陳全順，陳向東，汪 輝，楊 景，強(qiáng)俊磊，田宇航，李弘遠(yuǎn)，蒲培熙

中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京211198

銅綠假單胞菌一直是醫(yī)院感染的主要致病菌，該病原體高水平耐藥性嚴(yán)重威脅人類生命健康。噬菌體是特異性感染細(xì)菌的活病毒，也是地球上數(shù)量最多的生物體[1]，具有裂解耐藥菌、殺菌特異性強(qiáng)、對(duì)人體無副作用等獨(dú)特性的優(yōu)勢(shì)[2]，可能成為治療耐藥菌感染的新型抗菌劑。

本實(shí)驗(yàn)以臨床分離的銅綠假單胞菌為宿主菌，從污水土壤樣品中分離篩選出強(qiáng)裂解性寬譜噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性和體外抗菌活性分析，并進(jìn)一步探索其治療小鼠全身感染的效果，為深入研究噬菌體應(yīng)用于銅綠假單胞菌感染奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 樣品和菌株

污水和土壤樣品采集于南京市江寧區(qū)自然環(huán)境。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由廣州南方醫(yī)院臨床檢驗(yàn)室提供，大腸埃希菌ATCC25922由中國(guó)藥科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18～20 g 清潔級(jí)ICR 雌性小鼠，購(gòu)買于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，生產(chǎn)許可：SCXK（蘇）2017-0007，由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑和儀器

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB、瓊脂粉、MHA 培養(yǎng)基（北京三藥科技有限公司）；上層和下層培養(yǎng)基為NB 中分別添加0.7%和1.5%瓊脂；SM 緩沖液參照文獻(xiàn)[3]配制；藥敏紙片（溫州市康泰生物技術(shù)有限公司）。

高速低溫離心機(jī)（Thermo 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；GHX-9080B 恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；JEM-1400 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

2 方 法

2.1 噬菌體的分離篩選

2.1.1 藥敏紙片法篩選臨床耐藥菌過夜培養(yǎng)的菌液（銅綠假單胞菌和大腸埃希菌）用無菌生理鹽水稀釋到濃度為0.5 號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁?，棉拭子沾取菌液，均勻涂布整個(gè)MHA 培養(yǎng)基表面，室溫靜置3 min，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，每個(gè)平皿貼5 片，培養(yǎng)16～20 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

將篩選到的銅綠假單胞菌的耐藥菌株培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各取3 mL 培養(yǎng)液混勻，作為分離噬菌體的混合菌液。

2.1.2 噬菌體的分離純化采集的污水和土壤樣品充分混勻，300 mL 的樣品混合液與NB 培養(yǎng)基干粉混合，加入新鮮的銅綠假單胞菌混合液，37 ℃、30 r·min-1輕微振蕩培養(yǎng)24 h，此步為噬菌體的富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)液8000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm 過濾器過濾除菌，濾液用SM 緩沖液倍比稀釋。雙層平板法[4]進(jìn)行噬菌體的分離純化，在上層培養(yǎng)基中加入適宜稀釋梯度的濾液與銅綠假單胞菌菌液各0.2 mL，混勻后傾倒于下層培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)。次日挑取單個(gè)噬菌斑于SM 緩沖液，4 ℃冰箱靜置過夜，稀釋后作雙層平板，重復(fù)挑單斑3～5 次純化噬菌體。

2.1.3 噬菌體的篩選采用斑點(diǎn)法[5]篩選強(qiáng)裂解性噬菌體，取0.2 mL 菌液與上層培養(yǎng)基充分混勻，傾倒于下層培養(yǎng)基，凝固后滴加5 μL 噬菌體液，37 ℃培養(yǎng)。次日，滴有噬菌體處無菌生長(zhǎng)且清晰透亮的即為強(qiáng)裂解性噬菌體。另外接種40 株銅綠假單胞菌作為指示菌，斑點(diǎn)法測(cè)定裂解譜。

2.2 噬菌體的主要生物學(xué)特性

2.2.1 透射電鏡觀察噬菌體純化后的高滴度噬菌體懸液（109～1010PFU·mL-1）滴在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，2%（w/v）磷鎢酸（pH7.2）進(jìn)行負(fù)染色，電鏡觀察并采集圖像。

2.2.2 熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性檢測(cè)噬菌體在不同溫度下的穩(wěn)定性，取0.5 mL 噬菌體液于35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃孵育1 h，每個(gè)溫度作3 組重復(fù)，雙層平板法計(jì)數(shù)噬菌斑。

檢測(cè)噬菌體在不同pH 值下的穩(wěn)定性，將NB培養(yǎng)液調(diào)至不同pH 值（2、4、6、7、8、10、12），過濾除菌，與0.1 mL 噬菌體液混勻，每個(gè)pH 值作3 組重復(fù)，37 ℃孵育1 h，雙層平板法計(jì)數(shù)噬菌斑。

