倪玉佳，戈 煜，陳 穎，董文燊，瞿發(fā)林

1 第904 醫(yī)院常州醫(yī)療區(qū) 藥劑科，常州 213000；2 第904 醫(yī)院無錫 藥劑科，無錫214000

夜寧膠囊（曾用名：養(yǎng)血安神膠囊）為本院非標(biāo)準(zhǔn)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：總JBF513002-2016），是參考《中國(guó)藥典》[1]收載的制劑——夜寧糖漿，按原生產(chǎn)工藝及處方改良而制得。該制劑由首烏藤、浮小麥、靈芝、合歡皮、大棗、甘草、女貞子等7 味中藥組成，主要用于神經(jīng)衰弱以及心血不足所致的失眠、多夢(mèng)、頭暈、乏力的治療。

在夜寧膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[原中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生部下發(fā)，批準(zhǔn)文號(hào)：NFB-（Z158）-2011）]中，僅對(duì)首烏藤作薄層色譜鑒別及其中大黃素作含量測(cè)定[2,3]。且在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，浮小麥、女貞子對(duì)處方中合歡皮的鑒別有干擾，而甘草的薄層鑒別試驗(yàn)重現(xiàn)性不佳。故本研究增加了靈芝的鑒別，改良了首烏藤鑒別方法，同時(shí)選定主藥之一——女貞子中特有成分特女貞苷進(jìn)行含量檢測(cè)[4]，有效提高了該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

電子天平（XS105 型，梅特勒-托利多儀器有限公司）；高效液相色譜儀（waters2487，美國(guó)waters 公司）；pH 計(jì)（S210 型，上海梅特勒托利多儀器有限公司）；暗箱式紫外分析儀（ZF-20D，鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

特女貞苷對(duì)照品（規(guī)格：20 mg，純度：97.3%，批號(hào)：111926-201404），大黃素對(duì)照品（規(guī)格：20 mg，純度：96.0%，批號(hào)：110756-201913），靈芝對(duì)照藥材（規(guī)格：2 g，批號(hào)：120968-201809），首烏藤對(duì)照藥材（規(guī)格：0.25 g，批號(hào)：120939-201507），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

夜寧膠囊（批號(hào)：20190226、20190410、20190522、20190716、20190910、20191106、20200114、20200331、20200811、20201117，規(guī)格：0.4 g），本院制劑室自制。

乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 首烏藤取本品膠囊內(nèi)容物2 g，加入1.5 g硅藻土混勻，加入2.5 mol·L-1硫酸溶液20 mL，水浴回流1 h，放冷后加二氯甲烷30 mL，60 ℃水浴回流1 h，蒸干，加甲醇1 mL 溶解固體物，得供試品溶液。

取對(duì)照藥材首烏藤0.5 g，按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。

取適量大黃素對(duì)照品，加甲醇配制成0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

另按處方量制備缺首烏藤的陰性樣品，同法制成陰性溶液。

吸取以上4 種溶液各4 μL，選擇石油醚（沸程30℃～60℃）-甲酸-乙酸乙酯（15∶2∶5）的上層溶液為展開劑，展開，于同塊硅膠G 薄層板上點(diǎn)樣，熱風(fēng)吹干。供試品（批號(hào)：20191106）與對(duì)照品、對(duì)照藥材的色譜相應(yīng)位置上，紫外光燈（365 nm）下呈現(xiàn)黃色的熒光斑點(diǎn)，自然光下檢視呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)。而方中的其他成分對(duì)首烏藤鑒別無干擾。見圖1。

圖1 紫外燈（A）及自然光（B）下首烏藤薄層色譜鑒別圖

2.1.2 靈芝試驗(yàn)方法參考《中國(guó)藥典》2020 年版一部P195-196“靈芝”藥材鑒別，同法制成供試品溶液、對(duì)照藥材溶液以及陰性溶液。供試品（批號(hào)：20191106）與靈芝對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)位置顯相同熒光斑點(diǎn)（白色圓圈標(biāo)注）。方中的其他成分對(duì)靈芝鑒別無干擾。見圖2。

圖2 靈芝薄層色譜鑒別圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性要求色譜柱：Lichrosphe C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水溶液（18∶82）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

測(cè)定結(jié)果顯示，理論板數(shù)按特女貞苷峰計(jì)不低于4000，且特女貞苷與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。由圖3 可見，陰性樣品在特女貞苷相應(yīng)出峰位置無響應(yīng)，結(jié)果表明專屬性良好。

