梁銳煌, 朱南星, 侯 欽, 吳靈飛

梁銳煌, 朱南星, 侯欽, 吳靈飛, 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 廣東省汕頭市 515041

0 引言

近年來(lái), 隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變, 消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì). 消化道作為人類惡性腫瘤的好發(fā)部位之一, 腫瘤發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜, 多條通路參與其中, 其中表觀遺傳學(xué)相關(guān)機(jī)制受到廣泛關(guān)注. 表觀遺傳修飾是指在不改變DNA核苷酸序列的前提下引起基因表達(dá)的可遺傳性改變, 其內(nèi)容不但涉及DNA甲基化、組蛋白修飾, 還包括染色質(zhì)重構(gòu)等. 早期的研究主要集中于DNA和蛋白質(zhì)水平, 隨著基因測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步, RNA 水平的化學(xué)修飾逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). 其中, N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)尤其引人注目. 目前已證實(shí), m6A受多種因子的調(diào)節(jié), 在細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用. 本文就m6A相關(guān)蛋白的功能及其與消化系腫瘤的研究進(jìn)展作一述評(píng).

1 RNA m6A的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)特性

RNA 修飾是一個(gè)新興的領(lǐng)域, 常見的RNA甲基化包括5-甲基胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺苷(m1A)[1,2]和m6A[3]等. 目前, 在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)有163種化學(xué)修飾[4], 分布在各種RNA上, 其中信使RNA(mRNA)的修飾尤其重要, 因?yàn)樗哂袑NA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)的功能. m6A甲基化修飾最早在酵母tRNA中發(fā)現(xiàn), tRNA發(fā)生m6A修飾后有助于維持其三葉草結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 提高翻譯效率[5]. 1974年密歇根州立大學(xué)Desrosiers首次明確m6A甲基化是真核生物mRNA與長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long noncoding RNA,lncRNA)之間最常見的內(nèi)部修飾. m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)為甲基供體, 將腺嘌呤第6位氮原子上的氫甲基化而形成m6A. 這是mRNA轉(zhuǎn)錄后最豐富和保守的轉(zhuǎn)錄后表觀遺傳修飾.據(jù)統(tǒng)計(jì), m6A甲基化大約占mRNA化學(xué)修飾的50%, 在生命起源及生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用[6,7].m6A雖然發(fā)現(xiàn)較早, 但限于當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和條件, 較長(zhǎng)時(shí)間并未取得進(jìn)展. 由于mRNA半衰期較短, 其修飾的作用時(shí)間非常有限而在過(guò)去常被認(rèn)為是靜態(tài)的. 隨著免疫共沉淀等生物技術(shù)的進(jìn)步, m6A甲基化位點(diǎn)被識(shí)別,m6A修飾的作用重新引起了人們的關(guān)注. 2011年, Jia等[8]發(fā)現(xiàn)高度保守的脂肪質(zhì)量與肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)參與了m6A的去甲基化調(diào)控. m6A這一可逆的動(dòng)態(tài)過(guò)程極大拓展了人們對(duì)其生理功能的認(rèn)識(shí). 目前基于anti-m6A抗體的meRIP技術(shù)、miCLIP技術(shù)以及新近報(bào)道的不依賴抗體的MAZTERseq和DART-seq技術(shù)的研究結(jié)果表明, 哺乳動(dòng)物RNA中約0.1%-0.4%的腺苷存在m6A甲基化修飾[6]. 這種修飾并非隨機(jī)分布在成熟轉(zhuǎn)錄本中, 而是在特定的位點(diǎn)如終止密碼子周圍、3?UTR和內(nèi)部長(zhǎng)外顯子內(nèi)富集, 具有一致的motif, 即RRACH序列(R: A/G, H: A/C/U)[7,9,10]. 隨著m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(Writers), 去甲基化酶(Erasers)和甲基識(shí)別蛋白(Readers)的不斷發(fā)現(xiàn), m6A與mRNA之間的關(guān)系被不斷揭示. m6A可逆、動(dòng)態(tài)的修飾不僅參與了mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核、翻譯及降解等生理過(guò)程, 而且與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥密切相關(guān)[11-13]. 下面對(duì)新近取得的進(jìn)展進(jìn)行述評(píng).