2.2.3 最佳感染復(fù)數(shù)和一步生長(zhǎng)曲線將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照感染復(fù)數(shù)為0.001、0.01、0.1、1、10 比例分別加入噬菌體和宿主菌，每個(gè)比例3 組重復(fù)，搖床培養(yǎng)3 h，離心取上清液測(cè)滴度，產(chǎn)生最高噬菌體滴度的比例為最佳感染復(fù)數(shù)（the optimal multiplicity of infection，MOI）。

按最佳感染復(fù)數(shù)的比例混合宿主菌和噬菌體，37 ℃孵育15 min 后，離心棄上清液，沉淀物洗滌兩次再重懸沉淀，搖床培養(yǎng)，每間隔10 min 直至120 min取樣0.2 mL，離心取上清液測(cè)滴度。繪制噬菌體一步生長(zhǎng)曲線，計(jì)算噬菌體的潛伏期、裂解期、裂解量（平臺(tái)期噬菌體的滴度/宿主菌初始濃度）。

2.3 噬菌體的體外抗菌活性

宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，噬菌體處理組按最佳感染復(fù)數(shù)的比例加入噬菌體，宿主菌對(duì)照組加入等量生理鹽水，37 ℃培養(yǎng)，分別在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 定時(shí)取樣檢測(cè)OD600值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3 組重復(fù)。

2.4 噬菌體治療小鼠全身感染的效果

體重為18～20 g ICR 雌性小鼠20 只，隨機(jī)分為4 組，每組5 只。腹腔注射不同劑量的銅綠假單胞菌Pa24 菌液（2×107、2×108、2×109、2×1010CFU/只）,觀察小鼠7 天，引起一個(gè)組小鼠全部死亡的劑量為最小致死量。

體重為18～20 g ICR 雌性小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組。噬菌體治療組（13 只）：注射最小致死量的銅綠假單胞菌菌液和噬菌體PPa24；模型對(duì)照組（13只）：注射最小致死量的銅綠假單胞菌菌液和生理鹽水；噬菌體對(duì)照組（4 只）：僅注射噬菌體PPa24。注射最小致死量的菌液5 h 后，噬菌體治療組和模型對(duì)照組隨機(jī)各選取5 只小鼠，眼眶采血100～200 μL 與肝素混合，梯度稀釋后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。其余小鼠持續(xù)觀察7 天，記錄每日死亡情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 噬菌體的分離篩選

3.1.1 臨床耐藥菌的篩選結(jié)果結(jié)合《臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）指南》，根據(jù)抑菌圈直徑，將每株菌的藥敏性分為敏感（S）、中介耐藥（I）、耐藥（R）三個(gè)級(jí)別，共篩選到27 株銅綠假單胞菌的耐藥菌株。本實(shí)驗(yàn)分離到噬菌體的3 株銅綠假單胞菌Pa3、Pa24、Pa27 是分離自醫(yī)院患者傷口感染的病原菌，藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，對(duì)5 類抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922 形成的抑菌圈符合藥敏標(biāo)準(zhǔn)。

表1 抑菌圈直徑（mm）和藥敏性

3.1.2 噬菌體的分離篩選結(jié)果噬菌體的富集培養(yǎng)液與銅綠假單胞菌Pa3、Pa24、Pa27 作雙層平板時(shí)出現(xiàn)了噬菌斑，說明噬菌體富集培養(yǎng)液中有針對(duì)這3 株銅綠假單胞菌的噬菌體。反復(fù)挑單斑純化，獲得3 株較純的噬菌體，分別命名為銅綠假單胞菌噬菌體PPa3、PPa24、PPa27。

噬菌體PPa24 的噬菌斑清晰且邊緣整齊，直徑0.80～1.21 mm，如圖1 所示。斑點(diǎn)法形成的噬菌斑完全清透，如圖2 所示，呈現(xiàn)出裂解性噬菌體特征。噬菌體PPa3、PPa24、PPa27 對(duì)40 株銅綠假單胞菌的裂解比例分別是2/40、20/40、15/40。綜合比對(duì)3 株噬菌體的裂解活性和裂解譜，最終選定銅綠假單胞菌噬菌體PPa24 作為下一步研究重點(diǎn)。

圖1 雙層瓊脂平板法形成的噬菌斑（PPa24）

圖2 斑點(diǎn)法形成的噬菌斑（PPa24）

3.2 噬菌體的主要生物學(xué)特性

3.2.1 噬菌體的微觀形態(tài)噬菌體PPa24 的形態(tài)如圖3 所示，有一個(gè)正二十面體頭部，直徑為（75±3）nm，連接長(zhǎng)度（220±4）nm 的非可收縮性尾巴。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)的分類標(biāo)準(zhǔn)，PPa24 屬于長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphoviridae）。

圖3 噬菌體PPa24 的電鏡圖

3.2.2 熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性噬菌體PPa24 的熱穩(wěn)定性如圖4 所示，在35 ℃、45 ℃、55 ℃溫度下作用1 h 仍保持初始滴度，能耐受55 ℃的溫度，熱穩(wěn)定性較高。PPa24 的pH 穩(wěn)定性如圖5 所示，在pH6～10 條件下滴度不變，甚至在pH 值為12 的強(qiáng)堿條件下依然保持一定的活性，說明其對(duì)酸堿度的適應(yīng)范圍較寬。

