葉文正 王珊珊 李詞娟 吳一文 劉漢忠 方木平

黑素瘤是一種惡性黑素細胞腫瘤,惡性程度高,容易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移,預后極差。在黑色素細胞演變?yōu)楹谏亓黾毎倪^程中,伴隨多個癌基因活化以及抑癌基因的失活,BRAF 基因為其中之一。BRAF 基因是一種癌基因,位于染色體7q34,編碼一個67000-99000的絲/蘇氨酸蛋白激酶。BRAF 基因在黑素細胞特異的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中起著關(guān)鍵作用,它參與黑素刺激素活化細胞表面黑素皮質(zhì)激素-1 受體,進而參與黑素細胞的增殖、分化過程。它將細胞表面的受體和RAS 蛋白通過MEK 和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接,調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育。BRAF 突變后激活MEK-ERK 信號通路導致細胞出現(xiàn)惡性增殖。歐美研究中,白種人BRAF 基因突變?yōu)?0%～60%［1］,中國人群黑色素瘤中,BRAF 基因突變率和歐美國家可能有所差別,本課題組擬通過研究中國漢族人皮膚肢端惡性黑素瘤和非肢端惡性黑素瘤BRAF 基因突變和臨床表型及病理特征的關(guān)系,為中國漢族人皮膚惡性黑素瘤個體化精準靶點治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016～2019 年在孝感市中心醫(yī)院皮膚科連續(xù)確診的79 例中國漢族人惡性黑素瘤患者的石蠟包埋組織,患者中男46 例,女33 例；平均年齡(58.48±13.15)歲。同時選取同期在本院行手術(shù)切除的80 例中國漢族人色素痣患者的石蠟包埋組織,患者中男50 例,女30 例；平均年齡(48.01+15.60)歲。整理并收集惡性黑素瘤患者臨床資料包括性別、年齡、發(fā)病部位、Breslow 厚度、有無潰瘍及臨床分期等。所有病例均由至少1 位皮膚科和1 位病理科副主任及以上醫(yī)師進行診斷,疑難病例則由多位皮膚科醫(yī)師和病理科醫(yī)師共同討論后診斷。全部患者均未做化療、放療及抗免疫等治療。該研究通過本院倫理研究委員會批準,批準號(sk2017001)。

1.2 腫瘤基因組DNA 提取和PCR 擴增目的基因 手動分離石蠟包埋組織中的腫瘤細胞,基因組DNA 提取按照上海生工Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒說明書進行提取。采用巢式聚合酶鏈式反應(PCR)擴增BRAF 基因11 和15 外顯子。設(shè)計巢式PCR 特異性檢測引物,見表1。引物委托上海生工生物技術(shù)服務有限公司合成。BRAF 基因11 外顯子外圍引物為BRAF-11-FO 和BRAF-11-RO,擴增的目的條帶為393 bp,內(nèi)嵌引物為BRAF-11-FI 和BRAF-11-RI,擴增目的條帶為329 bp；BRAF 基因15 外顯子外圍引物為BRAF-15-FO 和BRAF-15-RO,擴增的目的條帶為458 bp,內(nèi)嵌引物為BRAF-15-FI 和BRAF-15-RI,擴增目的條帶為312 bp。PCR 反應條件為初始變性95℃ 5 min,變性94℃ 30 s,退火58℃ 30 s,延伸72℃ 60 s,38 個循環(huán),72℃修復延伸10 min。5 μl PCR 產(chǎn)物用于凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)量和特異性。

表1 BRAF 基因11 和15 外顯子引物

1.3 DNA 測序 20 μl PCR 產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)服務有限公司純化,使用美國ABI 公司生產(chǎn)的3730XL測序儀對PCR 產(chǎn)物進行測序,BRAF 基因11 和15 外顯子均選用內(nèi)側(cè)上游引物測序,應用Chromas 軟件分析測序結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因凝膠電泳鑒定圖

2.1.1 BRAF 基因11 外顯子凝膠電泳圖 7 個泳道從左到右依次為DNA marker(50 bp ladder)、6 個不同樣本BRAF 基因外顯子11 的PCR 產(chǎn)物,其中BRAF 基因外顯子11 的PCR 產(chǎn)物長度為329 bp。見圖1。