2 RNA m6A三類相關(guān)蛋白及其功能

2.1 m6A“Writers” 第一類蛋白質(zhì)是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶.它們編碼的基因被稱為m6A“writers”. Knuckles等[14]在小鼠胚胎干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3, 通過(guò)TAP-LC-MS技術(shù)篩選鑒定與METTL3相互作用的蛋白. 將在高鹽條件下洗脫獲得的復(fù)合物命名為m6A-METTL復(fù)合物(m6A methyltransferase complex, MAC). 將在低鹽條件下洗脫獲得的復(fù)合物命名為m6A-METTL相關(guān)蛋白復(fù)合物(m6A methyltransferase associated complex, MACOM). 其中, MAC主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3 (methyltransferaselike 3, METTL3)和METTL14蛋白, 兩者以1:1比例形成穩(wěn)定的復(fù)合物并共定位于細(xì)胞核內(nèi)[15]. METTL3作為主要的甲基化催化中心, 催化m6A合成, 它與METTL14、Wilm’s腫瘤1相關(guān)蛋白(Wilm’s tumor 1-associating protein,WATP)形成復(fù)合物. METTL14本身并無(wú)催化活性[16], 但可提高M(jìn)ETTL3催化酶的活性[17]. WTAP對(duì)甲基化修飾亦無(wú)直接催化作用, 它通過(guò)招募METTL3-METTL14二聚體定位于核散斑中, 參與RNA的選擇性剪切并保持MAC酶活性. MACOM主要是由接頭蛋白WTAP、VIRMA/KIAA1429、RBM15、Zc3h13和CBLL1/HAKAI相互結(jié)合而形成復(fù)合物, 與MAC共同參與m6A甲基化修飾.WTAP作為接頭蛋白招募MAC定位到核散斑中[18]. 接頭蛋白KIAA1429、RBM15、HAKAI、Zc3h13等能夠與WTAP結(jié)合, 決定MAC的正確定位[19,20]. 此外, METTL16被鑒定為單獨(dú)存在的具有催化活性的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶[21].它與METTL3同源, 可結(jié)合U6 snRNA, 導(dǎo)致U6第43位腺嘌呤m6A甲基化, 影響U6 剪切因子對(duì)mRNA前體的剪接[21]. Pendleton等[22]證實(shí)METTL16通過(guò)誘導(dǎo)甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A (MAT2A)合成參與snRNA甲基化調(diào)控.MAT2A編碼大部分細(xì)胞的SAM, 我們既往的研究表明,SAM與腺苷的代謝過(guò)程密切相關(guān)[23]. 細(xì)胞內(nèi)甲硫氨酸水平下降可導(dǎo)致MAT2A表達(dá)增加. METTL16通過(guò)調(diào)控MAT2A mRNA腺苷的甲基化水平而影響MAT2A生成,進(jìn)而調(diào)控snRNA的活性及其生物學(xué)功能.

2.2 m6A“Erasers” 第二類蛋白質(zhì)是m6A去甲基化酶,其編碼基因稱為m6A“Erasers”, 它的功能是將RNA分子中已進(jìn)行m6A修飾的甲基去除. 目前已證實(shí)參與m6A去甲基化修飾過(guò)程的有FTO和AlkB同源蛋白5 (AlkB homolog 5, ALKBH5). FTO定位于核散斑及細(xì)胞質(zhì), 對(duì)RNA上的m6A具有較強(qiáng)的去甲基活性. FTO與核斑點(diǎn)的部分共域化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mRNA中的m6A是FTO的作用底物[8]. Su等[24]分析了FTO催化m6A和N6, 2’-O-二甲基腺苷(m6Am)修飾的親和力, 結(jié)果證實(shí)FTO與其底物的結(jié)合與FTO蛋白的定位有關(guān). 在細(xì)胞核中FTO只催化m6A去甲基化, 而在細(xì)胞質(zhì)中FTO既可以介導(dǎo)m6A又可以催化m6Am的去甲基化. 有趣的是, Mauer等[25]研究表明FTO對(duì)m6Am的去甲基化酶活性大約是m6A的100倍, 顯示FTO的作用底物更可能是m6Am, 這與Jia等人的研究結(jié)果有所不同[8]. 目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為, FTO在細(xì)胞核中對(duì)m6A親和力較高, 而在細(xì)胞質(zhì)中對(duì)m6Am親和力更強(qiáng)[26,27].ALKBH5主要定位在核散斑, 影響mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[28].FTO與ALKBH5對(duì)m6A修飾的去甲基化作用是相互獨(dú)立的. ALKBH5可直接將m6A氧化為普通的腺苷, 而FTO則是分級(jí)代謝, 依次將m6A氧化為N6-羥甲基腺苷(hm6A)和N6-甲酰腺苷(f6A), 最后水解為腺嘌呤. 此外, 二者對(duì)底物的選擇性和序列的親和力也存在差別, 即m6A的“Erasers”可能因底物的“構(gòu)象標(biāo)記”不同而作用相異. 如FTO在小鼠大腦中表達(dá)水平高, 而ALKBH5在小鼠睪丸中表達(dá)較高. 這種在不同組織間的表達(dá)差異及其對(duì)底物的選擇性差別顯示了去甲基化酶生理作用的復(fù)雜性.

