林家鋒，陶曉莉，陸恒章，于美玲，李婷婷，李藤菲，程美慧，李永剛

輪狀病毒(Rotavirus, RV)是能夠使人類和動(dòng)物引起一系列消化系統(tǒng)癥狀的常見病毒，可侵及小腸黏膜并且附著定居，給宿主細(xì)胞造成極大的危害[1]。與其他RNA病毒相比，它參與編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)及6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6)，對(duì)病毒的增殖及致病有著重要的生物學(xué)意義[2-4]。RV大多通過糞-口途徑傳播，秋冬季節(jié)活躍，在一般環(huán)境中能穩(wěn)定生存。它在世界范圍內(nèi)廣泛存在，分型眾多，A～C組能夠?qū)е氯祟惡蛣?dòng)物腹瀉，D～G組只能導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉，給當(dāng)?shù)丶倚髽I(yè)及衛(wèi)生健康構(gòu)成極大的威脅[5-6]。一經(jīng)感染，便可誘發(fā)蛋花湯樣便、眩暈、發(fā)熱等具體表現(xiàn)，嚴(yán)重者會(huì)因機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡而脫水、休克死亡[7]。然而，目前尚無治療該病毒公認(rèn)有效的藥品或疫苗，此外該病毒與宿主間的互作機(jī)制和致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

作為一種重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，NSP5具有高度磷酸化的功能，能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)且穩(wěn)定調(diào)控病毒的復(fù)制和感染周期。研究表明，具有多個(gè)骨架蛋白修飾位點(diǎn)的NSP5可與NSP2、VP2以及VP6蛋白共同構(gòu)成病毒質(zhì)體，而病毒質(zhì)體又是病毒復(fù)制的主要場(chǎng)所[8-10]。一些學(xué)者通過小干擾RNA7(MicroRNA-7)靶向下調(diào)NSP5的表達(dá)，從而影響病毒質(zhì)體的形成并抑制RV復(fù)制[11]。由此可見，NSP5在病毒的增殖表達(dá)及生物學(xué)活性中發(fā)揮著重要的作用，但具體機(jī)制還不清楚，本研究利用分子克隆的方法構(gòu)建A組RV-NSP5重組表達(dá)載體來檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并對(duì)原核表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化分析，確定融合蛋白的富集位置，從而進(jìn)一步探究分離株RV NSP5在病毒增殖中所承擔(dān)的作用，同時(shí)為后續(xù)多抗及相關(guān)制劑的制備提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 病毒、細(xì)胞與質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)所用的A組RV病毒株分離自遼寧省錦州市婦嬰醫(yī)院一患兒糞便樣品，293T細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，pGEX-6P-1原核表達(dá)載體和pFLAG-CMV-3真核表達(dá)載體由錦州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 KOD-PLus-Neo PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)買于日本TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶、XhoⅠ酶、XbaⅠ酶、DNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)買于大連TaKaRa公司；TRIzol Reagent LS購(gòu)買于Ambion公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA中提試劑盒都購(gòu)買于美國(guó)Axyprep公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)買于北京天根生化科技有限公司；DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、氨芐西林鈉(Ampicilin，Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)、酵母提取物、胰蛋白胨都購(gòu)買于北京索來寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清都購(gòu)買于Gibco公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)公司；GST瓊脂糖純化樹脂購(gòu)買于上海生工公司；抗FLAG單克隆抗體購(gòu)買于Sigma公司；Mouse Anti-β-actin mAb和Mouse Anti-GST mAb購(gòu)買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG(H+L)和HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)都購(gòu)買于美國(guó)Invitrogen公司等。

1.2 NSP5原核及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)分離所得的病毒株進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并經(jīng)BLAST檢測(cè)特異性、測(cè)序檢測(cè)準(zhǔn)確性。詳見表1。

