張正英 崔乃元 王云平 張漢青 趙維章 馬立才*

1.青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 810001

2.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 100095

牦牛是青海省優(yōu)勢(shì)畜種之一，是十分寶貴的畜種資源，被譽(yù)為“高原之舟”。青海省現(xiàn)存欄牦牛481 萬(wàn)頭，占全國(guó)牦牛總數(shù)的34.6%，能繁母牛240 萬(wàn)頭，年出欄牦牛14.6 萬(wàn)頭，年產(chǎn)牦牛肉13.2 萬(wàn)噸，牦牛市場(chǎng)前景不可估量。在牦牛飼養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程中，四環(huán)素類藥物作為一種廣譜抗生素，是疾病治療的常用藥，主要將其用于細(xì)菌感染性疾病的預(yù)防和早期治療，容易導(dǎo)致四環(huán)素以殘留進(jìn)入人體或生態(tài)系統(tǒng)，給動(dòng)物源性食品帶來(lái)嚴(yán)重的安全問(wèn)題。

目前檢測(cè)動(dòng)物組織中四環(huán)素的方法較多，國(guó)內(nèi)外的殘留檢測(cè)方法主要有LC-Q-TOF 和LC-MS/MS 等方法。色譜法和質(zhì)譜-色譜聯(lián)用法等儀器法的靈敏度和準(zhǔn)確度較高，有些方法的靈敏度能達(dá)到0.1ng/g，一般為確證方法，但儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜和需要專業(yè)技術(shù)人員操作，分析成本高，不適用于基層實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模樣本檢測(cè)。

但是目前為止，還沒(méi)有應(yīng)用時(shí)間分辨免疫層析技術(shù)檢測(cè)青海牦牛中四環(huán)素藥物殘留的報(bào)道。本研究以青海牦牛肉作為研究對(duì)象，采用熒光定量免疫層析檢測(cè)方法，對(duì)牦牛肉中四環(huán)素類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，并用高效液相色譜法對(duì)時(shí)間分辯熒光定量免疫層析檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)對(duì)比分析，以便找到牦牛肉中四環(huán)素殘留量的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品牦牛肉樣品由青海主月畜牧業(yè)有限公司、青海夏華肉食品有限公司、青海裕泰肉食品等公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器立式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀HR/T20MM），電子天平（梅特勒XS204DR），微量移液器（德國(guó)Eppendorf），德國(guó)超純水機(jī)（德國(guó)密尼博純水機(jī)），固相萃取小柱（WatersHLB型，60mg，3mL），pH 計(jì)（上海雷磁ZD-2A 型），檢測(cè)卡恒溫孵育器、時(shí)間分辨熒光免疫定量分析儀（北京維德維康），高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent1100，配PAD 二級(jí)陣列管檢測(cè)器）。

1.3 化學(xué)試劑甲醇、乙腈、磷酸氫二鉀、鹽酸、氫氧化鈉、吐溫20、乙酸乙酯、正己烷；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥96%）美國(guó)Sigma 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 時(shí)間分辨熒光免疫定量分析法

1.4.1.1 樣品前處理 樣品前處理：稱取1.00±0.02g 勻質(zhì)后的樣品于10ml 離心管中，加入2ml 樣品提取液、350ul 體系調(diào)整液，劇烈渦動(dòng)1min，4000g 離心5min，上清備用。

1.4.1.2 樣品測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前，將檢測(cè)卡和金標(biāo)微孔平衡至25℃，吸取200ul 離心上清液于金標(biāo)微孔中，小心吹打至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，室溫（25±2℃）孵育3min，取120ul 金標(biāo)微孔中樣品滴加到加樣區(qū)并開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)10min 后，插入熒光免疫定量分析儀讀數(shù)。

1.4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 根據(jù)維德維康公司提供四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為：0.0μg/kg，5.0μg/kg，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg，80.0μg/kg，160μg/kg，選取儀器測(cè)試四環(huán)素陰性樣本20 份，采用時(shí)間分辨熒光免疫層析方法進(jìn)行測(cè)定，分別得到20 次結(jié)果的均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），其平均值加上10 倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為檢測(cè)限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 兩種檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