2.3 m6A“Readers” 第三類與m6A甲基化位點(diǎn)結(jié)合并讀取其信息的蛋白質(zhì)被稱為m6A“Readers”, 即m6A識(shí)別蛋白.它們能夠選擇性識(shí)別靶RNA上的m6A并參與RNA的多種代謝過(guò)程. Readers包括YTHs家族蛋白、HNRNPs超家族蛋白和IGFBPs家族蛋白三組成員. 人具有5個(gè)含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白: 如定位于細(xì)胞質(zhì)中的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2和定位于細(xì)胞核的YTHDC1. YTHDF蛋白雖然結(jié)構(gòu)相似, 但功能不完全相同. YTHDF2在細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)mRNA的降解[29-31].YTHDF1結(jié)合m6A后促進(jìn)mRNA的翻譯[32]. YTHDF2和YTHDF1的不同功能可能在維持mRNA降解和翻譯的平衡中發(fā)揮重要作用. YTHDF3與YTHDF1協(xié)同促進(jìn)蛋白合成, 并通過(guò)YTHDF2介導(dǎo)mRNA降解[33]. YTHDC1促進(jìn)外顯子的剪切以及控制其靶標(biāo)的出核過(guò)程[34].YTHDC2能夠與RNA解旋酶相互作用, 調(diào)節(jié)mRNA翻譯延伸[35]. 總之, YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2可以促進(jìn)mRNA降解; YTHDF1、YTHDF3、YTHDC2可以促進(jìn)靶mRNA的翻譯; YTHDC1則影響mRNA的剪接及其核輸出過(guò)程. HNRNPs超家族蛋白包括三個(gè)成員:HNRNPA2B1、HNRNPC和HNRNPG. 這3個(gè)蛋白均在核內(nèi)發(fā)揮作用. 其中HNRNPC和HNRNPG影響mRNA定位和可變剪切[36]. HNRNPA2B1促進(jìn)miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的剪接加工[37]. IGF2BPs包括IGF2BP1-3. 這類蛋白通過(guò)常見的RNA結(jié)合域識(shí)別具有m6A的RNA. IGF2BPs識(shí)別結(jié)合m6A修飾位點(diǎn)后, 增加mRNA的穩(wěn)定性, 避免其降解并促進(jìn)其翻譯[38]. 此外, 真核起始因子eIF3能夠直接和mRNA 5?UTR的m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合, 招募43S核糖體復(fù)合物并促進(jìn)蛋白翻譯[39]. 有趣的是, 細(xì)胞質(zhì)中METTL3也可作為識(shí)別蛋白并促進(jìn)某些特定類型細(xì)胞mRNA翻譯[40].總之, m6A甲基化是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程,MAC、MACOM及METTL16均能催化m6A形成, 而FTO和ALKBH5可使其去甲基化. 已甲基化的RNA被相應(yīng)的Readers識(shí)別后才進(jìn)入下一步代謝過(guò)程以保證其有效發(fā)揮生物學(xué)功能, 包括維持RNA穩(wěn)定、促進(jìn)mRNA翻譯、或加速其剪切和降解等. 具體見圖1.

圖1 m6A RNA甲基化的基本機(jī)制. m6A RNA甲基化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程. 此過(guò)程由甲基轉(zhuǎn)移酶“Writers”、去甲基化酶“Erasers”和甲基化識(shí)別蛋白“Readers”共同參與. “Writers” 由METTL3、METTL14、WTAP及KIAA1429、Zc3h13、RBM15、HAKAI和METTL16組成; “Erasers” 包括FTO和ALKBH5; “Readers”由YTHDC1-2、YTHDF1-3、HNRNPs和IGF2BP1-3組成. 其中甲基轉(zhuǎn)移酶的作用是催化mRNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾. 去甲基化酶是對(duì)已發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾. 識(shí)別蛋白的作用則是通過(guò)識(shí)別發(fā)生了m6A修飾的堿基而參與RNA的剪接、加工、翻譯和降解等過(guò)程.