表1 輪狀病毒NSP5原核及真核表達(dá)引物

1.2.2 提取RV RNA及PCR擴(kuò)增NSP5 從RV病毒分離株提取RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)獲得特異NSP5基因。反應(yīng)體系及成分為：KOD-PLus-Neo酶1 μL，cDNA 1 μL，dNTP 5 μL，MgSO43 μL，10×PCR Buffer 5 μL，上下游引物各1 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至50 μL；條件如下：94 ℃持續(xù)2 min; 98 ℃持續(xù)10 s，58 ℃持續(xù)30 s，68 ℃持續(xù)30 s，共35個(gè)循環(huán);最后 68 ℃ 持續(xù)7 min。電泳后，將NSP5目的條帶切膠并且純化回收，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 NSP5-pGEX-6P-1和NSP5-pFLAG-CMV-3的構(gòu)建和鑒定 對(duì)純化的NSP5片段和空載體雙酶切，酶切反應(yīng)體系分別為pGEX-6P-1或NSP5 2.5 μg，EcoR I 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10×H Buffer 5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL；pFLAG-CMV-3或NSP5 2.5 μg，EcoR I 1 μL，XbaⅠ 1 μL，10×M Buffer 5 μL，0.1% BSA 5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，條件為37 ℃水浴3 h。DNA液體純化再回收，經(jīng)電泳驗(yàn)證和理論大小相符時(shí)，把載體片段以及目的片段按1∶5比例、總體積10 μL進(jìn)行連接，連接酶10 μL，16 ℃反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，第2 d選細(xì)菌培養(yǎng)板上生長(zhǎng)狀況良好的單克隆菌落，進(jìn)行菌落PCR的初步驗(yàn)證。驗(yàn)證陽性者，即可中提質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證。所得質(zhì)粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 NSP5-pFLAG-CMV-3真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及相關(guān)檢測(cè)

1.3.1 293T細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞按照每孔6×105的數(shù)量級(jí)加到6孔板中，培養(yǎng)過夜。等長(zhǎng)到60%～70%的時(shí)候，每個(gè)孔240 μL Opti-MEM稀釋10 μL PEI，輕柔混合切勿振蕩，室溫孵育5 min；然后240 μL Opti-MEM稀釋4 μg NSP5-pFLAG-CMV-3重組質(zhì)粒，用同樣的方法稀釋pFLAG-CMV-3空載體。把上述稀釋液分別緩慢混合，室溫孵育20 min。最后，加入對(duì)應(yīng)孔培養(yǎng)細(xì)胞48 h，用于Western Blot和間接免疫熒光檢測(cè)。

1.3.2 Western blot檢測(cè) NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染后，吸棄上清液體，每個(gè)孔加入250 μL的NP-40，變性、離心、-20 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)過10%SDS-PAGE分離，15V半干轉(zhuǎn)12 min，PVDF膜右上角裁角標(biāo)記，5% 脫脂奶粉封閉2.5 h。然后，用封閉液1∶2 000稀釋鼠抗β-actin抗體、1∶5 000的比例稀釋鼠抗FLAG抗體，浸沒PVDF膜4 ℃過夜。1×PBST洗膜10 min×3次；二抗HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)經(jīng)1∶3 000稀釋后將膜均勻孵育，室溫1 h，洗膜10 min×3次。ECL顯影拍照，檢測(cè)NSP5-pFLAG-CMV-3蛋白在細(xì)胞水平上的表達(dá)。

1.3.3 間接免疫熒光檢測(cè) 取出細(xì)胞培養(yǎng)板置于室溫下，棄掉原有培養(yǎng)液，4%多聚甲醛靜置1 h，500 μL PBS洗滌3次，加200 μL 0.1% Triton X-100靜置15 min，500 μL PBS洗滌3次。1% BSA靜置1 h，PBS洗后，加1∶200比例稀釋的鼠抗FLAG，37 ℃孵箱中靜置1 h。吸掉一抗，500 μL PBS洗滌3次，避光環(huán)境下加入1∶500比例稀釋的羊抗鼠熒光二抗，37 ℃濕盒避光1 h，吸掉二抗，PBS洗滌后，運(yùn)用熒光顯微鏡采圖。