圖3 HPLC 色譜圖

2.2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液（A）：精密稱取特女貞苷對(duì)照品適量于瓶中，加甲醇超聲處理使其溶解，制成0.1965 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液（B）：取夜寧膠囊內(nèi)容物適量，研勻，精密稱取0.25 g 于錐形瓶中，加入50%乙醇25 mL密塞稱重，超聲處理（220 V，50 Hz，30 ℃）30 min，放冷稱重，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻、離心，取上清液即得。

陰性溶液（C）：按夜寧膠囊處方制備缺女貞子的樣品，按供試品（B）的方法制備即得。

2.2.3 專屬性考察按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別將“2.2.2”項(xiàng)下3 種溶液進(jìn)樣分析。

2.2.4 線性關(guān)系精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下A 溶液1mL，計(jì)5 份，分別稀釋成2、5、10、25、50 mL，混勻。分別吸取上述5 種溶液及對(duì)照品原液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以特女貞苷的進(jìn)樣量（μg）作為橫坐標(biāo)，峰面積（A）作為縱坐標(biāo)，采用線性回歸得出標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.187×103X-5.829×104（n=6），表明特女貞苷在78.6～3 930.9 μg（r=0.999 9）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下A溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定5 次，記錄特女貞苷峰面積，計(jì)算得RSD 值為0.17%（n=5），說明此精密度較好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取夜寧膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：20191106）0.25 g，共5 份，按“2.2.2”項(xiàng)下B 溶液方法制備樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄特女貞苷峰面積，根據(jù)外標(biāo)法，計(jì)算5 份樣品各自所含特女貞苷的含量，由記錄所得的峰面積按外標(biāo)法計(jì)算（增加計(jì)算方法）夜寧膠囊特女貞苷平均含量為4.55 mg·g-1，RSD 值1.03%（n=5），表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取夜寧膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：20191106）0.25 g，按“2.2.2”項(xiàng)下B 溶液方法制備樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于18 h 內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、6、9、12、18 h）進(jìn)樣測(cè)定，記錄特女貞苷峰面積，計(jì)算RSD 值為1.39%（n=6），說明夜寧膠囊溶液在室溫下18 h 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取夜寧膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：20191106）0.125 g，按0.5∶1、1∶1、1.5∶1 的比例，精密加入適量特女貞苷對(duì)照品溶液，平行制備9份樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄特女貞苷峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算樣品平均回收率為100.6%，RSD 為1.71%（n=9）。

2.2.9 樣品含量測(cè)定分別取10 份不同批次的夜寧膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下B 溶液方法制備樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品平行2 份，按外標(biāo)法計(jì)算其平均含量。樣品中特女貞苷含量見表1。

表1 樣品中特女貞苷含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 薄層鑒定方面

原夜寧膠囊標(biāo)準(zhǔn)中，“首烏藤薄層鑒別”項(xiàng)的供試液制備方法較為繁瑣，此次修訂簡(jiǎn)化了若干步驟；此外，以石油醚（沸程：30 ℃～60 ℃）-甲酸-乙酸乙酯（15∶2∶5）的上層溶液作為展開劑代替原實(shí)驗(yàn)試劑，分離效果更佳。

3.2 含量測(cè)定方面

3.2.1 提取步驟的優(yōu)化為優(yōu)化夜寧膠囊中特女貞苷的提取效果，挑選了甲醇及不同濃度的乙醇作為提取劑進(jìn)行了比較研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50%的乙醇提取率最高，且色譜圖中峰型較好。對(duì)超聲提取時(shí)間也進(jìn)行了優(yōu)化（10、20、30、40 min），結(jié)果表明，超聲30 min能提取完全。在此基礎(chǔ)上比較了水浴回流30min與超聲提取的差別，發(fā)現(xiàn)含量略低于超聲提取，可能是因?yàn)樘嘏戃諢岱€(wěn)定性差[5，6]，水浴回流的溫度比超聲提取的溫度要高很多。

3.2.2 含量限度的制定《中國(guó)藥典》針對(duì)原藥材女貞子規(guī)定其特女貞苷含量不得低于0.70%[7]，按照本制劑處方量，在不考慮轉(zhuǎn)移率的前提下，理論含量為0.95 mg·g-1（即0.38 mg/粒），而本院10 批夜寧膠囊含量結(jié)果均遠(yuǎn)高于最低理論限度。考慮到女貞子藥材質(zhì)量會(huì)受到產(chǎn)地、生長(zhǎng)時(shí)間、加工方式等的影響，且制劑生產(chǎn)過程也會(huì)帶來相應(yīng)的誤差，故以該10 批膠囊的含量的最低值向下浮動(dòng)20%，暫定每粒夜寧膠囊含特女貞苷（C31H42O17）不得低于1.45 mg/粒。