3 m6A甲基化在不同消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展

m6A既是mRNA加工和代謝的重要分子標(biāo)志, 又在細(xì)胞分化進(jìn)程中具有改變細(xì)胞狀態(tài)的功能[41], 如與細(xì)胞異型增生有關(guān)的mRNA可變剪切常受m6A調(diào)控[42], 表明m6A與腫瘤發(fā)生有關(guān). 研究證實(shí)m6A相關(guān)的蛋白在乳腺癌[43]、肺癌[40]、急性髓細(xì)胞白血病[44]、宮頸癌[45]存在過(guò)表達(dá)或者低表達(dá), 并通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)相應(yīng)腫瘤進(jìn)展. 下面總結(jié)m6A在消化系腫瘤中的作用.

3.1 食管鱗狀細(xì)胞癌 Wu等[46]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)香煙煙霧冷凝物染毒后, 食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中ALKBH5表達(dá)升高. ALKBH5高表達(dá)介導(dǎo)LINC00278的去甲基化, 抑制LINC00278-sORF1翻譯YY1BM. 而YY1BM可阻斷YY1與雄激素受體(AR)相互作用, YY1BM表達(dá)降低可促進(jìn)AR信號(hào)通路介導(dǎo)的eEF2K上調(diào), 使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境而減少凋亡.這項(xiàng)研究從m6A去甲基化角度探索了吸煙促進(jìn)ESCC進(jìn)展的分子機(jī)制. Liu等[47]研究發(fā)現(xiàn)FTO在ESCC組織中的表達(dá)亦高于鄰近的正常組織, 并且與患者不良預(yù)后有關(guān). FTO高表達(dá)正向調(diào)控癌基因MMP13, MMP13上調(diào)促進(jìn)了ESCC轉(zhuǎn)移. Yang等[48]研究證實(shí)與癌旁正常組織相比, ESCC組織中YTHDC2的表達(dá)下調(diào), 低表達(dá)YTHDC2有助于ESCC擴(kuò)散, 表明m6A去甲基化酶及個(gè)別識(shí)別蛋白參與了ESCC的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程, 但仍缺乏全面挖掘.m6A甲基化酶是否參與食管癌的發(fā)病尚不清楚.

3.2 胃癌 Ge等[49]收集100例胃癌(gastric carcinoma, GC)患者、30例良性胃病患者和75例健康對(duì)照的外周血液,通過(guò)比色法檢查發(fā)現(xiàn)GC組患者外周血RNA中m6A水平明顯高于胃病和健康對(duì)照組. 隨著GC的進(jìn)展m6A水平升高, 手術(shù)后則下降. 受試者工作特性(receiver operating characteristic, ROC)曲線評(píng)估顯示, GC組m6A的曲線下面積明顯大于癌胚抗原(CEA)和糖類抗原199(CA19-9)的面積, 表明外周血總RNA的m6A檢測(cè)對(duì)GC診斷及預(yù)后有一定參考價(jià)值, 其作用優(yōu)于常規(guī)的癌胚抗原, 顯示出m6A作為GC診斷標(biāo)記物有較好的臨床應(yīng)用前景, 但其特異性和敏感性仍需擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)行臨床大樣本、多中心驗(yàn)證.

Yue等[50]發(fā)現(xiàn)METTL3在GC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),METTL3表達(dá)水平升高提示預(yù)后不良. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), ZMYM1是METTL3的m6A修飾靶標(biāo). METTL3通過(guò)對(duì)ZMYM1進(jìn)行m6A修飾而增強(qiáng)ZMYM1 mRNA的穩(wěn)定性. 另外, ZMYM1通過(guò)形成CtBP/LSD1/CoREST復(fù)合物與上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)基因啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其表達(dá), 從而促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移. Liu等[51]同樣發(fā)現(xiàn)METTL3在GC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào), 其表達(dá)水平隨著腫瘤分期和分級(jí)的進(jìn)展而逐漸升高. 敲低METTL3顯著抑制了GC細(xì)胞的總體RNA的m6A水平, 也顯著降低了與GFI-1和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá), 從而抑制GC細(xì)胞的遷移.