1.4 NSP5-pGEX-6P-1原核表達(dá)和條件優(yōu)化

1.4.1 NSP5-pGEX-6P-1在大腸桿菌中的原核表達(dá) NSP5-pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，置在細(xì)菌培養(yǎng)箱生長(zhǎng)過夜。第二天把重組菌的單菌落接種至150 mL新鮮的LB培養(yǎng)液(1∶1 000的比例加了Amp)，在恒溫?fù)u床培養(yǎng)，直至重組菌菌體OD值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，設(shè)置不同變量對(duì)最適蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行摸索：IPTG濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L)、誘導(dǎo)溫度(28 ℃和37 ℃)以及誘導(dǎo)時(shí)間(2、4、6、8、10、12 h)。

1.4.2 NSP5-pGEX-6P-1可溶性表達(dá)、純化及鑒定 取出保存的最佳誘導(dǎo)條件下菌體蛋白，冰浴超聲破碎：每次工作5 s、間歇10 s，總共超聲99次。然后，離心，保存上清，冰浴條件下用400 μL PBS將沉淀吹打均勻。各吸50 μL上清及沉淀，變性、離心后制成樣品，進(jìn)行后續(xù)SDS-PAGE分析。經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)后，沉淀蛋白用含鹽酸胍的變性緩沖液充分溶解，4 ℃搖晃過夜。次日，不斷用不含鹽酸胍的復(fù)性緩沖液超濾置換，直至液體清透。根據(jù)GST瓊脂糖純化樹脂說明書，控制流速上柱洗脫，并測(cè)定純化所得目的蛋白的濃度。隨后，將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Mouse Anti-GST mAb為一抗、HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)為二抗，分別以1∶2 000和1∶3 000稀釋，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 RV-NSP5基因擴(kuò)增 RV cDNA經(jīng)針對(duì)NSP5的特異引物進(jìn)行體外擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，605 bp左右出現(xiàn)一明亮條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，RV-NSP5基因擴(kuò)增成功。

1為RV-NSP5目的片段

2.2 重組載體的構(gòu)建及鑒定 擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過DNA膠回收純化、酶切、再純化及片段連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取質(zhì)粒后分別使用EcoRI/XhoI和EcoRI/XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，得到的條帶與理論大小相符(圖2、3)。經(jīng)測(cè)序結(jié)果證明，所得序列與NSP5基因序列相一致，表明NSP5-pGEX-6P-1和NSP5-pFLAG-CMV-3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖4、5)。

1為NSP5-pGEX-6P-1質(zhì)粒

1為NSP5-pFLAG-CMV-3質(zhì)粒

圖4 NSP5-pGEX-6P-1的測(cè)序鑒定圖(部分截圖)

圖5 NSP5-pFLAG-CMV-3的測(cè)序鑒定圖(部分截圖)

2.3 Western blot 驗(yàn)證NSP5-pFLAG-CMV-3在細(xì)胞中的表達(dá) NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，分析NSP5在細(xì)胞水平上的表達(dá)情況。由圖所示，NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染后在約25 kD呈現(xiàn)特異條帶，符合理論大小，而pFLAG-CMV-3空載體轉(zhuǎn)染并沒有出現(xiàn)條帶(圖6)。

1為轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-3質(zhì)粒；2為轉(zhuǎn)染NSP5-pFLAG-CMV-3質(zhì)粒

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)NSP5-pFLAG-CMV-3在細(xì)胞內(nèi)分布 NSP5-pFLAG-CMV-3轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞之后在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，IFA結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染NSP5-pFLAG-CMV-3的細(xì)胞能夠觀察到熒光主要匯集在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核并沒有熒光；轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-3空載體沒有呈現(xiàn)出特異性熒光(圖7)。

A為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒NSP5-pFLAG-CMV-3；B為轉(zhuǎn)染空載體pFLAG-CMV-3質(zhì)粒