圖1 BRAF 基因11 外顯子凝膠電泳圖

2.1.2 BRAF 基因15 外顯子凝膠電泳圖 7 個泳道從左到右依次為DNA marker(50 bp ladder)、6 個不同樣本BRAF 基因外顯子15 的PCR 產(chǎn)物,其中BRAF 基因外顯子15 的PCR 產(chǎn)物長度為312 bp。見圖2。

圖2 BRAF 基因15 外顯子凝膠電泳圖

2.2 測序結(jié)果 37 例肢端惡性黑色瘤患者中有7 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為18.92%；42 例非肢端惡性黑素瘤患者中有17 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為40.48%；80 例色素痣患者中有5 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為6.25%,檢測出的惡性黑素瘤和色素痣BRAF 基因突位于BRAF 基因15 外顯子,且均為V600E(T1799A)突變,11 外顯子未發(fā)現(xiàn)突變。肢端惡性黑色瘤、非肢端惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變率高于色素痣患者,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 三種疾病患者BRAF 基因突變率比較(n,%)

2.3 BRAF 基因突變測序圖 V600E(T1799A)突變的測序圖顯示突變所在位點單峰被雙峰取代。見圖3。

圖3 BRAF 基因突變測序圖

2.4 BRAF 基因突變和惡性黑素瘤臨床特征及病理的關(guān)系 不同年齡、部位、潰瘍情況、Breslow 厚度以及臨床分期惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變情況比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；不同性別惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 79 例惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變和臨床表型及病理的關(guān)系(n)

3 討論

惡性黑素瘤是來源于黑素細胞和痣細胞的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,是臨床上發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一,已經(jīng)成為嚴重危及我國人民健康的疾病［2］。黑素瘤患者晚期患者治療方案有限,中位生存期不足1 年［3］。該病的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚,可能與痣細胞痣惡變、紫外線照射、種族、遺傳、外傷刺激、免疫等多種因素有關(guān),學者對黑色素瘤患者腫瘤細胞的基因突變情況研究顯示黑色素瘤細胞基因突變主要集中在MAPK 途徑,其中BRAF 基因突變在黑色素瘤中的發(fā)生率顯著高于其他相關(guān)通路蛋白編碼基因。BRAF 基因?qū)儆谘杆偌铀倮w維肉瘤(RAF)基因家族成員,位于染色體7q34,長約190 kb,同屬RAF 基因家族的還有ARAF 基因和CRAF 基因。BRAF 基因突變在良性色素痣和發(fā)育不良痣中可以發(fā)現(xiàn)［4］,在正常的情況下,表皮細胞生長因子與其受體進行結(jié)合并導致其活化,然后激活下游的大鼠肉瘤(RAS)蛋白,RAS 蛋白在激活下游的RAF 蛋白,RAF 蛋白激活MEK 蛋白,MEK 蛋白再激活ERK 蛋白,然后ERK蛋白進入細胞和內(nèi)部通過激活下游的各種基因的轉(zhuǎn)錄,讓細胞進行增殖、分化、分裂,其中從RAF 到ERK這一段信號通路叫做MAPK 通路［5］。其參與在調(diào)節(jié)細胞生長、分裂和增殖等方面起著及其重要的作用。BRAF 突變明顯增加了BRAF 激酶活性,激活一系列激酶后,繼而激活RAF/MEK/ERK/MAPK 途徑的信號傳導通路［6］,引起一系列自細胞表面至胞核的連鎖反應,使有絲分裂能力增強,導致細胞異常增殖和分化,從而形成了腫瘤［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)有多種BRAF 基因突變類型,其中最重要的就是BRAF 基因的第600 個氨基酸殘基,從纈氨酸殘基(V)變成谷氨酸殘基(E),也就是V600E 突變［8］,由于RAF 蛋白是MAPK 通路的激活介質(zhì),因此在正常生理條件下RAF 蛋白受到高度調(diào)節(jié)。在沒有細胞外有絲分裂信號的情況下,RAF 主要是細胞質(zhì)的,是多蛋白復合物的一部分,此突變可以讓BRAF 蛋白一直處于活化的、有激酶活性的狀態(tài),通過效應蛋白突變導致的MAPK 信號通路失調(diào)在腫瘤轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用,從而導致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