METTL14與METTL3雖同屬于m6A“Writers”, 但Zhang等[52]研究發(fā)現(xiàn)敲降METTL14激活了Wnt和PI3KAkt信號(hào)傳導(dǎo)通路, 促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖和侵襲, 反而顯示出METTL14的抑癌作用. METTL3與METTL14在GCm6A甲基化過(guò)程中的不同結(jié)果顯示出“Writers” 調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性. Xu等[53]證實(shí)與癌旁非腫瘤組織相比,GC組織中FTO在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)均上調(diào).FTO表達(dá)水平與細(xì)胞低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者的不良預(yù)后密切相關(guān). 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), FTO的表達(dá)與GC的TNM分期正相關(guān), FTO表達(dá)下調(diào)可顯著抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲. 然而, Li等[54]發(fā)現(xiàn), FTO蛋白在印戒細(xì)胞癌和GC組織中表達(dá)水平顯著下調(diào). FTO在GC中的作用有待進(jìn)一步研究.

3.3 結(jié)直腸癌 Wu等[55]發(fā)現(xiàn)lncRNA RP11 (RP11-138 J23.1)在結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)組織中高表達(dá), 其表達(dá)水平隨著CRC分期的上升而增加. RP11有正向調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞的遷移、EMT、促進(jìn)CRC細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的功能.作者發(fā)現(xiàn)在HCT-15和HCT-8細(xì)胞中, 過(guò)表達(dá)的METTL3可提高RP11表達(dá)水平, 增加RP11和hnRNPA2B1之間的結(jié)合, 促進(jìn)RP11/hnRNPA2B1/mRNA復(fù)合物的形成. Zeb1作為EMT轉(zhuǎn)錄因子之一, 其上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞遷移. 研究發(fā)現(xiàn), 兩種泛素E3連接酶(Siah1和Fbxo45)通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑誘導(dǎo)Zeb1降解, 而RP11/hnRNPA2B1/mRNA復(fù)合物可促進(jìn)Siah1和Fbxo45的降解, 使Zeb1水平增高, 從而有助于CRC細(xì)胞EMT及遷移, 表明METTL3具有促癌作用. Peng等[56]發(fā)現(xiàn)METTL3在CRC細(xì)胞表達(dá)上調(diào), 其高表達(dá)與CRC轉(zhuǎn)移呈正相關(guān). METTL3通過(guò)甲基化primiR-1246使其成熟為miR-1246. miR-1246可抑制抑癌基因SPRED2的表達(dá), 降低其在Raf/MEK/ERK通路中發(fā)揮的抑癌作用, 從而促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移、侵襲, 并誘導(dǎo)EMT.

多項(xiàng)研究證實(shí), METTL3通過(guò)穩(wěn)定mRNA的方式, 促進(jìn)CRC進(jìn)展. Li等[57]通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù), 發(fā)現(xiàn)METTL3在多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)水平增加. 高表達(dá)METTL3的CRC患者總生存期和無(wú)病生存期縮短. 他們發(fā)現(xiàn)Y染色體性別決定區(qū)-box 2 (SOX2)是METTL3的下游基因, METTL3通過(guò)維持SOX2在CRC中的表達(dá)以促進(jìn)CRC細(xì)胞的干性. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), METTL3提高了SOX2轉(zhuǎn)錄本的甲基化水平, 阻止其被降解[58,59]. Zhang等[60]通過(guò)qRT-PCR和IHC發(fā)現(xiàn)在化療耐藥的結(jié)腸癌組織中CBX8明顯過(guò)表達(dá). CBX8將KMT2b招募到LGR5啟動(dòng)子上, 使其維持H3K4me3狀態(tài)以促進(jìn)LGR5的表達(dá), 增加腫瘤細(xì)胞的干性, 并降低其化療敏感性. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), METTL3的甲基化修飾和IGF2BP1的結(jié)合有助于維持CBX8 mRNA的穩(wěn)定性. 另外, Zhu等[61]發(fā)現(xiàn)METTL3以m6A依賴的方式穩(wěn)定CCNE1的mRNA, 從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖. 與上述研究結(jié)果不同的是, Deng等[62]發(fā)現(xiàn)METTL3的下調(diào)導(dǎo)致p-p38和p-ERK的激活, 促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲. Chen等[63]發(fā)現(xiàn)同樣作為“Writer”的METTL14在CRC組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào), 并與患者總生存期密切相關(guān). METTL14基因的敲低顯著降低總RNA中的m6A水平, 促進(jìn)CRC細(xì)胞生長(zhǎng). 相反, METTL14過(guò)表達(dá)則增加總RNA中m6A水平, 抑制CRC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移. 上述研究表明, 在CRC中METTL14發(fā)揮抑癌作用, 這與GC的結(jié)果相一致[52].

