調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)糖酵解代謝［22-24］。另外，M1型巨噬細(xì)胞TCA循環(huán)中2個(gè)環(huán)節(jié)受損，導(dǎo)致琥珀酸和檸檬酸累積，過量的琥珀酸抑制脯氨酸羥化酶的活性，從而維持HIF-1α穩(wěn)定［25］。而檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)生成NADPH，促進(jìn)炎癥介質(zhì)ROS生成，ROS具有穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)的作用，HIF-1α增加進(jìn)一步激活糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持M1型巨噬細(xì)胞糖酵解代謝［26］。此外，存在LPS刺激的情況下，缺氧激活HIF-1α通路更顯著增加巨噬細(xì)胞糖酵解通量［6］。（3）非HIF依賴性途徑：LPS激活巨噬細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associ?ated factor 6，TRAF6）和TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase-1，TBK-1），TBK-1磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的第727位絲氨酸殘基，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞糖酵解增加和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［27］。Hedl等［28］證實(shí)，LPS激活干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）-AKT2信號通路，M1型巨噬細(xì)胞糖酵解增加，并促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化。

3 單核-巨噬細(xì)胞糖酵解增加促進(jìn)AS進(jìn)展

在AS早期病變時(shí)，骨髓造血細(xì)胞的糖酵解促進(jìn)髓系細(xì)胞生成，導(dǎo)致循環(huán)中單核細(xì)胞在斑塊的積累增加，間接促進(jìn)斑塊病變生長［8，29］。而單核細(xì)胞的糖酵解增加同樣促進(jìn)AS的進(jìn)展。與健康個(gè)體的循環(huán)單核細(xì)胞相比，AS患者的循環(huán)中單核細(xì)胞具有更高的糖酵解通量，其中單核細(xì)胞糖酵解增加程度與線粒體活性氧生成、氧化應(yīng)激和炎癥信號激活程度成正比［6］。在進(jìn)展性病變中，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞在氧化脂質(zhì)、氧化應(yīng)激和缺氧等刺激下，穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α，并且和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）和丙酮酸脫 氫 酶 激 酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）的表達(dá)同步，表明斑塊巨噬細(xì)胞糖酵解代謝增強(qiáng)。此外，在斑塊內(nèi)富含巨噬細(xì)胞區(qū)域IL-1β同樣高表達(dá)［30-31］，說明糖酵解增加參與AS斑塊炎癥進(jìn)展。另一項(xiàng)動物研究中，骨髓特異性敲除Hif-1α低密度脂蛋白受體敲除（low-density lipoprotein receptor knockout，Ldlr-/-）小鼠的AS斑塊形成被抑制，進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α及其介導(dǎo)的糖酵解在AS進(jìn)展中的促進(jìn)作用［32］。

然而，另有研究指出適度的糖酵解過程可以維持巨噬細(xì)胞吞噬功能，過度抑制糖酵解反而加劇AS進(jìn)展。Morioka等［33］的研究證實(shí)，Slc2a1基因（編碼GLUT1的基因）敲除小鼠的骨髓源性巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出胞吞能力下降；將髓系Slc2a1缺陷小鼠的骨髓移植到Ldlr-/-小鼠骨髓內(nèi)，高脂喂養(yǎng)12周后，小鼠主動脈根部斑塊壞死核心區(qū)面積顯著增加，壞死核心區(qū)內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加，表明斑塊內(nèi)Slc2a1缺失巨噬細(xì)胞有效吞噬功能下降。因此，適度的糖酵解也是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞有效吞噬的關(guān)鍵，可以防止形成斑塊壞死核心區(qū)，避免易損斑塊破裂。

4 抑制丙酮酸激酶M 2（pyruvate kinase M 2，PKM 2）通過介導(dǎo)糖酵解減輕AS進(jìn)展

PKM2是糖酵解最后一個(gè)關(guān)鍵限速酶，在腫瘤細(xì)胞中特異性地高表達(dá)。PKM2主要以2種構(gòu)型存在：四聚體形式（非活躍狀態(tài)）和二聚體形式（活躍狀態(tài)）。四聚體PKM2具有糖酵解酶活性，催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。二聚體PKM2具有磷酸激酶活性，通過轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核與具有調(diào)控活性的蛋白相互作用從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，二聚體PKM2可以被分泌至細(xì)胞外，血漿和糞便中的PKM2可作為大腸癌、乳腺癌等的診斷標(biāo)志物［34］。