1.4.1.4 準(zhǔn)確度與精密度測(cè)試 在牦牛肉樣品中添加濃度為10μg/kg、20μg/kg 和80μg/kg 四環(huán)素藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行添加3 份，用熒光免疫定量分析儀測(cè)試，回收率及變異系數(shù)見表2。

表2 加標(biāo)回收及RSD 值

1.4.2 方法學(xué)比較取30 份牦牛肉樣品，分別采用時(shí)間分辨熒光免疫層析定量分析法和GB/T 21317-2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測(cè)方法》液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

高效液相色譜法配置四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度為0.05、0.1、0.20、0.50、1.0 mg/kg，每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行5 次平行實(shí)驗(yàn)，由儀器用平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到A=12.15c+65.37，相關(guān)系數(shù)為0.991 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 倍信噪比計(jì)算四環(huán)素的檢出限為0.05mg/kg。

時(shí)間分辨熒光免疫層析法，北京維德維康生物技術(shù)有限公司提供標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間（IC20～I(xiàn)C80）為9.65～81.25μg/kg，線性相關(guān)性R2為0.9813，通過(guò)測(cè)試結(jié)果表明，四環(huán)素檢出限為10μg/kg，定量范圍為10～80μg/kg。

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

由表2 可知，高效液相色譜法在牦牛肉樣品中添加20ng/ml，40ng/ml，60ng/ml 3 種濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液后，通過(guò)儀器進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)分析，平均回收率在87～106%之間。

時(shí)間分辨熒光免疫層析法，在空白牦牛肉樣品中添加3 種濃度的四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度為10μg/kg、20μg/kg 和80μg/kg，所有樣品各添加濃度的回收率均在80～120%之間。

2.3 免疫層析方法（定量）與高效液相法測(cè)定結(jié)果比較選取經(jīng)液相色譜法和時(shí)間分辨免疫層析法同時(shí)測(cè)定的10份牦牛肉陰性樣品，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)每5 個(gè)樣品添加同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)梯度，分成2 組添加樣品，采用兩種測(cè)試方法進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 兩種測(cè)試方法結(jié)果比較 單位：mg/kg

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)間分辨免疫層析法和LC-MS/MS 方法進(jìn)行確認(rèn)比較來(lái)檢測(cè)青海牦牛肉中四環(huán)素藥物，由表3 可知，兩種方法對(duì)四環(huán)素藥物檢測(cè)結(jié)果一致性較高。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用時(shí)間分辨熒光免疫層析方法來(lái)檢測(cè)青海牦牛肉中四環(huán)素殘留量，定量限為10μg/kg，添加平均回收率80.0～120.0%之間，平均RSD 值為11～15%，該方法可在30 min 內(nèi)完成樣本的前處理，10min 完成定性定量檢測(cè)，肉眼視覺(jué)直接判斷陰陽(yáng)性（定性），通過(guò)儀器識(shí)別內(nèi)置二維碼直接顯示檢測(cè)四環(huán)素藥物殘留含量，通過(guò)加標(biāo)回收與高效液相色譜法進(jìn)行方法確認(rèn)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性高。

由此說(shuō)明，本研究的牦牛肉中四環(huán)素藥物殘留檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度均較高，可用于牦牛肉中四環(huán)素藥物的實(shí)際檢測(cè)，加之時(shí)間分辨熒光免疫層析方法操作簡(jiǎn)單，容易上手，檢測(cè)成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施要求不高，很容易在基層實(shí)驗(yàn)室中推廣使用，可實(shí)現(xiàn)牦牛養(yǎng)殖過(guò)程中任何環(huán)節(jié)的四環(huán)素藥物殘留檢測(cè)，比如在牦牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)、銷售環(huán)節(jié)均可實(shí)現(xiàn)四環(huán)素殘留檢測(cè)，并建立數(shù)據(jù)庫(kù)，為實(shí)現(xiàn)青海牦牛肉質(zhì)量追溯體系的建設(shè)提供數(shù)據(jù)支撐。