圖4 噬菌體PPa24 的熱穩(wěn)定性

圖5 噬菌體PPa24 的pH 穩(wěn)定性

3.2.3 最佳感染復(fù)數(shù)和一步生長(zhǎng)曲線最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果如表2 所示，噬菌體PPa24 以0.1 的比例擴(kuò)增時(shí)，能產(chǎn)生最高滴度的子代噬菌體，其感染宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。一步生長(zhǎng)曲線如圖6所示，從曲線可知噬菌體PPa24 的潛伏期為20 min，裂解期為70 min，裂解量為62 PFU·cell-1。

表2 噬菌體PPa24 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定結(jié)果

圖6 噬菌體PPa24 的一步生長(zhǎng)曲線

3.3 噬菌體的體外抗菌活性

噬菌體PPa24 對(duì)宿主菌的體外裂解曲線如圖7所示，宿主菌對(duì)照組的OD600值一直處于上升趨勢(shì)，菌液逐漸渾濁，而加入噬菌體PPa24 的細(xì)菌培養(yǎng)液后，OD600值先保持初始吸光度值，之后有緩和下降的趨勢(shì)，肉眼可見菌液逐漸澄清，說明噬菌體PPa24大量裂解培養(yǎng)液中的細(xì)菌，有效抑制宿主菌的生長(zhǎng)。

圖7 噬菌體PPa24 對(duì)宿主菌的裂解曲線

3.4 噬菌體治療小鼠全身感染的效果

腹腔注射最小致死量的菌液（2×109CFU/只）建立小鼠全身感染模型，感染5 h 后，計(jì)數(shù)血液載菌量的結(jié)果如圖8 所示，噬菌體治療組PPa24 的血液載菌量相對(duì)于模型對(duì)照組顯著降低了約3.8 個(gè)對(duì)數(shù)單位（P＜0.01）。小鼠7 天存活率結(jié)果如圖9 所示，噬菌體治療組PPa24 的存活率顯著提高到75%（P＜0.001），模型對(duì)照組小鼠全部死亡，噬菌體對(duì)照組小鼠全部存活。

圖8 5 h 后的血液載菌量

圖9 小鼠7 天存活率

4 討論

銅綠假單胞菌的耐藥問題日益嚴(yán)重[6]，一方面是由于對(duì)多種抗生素固有耐藥，另一方面是存在獲得性耐藥機(jī)制，主要包括產(chǎn)生水解酶和主動(dòng)外排泵等。故迫切需要開發(fā)新的治療手段。噬菌體具有完全不同于抗生素的抗菌機(jī)制，控制耐藥菌感染有巨大的應(yīng)用潛力[7]。

從自然資源中成功分離到一株銅綠假單胞菌噬菌體PPa24，噬菌斑清晰透亮，具有裂解性噬菌體的典型特征，對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌的裂解比例為20/40，比文獻(xiàn)[8]報(bào)道的銅綠假單胞菌噬菌體的裂解譜更寬（12/27）。PPa24 在35 ℃～55 ℃溫度下和pH6～10 條件下作用1 h 仍能保持較好的抗菌活性，文獻(xiàn)報(bào)道的銅綠假單胞菌噬菌體也在60 ℃溫度下基本失活，適宜的酸堿度范圍為pH4～9[9]。PPa24 的熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，支持了其在噬菌體治療中儲(chǔ)存和使用的可行性。PPa24 的潛伏期為20 min，裂解量為62，比文獻(xiàn)報(bào)道的銅綠假單胞菌噬菌體潛伏期（30 min）更短[10]，裂解量（20）也更大[11]，說明PPa24 裂解宿主菌的速度快且能力強(qiáng)。

噬菌體PPa24 可以明顯降低細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600值，有效抑制宿主菌的生長(zhǎng)，這一結(jié)果與Dong Z 等[12]報(bào)道的噬菌體抑制宿主菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的研究結(jié)果相似。PPa24 治療小鼠全身感染可顯著降低血液載菌量，并使小鼠存活率提高至75%，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的噬菌體（存活率為40%）的保護(hù)作用[13]，也有文獻(xiàn)報(bào)道了噬菌體通過不同給藥途徑治療銅綠假單胞菌感染[14]，結(jié)果顯示肌肉注射、皮下注射、腹腔注射的小鼠存活率分別為22%、16%、82%，保護(hù)作用最顯著的腹腔注射組與噬菌體PPa24 的體內(nèi)療效相當(dāng)。

本實(shí)驗(yàn)分離獲得的新型噬菌體PPa24 具有較好的生物學(xué)特性，在抗擊銅綠假單胞菌感染方面初步顯示了良好的體內(nèi)外活性，有望成為治療銅綠假單胞菌感染的候選噬菌體。