Wang等[64]研究證實(shí)與IGF2BP2穩(wěn)定性有關(guān)的lincRNA LINRIS在CRC組織中上調(diào). LINRIS通過(guò)自噬-溶酶體途徑阻斷IGF2BP2的K139泛素化, 抑制IGF2BP2降解, 促進(jìn)IGF2BP2的下游效應(yīng), 尤其是MYC介導(dǎo)的糖酵解過(guò)程, 使CRC耐藥性增強(qiáng)[65]. YTHDF已被多項(xiàng)研究證明與CRC的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān). Bai等[66]證實(shí)YTHDF1在CRC中高表達(dá), 且與腫瘤TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤組織學(xué)分型有關(guān). 研究表明, 癌基因c-Myc可與YTHDF1的5?UTR結(jié)合, 促進(jìn)YTHDF1的表達(dá). 而敲除YTHDF1則可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路, 表明YTHDF1通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[67]. Ni等[68]報(bào)道,lncRNA GAS5促進(jìn)內(nèi)源性YAP從細(xì)胞核到胞漿的移位和磷酸化而加速YAP降解, 進(jìn)而在體內(nèi)外抑制CRC進(jìn)展,而YTHDF3通過(guò)促進(jìn)lncRNA GAS5降解而阻遏YAP降解, 促進(jìn)CRC的增殖及轉(zhuǎn)移. 上述研究表明“Readers”在CRC中發(fā)揮促癌作用. 然而, 是否存在起抑癌作用的m6A識(shí)別蛋白以及METTL3在CRC中究竟扮演何種角色尚有待進(jìn)一步研究.

3.4 肝癌 Chen等[69]發(fā)現(xiàn), METTL3在肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中表達(dá)上調(diào), 降低了SOCS2 mRNA穩(wěn)定性, 從而下調(diào)抑癌基因SOCS2的表達(dá), 促進(jìn)HHC病變進(jìn)展并縮短患者的生存期. Zuo等[70]報(bào)道METTL3表達(dá)上調(diào)可通過(guò)METTL3 -LINC00958-HDGF軸促進(jìn)HCC的發(fā)展.Cui等[71]發(fā)現(xiàn), 在肝母細(xì)胞瘤組織中METTL3與miR186的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān), METTL3表達(dá)上調(diào)通過(guò)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤進(jìn)展. Ma等[72]證明METTL14可通過(guò)與抑癌因子pri-miR-126 DGCR8結(jié)合, 抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移, METTL14低表達(dá)則增強(qiáng)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力. Chen等[73]發(fā)現(xiàn)WTAP在HCC中高表達(dá), 通過(guò)Hur-EtS1 -P21/P27通路促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展. Lan等[74]證實(shí)KIAA1429在HCC組織中表達(dá)上調(diào). GATA3是KIAA1429介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶點(diǎn). KIAA1429在HCC中高表達(dá)促進(jìn)了GATA3 pre-mRNA的3?UTR發(fā)生m6A修飾, 導(dǎo)致RNA結(jié)合蛋白HuR的分離和GATA3 pre-mRNA的降解,從而加速腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移. 此外, KIAA1429通過(guò)上調(diào)ID2 mRNA上m6A修飾而抑制ID2的表達(dá), 促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲[75].

Zhao等[76]報(bào)道, YTHDF1在HCC患者中表達(dá)明顯上調(diào)并與病理分期呈正相關(guān). 作者通過(guò)對(duì)YTHDF1共表達(dá)基因的GO和KEGG通路分析, 發(fā)現(xiàn)YTHDF1在調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞周期和代謝方面起著重要作用. 有趣的是, Zhou等[77]發(fā)現(xiàn), METTL3與YTHDF1共過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后差. KEGG分析表明, 兩者介導(dǎo)HCC不良預(yù)后的機(jī)制與DNA復(fù)制、RNA的剪切和降解有關(guān), METTL3和YTHDF1聯(lián)合檢測(cè)具有判斷HCC惡性程度和評(píng)估預(yù)后的價(jià)值.