惡性黑素瘤有種族傾向性,白種人發(fā)病率最高,以頭面部最為多見,少見于肢端,黑種人則相反,發(fā)病率較低,肢端是最主要發(fā)病部位,黃種人的發(fā)病率則介于白種人和黑種人之間,一般認為黃種人發(fā)生于肢端的惡性黑素瘤多見,且多累及足部。作者對37 例肢端惡性黑素瘤和42 例非肢端惡性黑素瘤患者組織DNA 進行測序分析,發(fā)現(xiàn)37 例肢端型患者中有7 例存在BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為18.92%,肢端型黑素瘤患者突變率較低,和土耳其一項研究結(jié)果17.1%突變率比較接近［9］,42 例非肢端型患者中有17 例發(fā)生BRAF 基因15 外顯子的V600E 突變,突變率為40.48%,未檢測出其他突變點和11 外顯子突變,和文獻報道的突變發(fā)生率接近［10］,80 例色素痣患者中檢測到5 例BRAF 基因的突變,表明中國漢族人非肢端惡性黑素瘤BRAF 基因突變率高于肢端惡性黑素瘤患者,但是在正常色素痣患者中也存在少量BRAF基因突變［11］。

BRAF 突變與惡性黑素瘤臨床表型的關(guān)系,報道不一。本研究顯示不同性別惡性黑素瘤患者BRAF 基因突變情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。以50 歲為年齡界限,年輕黑素瘤患者BRAF 基因突變率較年長患者有更高的突變率,可能和患者本身以及相關(guān)的環(huán)境等多種因素相關(guān),和既往研究結(jié)果相符合［12］。在病理特征上,BRAF 基因突變率和Breslow 厚度、潰瘍及臨床分期均有關(guān)。BRAF 基因突變患者,腫瘤浸潤深度更深,因此有更厚的Breslow 厚度,由于腫瘤浸潤的深度相對較深,因此腫瘤組織更加容易出現(xiàn)缺血壞死而導致潰瘍的發(fā)生,同樣,腫瘤較深的Breslow 厚度以及壞死和潰瘍,腫瘤細胞有更多的有絲分裂,其臨床分期也相對更差［13,14］。研究顯示,BRAF V600E 突變和腫瘤厚度增加、出現(xiàn)潰瘍以及患者的生存時間降低有關(guān),在多因素分析中,V600E 突變是一個獨立的預后因素［15］。因此,分析惡性黑素瘤患者臨床和病理特點與BRAF 突變的惡性行為的相關(guān)性,為臨床利用BRAF 突變檢測來預測腫瘤惡性程度,以及患者預后提供更加可靠的理論依據(jù),有BRAF 突變的患者同時也受益于該突變點［16］,針對腫瘤細胞的分子靶向治療以及靶向免疫治療等新型治療方法的出現(xiàn),BRAFV600E 突變的靶向藥物維羅菲尼(vemurafenib)和曲美替尼(trametinib)等相繼研制成功并先后得到美國食品及藥品管理局(FDA)的批準,用于晚期無法切除或轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療,使患者受益較大,這些分子靶向藥物的有效應用以腫瘤細胞的BRAF 基因突變?yōu)榛A(chǔ),為黑素瘤患者帶來一定希望［17］。

綜上所述,本研究初步分析了中國漢族人肢端惡性黑色素瘤和非肢端惡性黑素瘤患者中BRAF 基因的突變情況,顯示中國人黑色素瘤患者中BRAF 突變?nèi)詾楦甙l(fā)突變,非肢端皮膚黑色素瘤中BRAF 基因突變高于肢端皮膚黑素瘤患者的突變。在這些突變中,BRAF 基因的V6OOE 突變是最主要類型,這些初步研究為針對BRAF 基因突變的靶向藥物在中國黑色素瘤患者中的應用提供了依據(jù)。