近年，PKM2被證實(shí)在炎性巨噬細(xì)胞中亦高表達(dá)，同時(shí)介導(dǎo)免疫相關(guān)功能。PKM2不僅是受HIF-1α調(diào)控的靶基因，它還直接與HIF-1α相互作用并促進(jìn)HIF-1α調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。Palsson-McDermott等［35］發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞二聚體PKM2轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，作為HIF-1α的結(jié)合蛋白，促進(jìn)糖酵解基因和炎癥基因IL-1β轉(zhuǎn)錄（圖1）；選擇性PKM2小分子激活劑TEPP-46（ML265）可以恢復(fù)PKM2酶活性，促使PKM2四聚體化，并阻止二聚體PKM2核轉(zhuǎn)位，還可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解和IL-1β表達(dá)，從而促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。同時(shí)，PKM2促進(jìn)巨噬細(xì)胞NLRP3（NLR family pyrin domain con?taining 3）炎癥小體和AIM2（absent in melanoma 2）炎癥小體的激活；PKM2依賴的糖酵解可促進(jìn)RNA依賴性蛋白激酶（RNA-dependent protein kinase，PKR）的磷酸化，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活，分泌IL-1β、IL-18和高遷移率族蛋白B1［36-37］。

PKM2最初通過增加腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)促進(jìn)腫瘤生長。Shirai等［7］證實(shí)，PKM2同樣參與AS的發(fā)生，冠心病患者循環(huán)單核細(xì)胞體外分化的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出二聚體PKM2表達(dá)增加、糖酵解通量增加和ROS生成上調(diào)，二聚體PKM2轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，磷酸化STAT3，導(dǎo)致下游炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)增加。Kumar等［38］證實(shí)，oxLDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中PKM2第105位酪氨酸殘基磷酸化，并促進(jìn)PKM2轉(zhuǎn)位入核，增加HIF-1α靶基因Ldha、Slc2a1和Il-1β的轉(zhuǎn)錄及IL-1β的分泌，從而促進(jìn)糖酵解代謝和炎癥反應(yīng)。紫草素（shikonin，SKN）是PKM2的有效抑制劑，通過抑制巨噬細(xì)胞糖酵解代謝發(fā)揮抗炎作用［36，39］。SKN可以減緩高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的載脂蛋白E敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠AS的形成，降低了主動脈斑塊內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表達(dá)。這種治療作用主要由于SKN對PKM2的抑制，從而減弱了細(xì)胞活化所需的糖酵解代謝［40］。因此，糖酵解限速酶PKM2是減輕巨噬細(xì)胞炎癥、預(yù)防AS的新靶點(diǎn)。

5 靶向降低巨噬細(xì)胞糖酵解代謝水平可減輕AS炎癥

降脂治療雖然有效降低了心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，但是患者仍存在殘余風(fēng)險(xiǎn)，部分原因是低度慢性炎癥未減輕［41］。CANTOS試驗(yàn)顯示，用canakinumab靶向IL-1β可降低事件復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，表明抗炎策略在AS治療中具有很大的應(yīng)用前景［42］。直接的全身抗炎治療有影響機(jī)體免疫功能及增加腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的可能性，而干預(yù)巨噬細(xì)胞代謝的方式提高了抗炎治療的靶向性。