Yang等[78]發(fā)現(xiàn)YTHDF2在HCC中表達(dá)上調(diào), 并受到miR145負(fù)性調(diào)節(jié). Zhang等[79]的研究表明, 敲除YTHDF2后, Hep3B和Huh7兩種HCC細(xì)胞株的干細(xì)胞特性受損,而YTHDF2過(guò)表達(dá)會(huì)增加腫瘤干細(xì)胞(CSC)的表型. 在HCC中YTHDF2過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)控OCT4 mRNA的m6A甲基化使OCT4表達(dá)上調(diào), 促進(jìn)CSC生長(zhǎng), 維持CSC表型, 從而促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移. 與上述結(jié)果相反, Hou等[80]發(fā)現(xiàn)在YTHDF2缺陷的HCC中, STAT3的磷酸化以及IL-11和SERPINE2的表達(dá)上調(diào), 而缺氧可以增強(qiáng)這種作用. 缺氧條件下誘導(dǎo)的YTHDF2下調(diào)加劇了HCC組織中的炎癥反應(yīng), 促進(jìn)了HCC組織中的細(xì)胞增殖及血管異?；? 促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和病灶轉(zhuǎn)移, 表明YTHDF2發(fā)揮了抑癌作用. 有趣的是, Zhong等[81]的研究表明同樣在缺氧環(huán)境下, 下調(diào)YTHDF2誘導(dǎo)ERK磷酸化, 激活ERK/MAPK通路, 從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖. YTHDF2在HCC組織中直接結(jié)合EGFR 3’UTR的m6A修飾位點(diǎn), 促進(jìn)EGFR mRNA的降解, 進(jìn)而抑制ERK/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用. 多項(xiàng)研究表明IGF2BPs 與HCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力和集落形成能力呈正相關(guān)[82,83], 但一些相互矛盾的結(jié)果顯示m6A相關(guān)蛋白在HCC中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.

Li等[84]發(fā)現(xiàn)低m6A水平的HCC中FTO表達(dá)明顯升高. 丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2, PKM2)在腫瘤細(xì)胞供能、EMT及侵襲轉(zhuǎn)移方面有重要作用, 是FTO的靶蛋白之一. 敲除FTO后, HCC組織增殖與克隆能力減弱, 同時(shí)可減少PKM2 mRNA表達(dá)及其蛋白生成, 而過(guò)表達(dá)PKM2可逆轉(zhuǎn)敲除FTO的表型改變, 表明FTO誘導(dǎo)的PKM2 mRNA的去甲基化具有促癌作用. 有趣的是, Rong[85]等發(fā)現(xiàn)FTO在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào), 且FTO的表達(dá)與CA19-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),Kaplan-Meier生存分析顯示, FTO低表達(dá)預(yù)示ICC預(yù)后不良, 這表明FTO可能有抑制ICC進(jìn)程的作用. 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FTO還可抑制ICC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移. 另外, 裸鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)FTO抑制了ICC腫瘤的生長(zhǎng). 這可能與FTO提高了TEAD2mRNA的穩(wěn)定性有關(guān). 結(jié)合上述研究結(jié)果,METTL14在GC、CRC、HCC三種腫瘤中均起抑癌作用[52,63,72], 而METTL3主要發(fā)揮促癌作用[50,57,69]. FTO在多種腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá), 但其作用及機(jī)制均有待進(jìn)一步明確.

3.5 胰腺癌 Xia等[86]發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比, 胰腺癌(pancreatic carcinoma, PC)組織中METTL3和mRNA水平顯著升高, 敲除METTL3后, RNA m6A修飾減少, 抑制了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移, 表明METTL3具有促癌作用. 此外, Taketo等[87]發(fā)現(xiàn)m6A修飾與PC化療藥物的敏感度有關(guān), METTL3缺失的細(xì)胞對(duì)抗癌藥如吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和輻射顯示出更高的敏感性. 進(jìn)一步研究表明, 包括MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、泛素化過(guò)程、RNA剪接等多條關(guān)鍵途徑可能均是METTL3的作用靶點(diǎn). 這些信號(hào)通路的改變直接導(dǎo)致了腫瘤進(jìn)展和化療耐藥, 表明METTL3參與了PC放療及化療耐藥的調(diào)控. 此外, 他們還發(fā)現(xiàn)METTL3的下調(diào)加速了PC細(xì)胞凋亡. m6A還可以通過(guò)影響miRNA或lncRNA調(diào)節(jié)PC的發(fā)生. Zhang等[88]發(fā)現(xiàn)胰管上皮細(xì)胞中, 香煙煙霧冷凝物促使有致癌作用的miR-25成熟依賴于METTL3過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的m6A甲基化.METTL3在PC中的促癌作用, 與其在GC、CRC及HCC中所起的作用一致[50,57,69].