2.5 NSP5-pGEX-6P-1優(yōu)化表達(dá)、純化及鑒定 經(jīng)誘導(dǎo)條件摸索，確定NSP5-pGEX-6P-1最適誘導(dǎo)條件為37 ℃、8 h、IPTG 0.4 mmol/L，超聲破碎獲得上清液和沉淀懸液，用于電泳及進(jìn)一步的染色分析。結(jié)果表明，在最適蛋白誘導(dǎo)條件下，NSP5-pGEX-6P-1大部分是以包涵體形式富集于沉淀中表達(dá)，而在上清的可溶性表達(dá)微乎其微(圖8A)。包涵體蛋白在變性、復(fù)性之后，經(jīng)GST瓊脂糖樹脂親和層析洗脫，純化所得的蛋白濃度為0.92 mg/mL(圖8B)。經(jīng)Western Blot檢測(cè)，純化的融合蛋白能被抗GST單抗特異性識(shí)別，且在48 kD左右處有一條特異性條帶，符合預(yù)期大小(圖8C)。

A：NSP5-pGEX-6P-1菌體總蛋白裂解后分析：1為裂解后的上清液；2為裂解后的沉淀懸液；B：NSP5-pGEX-6P-1純化蛋白SDS-PAGE分析：1和2為純化所得的重組蛋白；C：NSP5-pGEX-6P-1純化蛋白的Western Blot檢測(cè)：1為純化所得的重組蛋白

3 討 論

輪狀病毒是全球高發(fā)的人獸共患病原體之一，約95%的嬰幼兒在5歲前受過感染，此外也給畜牧業(yè)和世界經(jīng)濟(jì)造成了一定的損失[12]。由于該種病毒包裝機(jī)制復(fù)雜，復(fù)制增殖功能會(huì)大大加強(qiáng)病毒的致病力，給衛(wèi)生防控帶來了很大的難度[13]。至今除了預(yù)防性減毒活疫苗外，尚無有效的藥物及制劑可治療輪狀病毒，故從輪狀病毒的基因成分入手，對(duì)病毒的致病機(jī)制、表達(dá)方式及與宿主間互作機(jī)理進(jìn)行深入研究，從而為腸道類病毒的檢測(cè)和治療提供理論基礎(chǔ)。

NSP5是病毒基因組11片段編碼的蛋白質(zhì)，含有大量絲氨酸、蘇氨酸等多種氨基酸的修飾位點(diǎn)，參與RV翻譯后修飾及加工處理，對(duì)病毒的復(fù)制周期和蛋白表達(dá)調(diào)控有著舉足輕重的作用[14]。基于反向遺傳學(xué)技術(shù)的興起，科學(xué)家嘗試產(chǎn)生NSP5的穩(wěn)定反向互補(bǔ)系統(tǒng)以鑒定NSP5突變對(duì)RV病毒株的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSP5過度磷酸化是裝配圓形病毒質(zhì)體的關(guān)鍵步驟，并且突出了NSP5的C末端尾巴在具有復(fù)制能力的病毒工廠形成過程中的關(guān)鍵作用[15-18]。隨后，Buttafuoco等[19]發(fā)現(xiàn)NSP5高表達(dá)是一個(gè)初始步驟，能夠觸發(fā)與NSP2、VP2結(jié)合形成胞質(zhì)包涵體，可在病毒顆粒蛋白募集過程中起到“橋梁”作用，這便為蛋白互作影響病毒功能提供了有力的依據(jù)。由此表明，NSP5非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制和表達(dá)過程中起到非常重要作用，所以NSP5是如何加快病毒感染宿主并且協(xié)助逃避免疫監(jiān)視將會(huì)是人類未來深入探討的一大課題。

本次研究通過構(gòu)建輪狀病毒NSP5真核及原核表達(dá)系統(tǒng)，一方面通過轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞來研究重組質(zhì)粒在細(xì)胞水平上的表達(dá)情況，為深入探究NSP5的功能與致病機(jī)理提供了新思路；另一方面，基于重組蛋白獨(dú)特的屬性，利用基因工程等方面的技術(shù)，摸索出最優(yōu)化的表達(dá)條件，確定了重組蛋白富集在沉淀中，恰恰也驗(yàn)證了Buttafuoco等研究者的觀點(diǎn)，并且順利純化NSP5蛋白，這為研制多抗提供了一定的前期基礎(chǔ)。

利益沖突：無