二甲雙胍作為2型糖尿病的一線治療藥物，通過調(diào)節(jié)胰島素靶細(xì)胞線粒體功能和能量傳感器AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性來改善葡萄糖和脂肪酸代謝［43］。He等［44］的研究表明，二甲雙胍可減輕oxLDL誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化，增強(qiáng)GLUT1介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并且增加線粒體氧化代謝，從而誘導(dǎo)炎性巨噬細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)變。單核細(xì)胞受到炎性刺激如oxLDL，通過代謝和表觀遺傳重編程誘導(dǎo)持久的促炎癥、致AS表型稱為訓(xùn)練免疫［45］。Keating等［46］的研究評估了糖酵解基因變異對單核細(xì)胞訓(xùn)練免疫能力的影響，結(jié)果顯示糖酵解酶磷酸果糖激酶2/果糖-2，6-二磷酸酶3（phosphofructo?kinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase 3，PFKFB3）和血小板型磷酸果糖激酶（the platelet isoform of phos?phofructokinase，PFKP）的突變可以降低oxLDL誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫能力；而體內(nèi)給予二甲雙胍使oxLDL誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞訓(xùn)練免疫的能力減弱。上述研究提示二甲雙胍作為AS抗炎治療藥物的可能性。但是二甲雙胍作為降糖藥物可導(dǎo)致患者乳酸中毒，并且目前臨床只適用于高血糖患者的AS防治。

Figure 1.Schematic diagram of the mechanism of glycolysis regulation in inflammatory M1 macrophages.Glucose uptake increases in M1 macrophages stimulated by LPSand IFNγ.LPSincreases glycolytic flux through down-regulating CARKL protein ex?pression and up-regulating u-PFK2 expression.LPSalso impairs the TCA cycle，and causes the accumulation of citrate and succinate.Citrate is transported to the cytoplasm to generate NADPH，which promoting ROSgeneration.ROSand succi?nate stablize the expression of HIF-1α，thereby increasing the transcription of target genes related to glycolysis and IL-1β.Simultaneously，inflammatory pathways such as NF-κB and AKT/mTOR regulate the expression of HIF-1αto promote gly?colytic metabolism.In addition，with the stimulation of LPS，hypoxia significantly enhances glycolytic metabolism by acti?vating the HIF-1αpathway.Finally，LPSactivates signaling cascade to recruit TRAF6-TBK-1 protein and activates the IRF5-AKT2 signaling through a non-HIF-1α-dependent pathway，leading to macrophage glycolysis enhancement and fol?lowing activation of M1 macrophage inflammation.圖1 炎性M 1巨噬細(xì)胞糖酵解代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的示意圖

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）參與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化被廣泛報(bào)道［47］。Ouimet等［48］證實(shí)，miR-33通過改變巨噬細(xì)胞代謝方式調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥表型；抑制巨噬細(xì)胞miR-33表達(dá)可以激活A(yù)MPK通路，上調(diào)FAO，并減弱糖酵解代謝，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型；體內(nèi)抗miR-33治療可以減少小鼠主動脈斑塊面積；通過激光捕獲顯微切割分離Ldlr-/-小鼠斑塊病變巨噬細(xì)胞，與對照組相比，抗miR-33治療后小鼠斑塊內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因（Arg1和Mrc1）富集，而M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因（Ifnb1、Il1a和Nox1）表達(dá)減少?？筸iR-33治療雖然可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型，但不能排除對體內(nèi)其他類型細(xì)胞的影響，且目前尚缺乏臨床試驗(yàn)證明其安全性及有效性。

6 總結(jié)與展望

巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和炎癥反應(yīng)與細(xì)胞糖酵解代謝的關(guān)系緊密交織，炎性巨噬細(xì)胞糖酵解的增加促進(jìn)AS斑塊的起始、進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸。研究顯示，二甲雙胍和miRNA抑制劑等可以降低巨噬細(xì)胞糖酵解速率，增加線粒體氧化代謝，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕AS，提示降低炎性巨噬細(xì)胞糖酵解水平可能成為AS的治療策略。但是，目前從抑制巨噬細(xì)胞糖酵解出發(fā)，開展AS防治研究仍面臨眾多挑戰(zhàn)，例如在體斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞代謝表型鑒定技術(shù)仍不完善、斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞糖酵解代謝相關(guān)分子靶點(diǎn)仍有待探索等。因此，深入探究炎性巨噬細(xì)胞糖酵解相關(guān)分子靶點(diǎn)并開發(fā)在體代謝表型檢測技術(shù)，有望為研究者從抑制AS中巨噬細(xì)胞糖酵解代謝出發(fā)穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)AS提供理論基礎(chǔ)和有效技術(shù)手段。