Tang等[89]發(fā)現(xiàn)ALKBH5在基于吉西他濱治療患者的異種移植瘤模型中下調(diào), 其過(guò)表達(dá)增加PC對(duì)化療的敏感性. 在體外和體內(nèi), 沉默ALKBH5顯著增加PC增殖、遷移和侵襲, 而過(guò)表達(dá)ALKBH5導(dǎo)致完全相反的效果. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過(guò)降低Wnt抑制因子1的m6A水平及阻礙Wnt信號(hào)通路來(lái)抑制PC的發(fā)生. He等[90]的研究發(fā)現(xiàn), ALKBH5過(guò)表達(dá)后, KCNK15-AS表達(dá)隨之增加, 而PC細(xì)胞的EMT受到了抑制, 提示KCNK 15-AS1對(duì)PC細(xì)胞遷移和侵襲具有抑制作用, 也間接證實(shí)ALKBH5可抑制EMT進(jìn)程. Cho等[91]證實(shí)ALKBH5是PC患者的獨(dú)立預(yù)后因素. ALKBH5表達(dá)與患者預(yù)后顯著正相關(guān). Chen等[92]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比, PC組織中YTHDF2的表達(dá)在基因和蛋白質(zhì)水平上均上調(diào). 高表達(dá)的YTHDF2在PC組織中顯示出雙重作用: 一方面促進(jìn)癌細(xì)胞增殖; 另一方面YTHDF2通過(guò)YAP信號(hào)調(diào)控EMT,抑制PC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲. 此外, Tang[93]等研究亦表明,FTO在PC中高表達(dá). 敲除FTO后可抑制腫瘤的形成和進(jìn)展, 增加PC細(xì)胞凋亡, 表明FTO具有促癌作用.

RNA m6A甲基化修飾相關(guān)蛋白在消化系統(tǒng)食管、胃、肝臟、胰腺及結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)病中的作用如圖2所示.

圖2 消化系惡性腫瘤中常見m6A修飾相關(guān)蛋白的作用. 黑色表示該蛋白發(fā)揮癌基因的作用. 藍(lán)色表示該蛋白發(fā)揮抑癌基因的作用. 紅色表示該蛋白在該部位腫瘤發(fā)病中的作用仍有爭(zhēng)論. 目前比較明確的是去甲基化酶FTO在食管癌、胰腺癌中是促癌基因; 甲基化識(shí)別蛋白YTHDF1在肝癌及結(jié)腸癌中亦是促癌基因; 甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在胃癌、肝癌及胰腺癌中多發(fā)揮促癌作用; 而METTL14在胃癌、肝癌及結(jié)直腸癌中具有抑癌效應(yīng).

4 小結(jié)與展望

m6A甲基化修飾的發(fā)現(xiàn)豐富了表觀遺傳學(xué)的內(nèi)容. m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和識(shí)別蛋白各司其職, 共同調(diào)節(jié)靶基因上的m6A含量, 進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生. 以m6A修飾為核心的靶向治療已經(jīng)成為臨床研究的新熱點(diǎn). 其中包括: FTO抑制劑、METTL3-14/WTAP激活劑及其聯(lián)合用藥. 目前m6A相關(guān)蛋白抑制劑或激活劑存在活性低、特異性差、在細(xì)胞內(nèi)確切作用機(jī)制不清等問(wèn)題,其開發(fā)尚處于起步階段. 許多問(wèn)題仍未解決: (1)未知的m6A修飾相關(guān)蛋白有待進(jìn)一步鑒定; (2)新的m6A修飾機(jī)制有待進(jìn)一步闡明; (3)鑒于甲基化酶和去甲基化酶在m6A修飾中起相反的作用, 如果去甲基化酶在某種癌癥中發(fā)揮癌基因的作用, 是否甲基轉(zhuǎn)移酶一定扮演抑癌基因的角色? (4)有些m6A修飾蛋白具有雙重身份, 既可促癌又能抑癌, 這種“雙刃刀”作用的觸發(fā)機(jī)制又是什么? (5)“Readers”是如何選擇識(shí)別并結(jié)合靶RNA? 不同“Reader”之間是相互競(jìng)爭(zhēng)還是具有協(xié)同作用? 哪些m6A甲基化蛋白具有早癌篩查和/或腫瘤預(yù)后判斷的臨床價(jià)值? 相信隨著m6A甲基化研究的不斷深入, 終將揭開這些謎團(tuán), 最終為腫瘤患者帶來(lái)福音.